МОДУЛЯТОР АКТИВНОСТИ Российский патент 2022 года по МПК A61K39/395 A61P9/00 A61P11/00 A61P25/00 A61P43/00 A61P13/12 A61P27/02 C07K16/28 C12N5/786 

Область техники

[0001]

Настоящее изобретение относится к модулятору активности, содержащему CD300a-связывающее вещество, и к лекарственному средству против ишемических заболеваний.

Уровень техники

[0002]

Многие люди в Японии страдают ишемическими заболеваниями на фоне старения, европеизации образа жизни и тому подобного, которые являются основными причинами смерти и являются бременем для медицинской экономики. Ишемическая болезнь представляет собой заболевание, вызванное дефицитом кислорода/питательных веществ из-за быстрого снижения кровотока, вызванного временной или постоянной окклюзией или стенозом кровеносных сосудов в органе, таком как сердце или мозг, и примеры типичных ишемических заболеваний включают инфаркт миокарда и церебральный инфаркт.

[0003]

Апоптоз является одним из механизмов клеточной смерти, связанной с поддержанием гомеостаза в живом организме, и как известно, он запускается в клетках, подвергшихся воздействию ухудшенной окружающей среды in vivo, например, с дефицитом кислорода/питательных веществ, вызванных ишемической болезнью. Клетки, в которых был индуцирован апоптоз, фагоцитируются путем распознавания фагоцитами, такими как макрофаги, и быстро удаляются.

[0004]

Удаление апоптотических клеток макрофагами или аналогично быстрым фагоцитозом в значительной степени способствует подавлению патологического прогрессирования ишемических заболеваний. Когда в клетках индуцируется апоптоз, привлекаются макрофаги, и апоптотические клетки выводятся из организма (клиренс), что снижает нагрузку на окружающие клетки и ткани. Когда такой клиренс апоптотических клеток не вызывается должным образом, апоптотические клетки и их содержимое накапливаются в окружающей области, вызывая нагрузку на окружающие клетки и ткани и вызывая повреждение окружающих тканей. Таким образом, фагоцитоз апоптотических клеток макрофагами чрезвычайно важен для поддержания гомеостаза живого организма.

[0005]

Известно, что клетки, в которых был индуцирован апоптоз, имеют экспонированный фосфатидилсерин (PS), который представляет собой фосфолипид, присутствующий внутри клеточной мембраны в нормальных клетках, у поверхности клетки. Известно, что этот PS опосредует так называемый сигнал «съешь меня» для фагоцитов, таких как макрофаги, и макрофаги распознают PS на апоптотических клетках, что позволяет им фагоцитировать апоптотические клетки (непатентная литература 1 и 2).

[0006]

Тирозинкиназа Mer (MerTK), принадлежащая к семейству рецепторных тирозинкиназ, известна как один из факторов, которые получают сигнал «съешь меня» в макрофагах. MerTK усиливает фагоцитоз макрофагами, связываясь с PS на поверхности апоптотической клетки через его лиганды gas6 и белок6. Например, было обнаружено, что макрофаги, полученные от мышей, лишенных MerTK, не могут фагоцитировать апоптотические клетки (непатентная литература 3).

[0007]

Также сообщалось, что CD300b (CLM7/LMIR5), член семейства CD300, являющийся белком семейства рецепторов, распознает PS на поверхности апоптотических клеток в качестве лиганда и модулирует фагоцитоз апоптотических клеток (непатентная литература 4).

[0008]

С другой стороны, в отношении CD300a, который также является членом семейства рецепторов CD300, авторы настоящего изобретения сообщили, что CD300a связывается с PS в тучных клетках или в им подобных, которые являются клетками иммунной системы, тем самым усиливая трансдукцию иммуносупрессивных сигналов (Патентная литература 1), и что CD300a макрофагов не способствует фагоцитозу, даже когда связан с PS (непатентная литература 5).

Список цитирования

Патентная литература

[0009]

Патентная литература 1: Международная публикация № WO 2013/077186

Непатентная литература

[0010]

Непатентная литература 1: V.A.Fadok et al. J Immunol 148, 2207 apr. 1, 1992

Непатентная литература 2: J.Savill, I.Dransfield, C.Gregory, C.Haslett, Nat Rev Immunol 2, 965, 2002

Непатентная литература 3: Nishi et al. Mol. Cell. Biol. April 2014 vol. 34 no. 8 1512-1520

Непатентная литература 4: Murakami et al. Cell Death and Differentiation (2014) 21, 1746-1757

Непатентная литература 5: Nakahashi-Oda et al. J. Exp. Med., 209, 1493-1503

Краткое изложение сущности изобретения

Техническая задача

[0011]

Настоящее изобретение направлено на выяснение механизма контроля активации CD300b-зависимого фагоцитоза и на обеспечение модулятора активности, который является средством для модулирования активности CD300b-зависимого фагоцитоза, и лекарственного средства для лечения или предотвращения заболевания или состояния, в которых эта активность участвует.

Решение задачи

[0012]

В результате интенсивных исследований, направленных на выяснение механизма контроля активации CD300b-зависимого фагоцитоза при фагоцитозе макрофагов, авторы настоящего изобретения обнаружили, что CD300a, активированный связыванием с PS, подавляет CD300b-зависимый фагоцитоз в макрофагах.

[0013]

Кроме того, авторы настоящего изобретения предположили, что когда в живом организме возникает ишемия, CD300b-зависимый фагоцитоз подавляется CD300a, и клетки, в которых из-за ишемии индуцируется апоптоз, и их внутриклеточные вещества накапливаются в тканях, что вызывает или усугубляет ишемическое заболевание. Исходя из этого, авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что можно подвергать лечению ишемические заболевания, модулируя активность CD300a с использованием антитела против CD300a и контролируя CD300b-зависимый фагоцитоз, и что антитело против CD300a может быть инструментом для лечения ишемических заболеваний, что привело к настоящему изобретению.

[0014]

В соответствии с настоящим изобретением, сделанным на основе этих результатов, предложены, например, модуляторы активности и лекарственные средства, представленные в следующих пунктах [1] - [9].

[1] Модулятор активности для модуляции CD300b-зависимых сигналов фагоцитоза в макрофаге, содержащий CD300a-связывающее вещество.

[2] Модулятор активности по [1], в котором CD300a-связывающее вещество представляет собой вещество, которое ингибирует активность CD300a в макрофагах.

[3] Модулятор активности по [1] или [2], в котором CD300a-связывающее вещество представляет собой вещество, которое ингибирует связывание CD300a с фосфатидилсерином.

[4] Модулятор активности по любому из [1] - [3], в котором CD300a-связывающее вещество представляет собой антитело или пептид.

[5] Модулятор активности по любому из [1] - [3], в котором CD300a-связывающее вещество представляет собой антитело к CD300a.

[6] Модулятор активности по [5], в котором антитело к CD300a представляет собой CD300a-нейтрализующее антитело.

[7] Модулятор активности по [5] или [6], в котором антитело к CD300a представляет собой моноклональное антитело к CD300a.

[8] Лекарственное средство против ишемических заболеваний, содержащее модулятор активности по любому из [1] - [7].

[9] Лекарственное средство против ишемических заболеваний по [8], которое представляет собой лекарственное средство для лечения или профилактики одного или более заболеваний, выбранных из ишемической болезни сердца, ишемической болезни мозга, ишемической болезни кишечника, ишемической болезни почек, ишемии конечностей, ишемии сетчатки, ишемической болезни легких и ишемии спинного мозга.

Полезные эффекты изобретения

[0015]

Согласно настоящему изобретению могут быть предложены модулятор активности и лекарственное средство против ишемических заболеваний, которое модулирует сигнальную трансдукцию, связанную с CD300b-зависимым фагоцитозом макрофагов.

Краткое описание чертежей

[0016]

[Фигура 1] Фигура 1 демонстрирует результаты анализа проточной цитометрии, полученные в референсном Примере 1. Результаты для группы клеток, обработанных антителом против MerTk+контрольным антителом, обозначены кружками, а результаты для группы клеток, обработанных антителом против MerTk+антителом против CD300a, обозначены квадратами.

[Фигура 2] Фигура 2А представляет собой график, показывающий измеренные значения азота мочевины (BUN) и сывороточной концентрации креатинина (Cre) у мышей CD300a^fl/fl (контрольные мыши) и мышей CD300a^fl/flLysm-Cre через 24 часа после реперфузионной обработки после выполнения обработки почечной ишемии в референсном Примере 2. Фигура 2В представляет собой график, показывающий процент выживаемости после обработки почечной ишемии/реперфузионноой обработки для каждой мыши.

[Фигура 3] На Фигуре 3 показаны окрашенные изображения окрашивания гематоксилин-эозином в срезах тканей почек мышей CD300a^fl/fl (контрольные мыши) и CD300a^fl/flLysm-Cre до обработки почечной ишемии (наивно), а также через 24 часа и 72 часа после обработки почечной ишемии и реперфузионной обработки, и окрашенные изображения окрашивания TUNEL через 24 часа после обработки ишемии и реперфузионной обработки, в эталонном примере 3.

[Фигура 4] Фигура 4 представляет собой график, показывающий измеренные значения азота мочевины (BUN) и сывороточной концентрации креатинина (Cre) через 24 часа после реперфузионной обработки после выполнения обработки почечной ишемии в Примере 1. Группа введения антитела против CD300a обозначена треугольником, а группа без введения обозначена квадратом.

[Фигура 5] Фигура 5 представляет собой график, представляющий оценку неврологических результатов у мышей CD300a^fl/flLysm-Cre и мышей CD300a^fl/fl (контрольных мышей), подвергнутых транзиторной обработке церебральной ишемии в референсном Примере 4.

[Фигура 6] Фигура 6 представляет собой график, представляющий оценку неврологических результатов у мышей, подвергнутых транзиторной обработке церебральной ишемии в Примере 2. Группа введения антитела против CD300a обозначена квадратом, а группа без введения обозначена кружком.

[Фигура 7] Фигура 7А представляет собой график, представляющий оценку неврологических результатов у мышей, подвергнутых транзиторной обработке церебральной ишемии в Примере 3. Группа введения антитела против CD300a обозначена квадратом, а группа без введения обозначена кружком. Фигура 7В представляет собой график, показывающий окрашенные изображения окрашивания гематоксилин-эозином в образце ткани головного мозга мыши с введенными антителами против CD300a или без введения, полученными в Примере 3, и результаты их анализа.

[Фигура 8] Фигура 8 представляет собой график, представляющий коэффициент выживаемости модели инфаркта миокарда с использованием мышей CD300a^fl/flLysm-Cre и мышей дикого типа (C57BL/6J), полученных в Референсном Примере 5.

Описание вариантов осуществления

[0017]

Модулятор активности и лекарственное средство против ишемических заболеваний по настоящему изобретению модулирует CD300b-зависимые сигналы фагоцитоза в макрофаге. В частности, модулируя CD300b-зависимую сигнальную трансдукцию фагоцитоза, он участвует в удалении (клиренсе) апоптотических клеток в ишемическом участке путем фагоцитоза.

[0018]

Модулятор активности и лекарственное средство против ишемических заболеваний по настоящему изобретению подробно описаны ниже.

[0019]

В настоящем описании «ишемия» означает состояние дефицита кислорода в тканях, питательных веществ или тому подобное из-за уменьшения количества артериальной крови, поступающей в ткань, вследствие стеноза или окклюзии кровеносных сосудов, и «ишемический участок» означает участок, где количество артериальной крови уменьшается вследствие ишемии и в результате уменьшается количество питательных веществ, кислорода или тому подобного.

[0020]

Когда CD300b на поверхности макрофага активируется с помощью PS на клетках, в которых апоптоз был вызван ишемией, CD300b связывается с адаптерной молекулой DAP12. В результате тирозин, присутствующий в ITAM (иммунорецепторный активирующий мотив на основе тирозина) DAP12, фосфорилируется, что позволяет рекрутировать и активировать киназу семейства Syk, имеющую домен SH2, а активация нижестоящего пути PI3K/Akt позволяет усиливать фагоцитоз макрофагами.

[0021]

С другой стороны, CD300a рекрутирует тирозин-фосфатазу SHP-1 через последовательность ITIM (иммунорецепторный ингибирующий мотив на основе тирозина) во внутриклеточном домене, связываясь с PS и становясь активированным. В результате CD300b-зависимые сигналы фагоцитоза подавляются путем ингибирования фосфорилирования тирозина, присутствующего в ITAM DAP12.

[0022]

<Модулятор активности>

«Модулятор активности» по настоящему изобретению содержит CD300a-связывающее вещество и модулирует CD300b-зависимые сигналы фагоцитоза в макрофаге. В частности, модулятор активности по настоящему изобретению способствует CD300b-зависимой трансдукции сигнала фагоцитоза путем связывания CD300a-связывающего вещества, содержащегося в модуляторе активности, с CD300a и путем ингибирования (нейтрализации) связывания CD300a с PS.

[0023]

<CD300a-связывающее вещество>

Предпочтительно, чтобы CD300a-связывающее вещество представляло собой вещество, которое ингибирует активность CD300a в макрофагах, и, кроме того, предпочтительно, вещество, которое ингибирует связывание CD300a с PS. Вещество, которое ингибирует активность CD300a, конкретно ничем не ограничено, но предпочтительно представляет собой антитело или пептид и более предпочтительно антитело к CD300a.

[0024]

<Антитело к CD300a>

Антитело к CD300a, используемое в модуляторе активности по настоящему изобретению, представляет собой антитело, которое специфически распознает CD300a в качестве антигена. Антитело к CD300a может представлять собой свободное антитело или может представлять собой антитело, на котором другие необязательные агенты (например, вспомогательные агенты и тому подобное) прямо или косвенно иммобилизованы. Один тип специфического моноклонального антитела или комбинация двух или более моноклональных антител (или поликлональных антител) могут содержаться в модуляторе активности, но с точки зрения специфичности предпочтительно, чтобы содержался один тип моноклонального антитела.

[0025]

Антитело к CD300a конкретно ничем не ограничивается, если оно представляет собой антитело, проявляющее эффект по настоящему изобретению, то есть обладает функцией ингибирования или подавления связывания CD300a с PS (функция нейтрализации), и, в частности, предпочтительно выбирать нейтрализующее антитело к CD300a. Нейтрализующее антитело может быть получено известными способами. Когда моноклональное антитело выбрано в качестве антитела против CD300a, то моноклональное антитело к CD300a обычно получают с помощью такой процедуры, как иммунизация с использованием CD300a, получение гибридомы, скрининг, культивирование и сбор. Из них следует выбрать подходящее моноклональное антитело, имеющее подходящую функцию нейтрализации между CD300a и PS и проявляющее эффект по настоящему изобретению.

[0026]

Когда в качестве антитела против CD300 выбирают поликлональное антитело, то обычно используемое поликлональное антитело, полученное путем создания участка определенной последовательности, содержащего эпитоп молекулы антигена в качестве иммунизирующего антигена, можно использовать в качестве поликлонального антитела, но не ограничиваясь этим, и, например, в качестве альтернативы (эквивалента) поликлональному антителу может использоваться смесь двух или более моноклональных антител. Тип животного (иммунного животного), продуцирующего антитело, конкретно ничем не ограничен, и, может быть выбран подходящим образом из мышей, крыс, морских свинок, кроликов, коз, овец или тому подобного.

[0027]

Антитело к CD300a в качестве природного антитела не обязательно должно быть полноразмерным антителом, при условии, что оно представляет собой антитело, обладающее функцией ингибирования или подавления связывания CD300a с PS (функция нейтрализации), и проявляет эффект по настоящему изобретению, и может представлять собой фрагмент антитела или производное. То есть термин «антитело» в настоящем описании включает не только полноразмерные антитела, но также производные фрагментов антител (фрагменты Fab или F(ab')2 и тому подобное), химерные антитела (гуманизированные антитела и тому подобное), полифункциональные антитела и тому подобное.

[0028]

<Пептид>

Предпочтительно, чтобы пептид, используемый в качестве CD300a-связывающего вещества в настоящем изобретении, представлял собой пептид, который ингибирует активность CD300a в макрофагах, и, кроме того, предпочтительно, пептид, который ингибирует связывание CD300a с PS. Например, предпочтительно выбирать пептид, который специфически связывается с CD300a, и, в частности, это предпочтительно пептид, который может быть лигандом для CD300a и который ингибирует активность CD300a в макрофагах.

[0029]

<Лекарственное средство для ишемических заболеваний>

«Лекарственное средство для ишемических заболеваний» по настоящему изобретению содержит модулятор активности в качестве активного ингредиента. CD300b-зависимая сигнальная трансдукция фагоцитоза стимулируется модулятором активности, тем самым быстро удаляя (выводя) апоптотические клетки в ишемическом участке посредством фагоцитоза, что позволяет подавлять накопление апоптотических клеток в ткани и лечить или предотвращать ишемические заболевания.

[0030]

«Лечение» включает в себя излечение, а также ослабление (облегчение) заболевания или состояния, а «предотвращение» включает предотвращение возникновения заболевания или состояния, а также предотвращение его рецидива после излечения заболевания или состояния.

[0031]

Пациентом, получающим лекарственное средство от ишемических заболеваний по настоящему изобретению, может быть человек или не человек (например, млекопитающие, такие как мыши), но предпочтительно человек, еще более предпочтительно, человек, страдающий от ишемического заболевания или подверженный риску его возникновения.

[0032]

«Ишемическое заболевание», которое является заболеванием, на которое направлено лекарственное средство для лечения ишемических заболеваний по настоящему изобретению, относится к состоянию, при котором ишемия ткани продолжается из-за артериального стеноза или окклюзии, или к неблагоприятному состоянию, вызванному такой ишемией, независимо от наличия или отсутствия субъективных симптомов. Примеры ишемического заболевания включают, но не ограничиваются ими, ишемические заболевания сердца, такие как стенокардия и инфаркт миокарда, ишемические заболевания головного мозга, такие как инфаркт головного мозга и болезнь мойя-мойя, ишемические заболевания почек, такие как почечная недостаточность, ишемические заболевания кишечника, такие как ишемический колит или окклюзия брыжеечной артерии, ишемия конечностей, такая как гангрена или облитерирующий артериосклероз, ишемия сетчатки, такая как диабетическая ретинопатия, ишемическая болезнь легких, ишемия спинного мозга или состояния с их признаками.

[0033]

Место введения лекарственного средства от ишемических заболеваний по настоящему изобретению может быть выбрано в соответствии с заболеванием или состоянием, которое является целью введения, и конкретно ничем не ограничено. Например, его можно вводить системно путем введения в кровь, его можно вводить в подслизистую ткань или соединительную ткань или рядом с ней в участке, где возникает ишемия, или его можно вводить непосредственно в участок, где возникает ишемия. В качестве способа введения возможны как пероральное, так и парентеральное введение, но предпочтительным является парентеральное введение, например, внутривенная инъекция, подкожная инъекция, местная инъекция, внутрицеребровентрикулярное введение и тому подобное, и внутривенная инъекция, то есть системное введение является наиболее предпочтительным.

[0034]

Лекарственное средство от ишемических заболеваний по настоящему изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами, такими как тромболитические агенты.

[0035]

Доза лекарственного средства для лечения ишемических заболеваний по настоящему изобретению конкретно ничем не ограничена, но предпочтительно является настолько малой, насколько это возможно, в пределах диапазона, необходимого для достижения необходимого терапевтического эффекта, с экономической точки зрения и с точки зрения максимально возможного избежания побочных эффектов. В частности, предпочтительно выбирать ее соответствующим образом в соответствии со степенью заболевания, массой пациента, возрастом и полом, а также увеличивать или уменьшать ее в зависимости от степени улучшения и т. д. Кроме того, частота введения предпочтительна от 1 до нескольких раз в день.

[0036]

Аналогично, количество антитела против CD300a, содержащегося в лекарственном средстве от ишемических заболеваний по настоящему изобретению, может быть выбрано соответствующим образом. Например, предпочтительно вводить от 10 до 100 мг, предпочтительно от 20 до 50 мг на кг человека или животного.

[0037]

Форма лекарственного средства от ишемических заболеваний по настоящему изобретению конкретно ничем не ограничена и, например, предпочтительно представляет собой раствор или дисперсию, растворенную или диспергированную в разбавителе, чтобы иметь желаемую вязкость или концентрацию содержащихся компонентов, и может быть стерилизована фильтрацией с помощью фильтра в соответствии с обычным способом или может быть стерилизована путем смешивания бактерицида или тому подобного. Кроме того, она может быть в форме экстемпорального препарата, например, она может быть приготовлена в виде твердого препарата методом лиофлизации или тому подобного и может вводиться после растворения или диспергирования в разбавителе перед использованием.

[0038]

«Лекарственное средство от ишемических заболеваний» по настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемую добавку, если необходимо. Например, оно может содержать разбавитель, носитель или наполнитель.

[0039]

Фармацевтически приемлемая добавка особо ничем не ограничивается, если только она не противоречит объекту настоящего изобретения, и ее примеры включают разбавители, носители, наполнители, стабилизаторы, консерванты, буферы, эмульгаторы, такие как поверхностно-активные вещества, красители, загустители, солюбилизирующие агенты, такие как гликоли, и изотонические агенты, такие как хлорид натрия и глицерин.

[0040]

Конкретные примеры добавок включают лактозу, глюкозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, неактивные альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, кристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, водный сироп, воду, воду/этанол, воду/гликоль, воду/полиэтилен, гипертонический солевой раствор, гликоль, пропиленгликоль, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, жирные вещества, такие как минеральное масло или твердые жиры, или их подходящую смесь.

[0041]

Формы, которые можно вводить парентерально, должны быть стерильными и не содержать физиологически неприемлемых агентов, и должны иметь низкую осмоляльность, чтобы минимизировать раздражение или другие побочные эффекты при введении, и поэтому раствор должен быть предпочтительно изотоническим или слегка гипертоническим, например, гипертонический солевой раствор (физиологический раствор).

Примеры

[0042]

Далее подходящие аспекты настоящего изобретения описаны более конкретно на основе примеров, однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

[0043]

[Референсный Пример 1]

Апоптоз вызывали добавлением 10 мкМ дексаметазона к тимоцитам, выделенным из образцов тимуса, собранных у мышей дикого типа (C57BL/6J), и культивированных в течение 12 часов, при этом тимоциты дополнительно метили красителем pHrodo (товарный знак).

[0044]

В тоже время клетки перитонеального экссудата мышей дикого типа или мышей CD300b KO собирали и культивировали в течение 30 минут для прикрепления макрофагов к культуральной чашке.

[0045]

1,5х10⁶ меченых тимоцитов и 1,5х10⁵ макрофагов культивировали в течение 90 минут в присутствии 20 нг/мл нейтрализующего антитела против MerTk (2B10C42, Biolegend) и антитела против CD300a (TKA139, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) или в присутствии 20 нг/мл антитела против MerTk (2B10C42, Biolegend) и 1 нг/мл контрольного антитела (IC17-мышиный IgG1 sFc, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.). Затем с помощью проточной цитометрии (BD FACSAria (торговая марка), BD Biosciences) подсчитывали общее количество макрофагов, положительных по анти-CD11b-антителу (M1/70, TONBO bioscience) и антителу против F480 (BM8, Biolegend), и количество pHrodo-положительных клеток. После этого рассчитывали отношение последнего к первому, и значение определяли как соотношение макрофагов, имеющих фагоцитированные апоптотические клетки (FlowJo (зарегистрированный товарный знак), FlowJo LLC).

[0046]

Результаты представлены на Фигуре 1.

[0047]

Макрофаги, полученные от мышей CD300b KO, имеют значительно более низкую скорость фагоцитоза апоптотических клеток по сравнению с макрофагами WT, независимо от наличия или отсутствия антитела против CD300a.

[0048]

В данном случае, в клетках, в которых CD300a был нейтрализован антителом против CD300a, уровень фагоцитоза апоптотических клеток значительно увеличился в макрофагах WT, однако увеличение скорости фагоцитоза не наблюдалось в макрофагах CD300b KO.

[0049]

Следовательно, было обнаружено, что фагоцитоз макрофагов, которому способствует CD300b, усиливается антителом против CD300a.

[0050]

[Референсный Пример 2]

Мышь CD300a^fl/flLysm-Cre, которая является мышью с условным нокаутом по макрофаг-специфичному CD300a, была получена путем скрещивания мыши CD300a^fl/fl (производимой Центром лабораторных животных Университета Цукубы) с мышью Lysm-Cre (лаборатория Джексона).

[0051]

Брюшную полость каждой из мышей CD300a^fl/fl в возрасте 8-14 недель (контрольных мышей) и мышей CD300a^fl/flLysm-Cre вскрывали под анестезией, и закрывали с помощью зажимов двустороннюю почечную артерию (обработка для вызова почечной ишемии).

[0052]

После 25 или 35 минут окклюзии зажимы удаляли, чтобы снять окклюзию (реперфузионная обработка), и живот закрывали.

[0053]

Для каждой мыши измеряли азот мочевины (BUN) и сывороточную концентрацию креатинина (Cre) через 24 часа после реперфузионной обработки.

[0054]

Кроме того, для мышей, которые были окклюзированы в течение 35 минут и подвергались реперфузионной обработке, также наблюдали выживаемость после обработки.

[0055]

Результаты представлены на Фигуре 2.

[0056]

Эти результаты показывают, что у мышей подавляется острое повреждение почек после обработки почечной ишемии, и степень выживаемости сохраняется у мышей, которые дефицитны по CD300a в макрофагах по сравнению с контрольной группой.

[0057]

[Референсный Пример 3]

Двусторонние почечные артерии каждой из мышей CD300a^fl/flLysm-Cre и мышей CD300a^fl/fl (контрольных мышей), полученных тем же способом, что и в референсном Примере 2, закупоривали в течение 30 минут и затем обрабатывали для реперфузии тем же способом, что и в референсном Примере 2. Почки собирали через 24 часа и 72 часа после реперфузионной обработки, и образцы ткани готовили в соответствии с обычным способом с последующим окрашиванием гематоксилин-эозином или окрашиванием TUNEL (Apoptag, Millipore).

[0058]

Результаты представлены на Фигуре 3. Было обнаружено, что у мышей, дефицитных по CD300a в макрофагах, по сравнению с контрольной группой апоптоз в ткани после обработки почечной ишемии был подавлен, и накопление апоптотических клеток в ткани также было подавлено.

[0059]

[Пример 1]

Контрольное антитело (IC17-мышиный IgG1 sFc, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) или антитело к CD300a (TKA139, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) вводили внутривенно мышам дикого типа (20 мг/кг) (C57BL /6J). Через 3 часа после введения проводили обработку почечной ишемии с последующей реперфузионной обработкой через 30 минут тем же способом, что и в референсном примере 2, и у каждой измеряли азот мочевины (BUN) и сывороточные концентрации креатинина (Cre) через 24 часа.

[0060]

Результаты представлены на Фигуре 4. Было обнаружено, что острое повреждение почек после обработки почечной ишемии можно подавить, предварительно вводя мышам антитело к CD300a.

[0061]

[Референсный Пример 4]

Для каждой из мышей CD300a^fl/flLysm-Cre и мышей CD300a^fl/fl (контрольных мышей), полученных тем же способом, что и в референсном примере 2, модель окклюзии правой средней мозговой артерии (MCAO) получали путем вскрытия шеи под анестезией, и размещения монофиламентного катетера с силиконовым покрытием (Doccol Corporation) путем введения его из сонной артерии для окклюзии правой средней мозговой артерии (обработка для вызова транзиторной церебральной ишемии) (Shichita et al. Nat Med 2016). Через 60 минут после окклюзии катетер удаляли для перфузии мозгового кровотока, и закрывали хирургическую рану.

[0062]

После этого мышей наблюдали в течение нескольких дней, и неврологические данные оценивали на основании следующих неврологических показателей со ссылкой на Bederson et al. Stroke 1986.

[0063]

0: нет четких симптомов, 1: сгибание передних конечностей, 2: снижение сопротивления боковому толчку без кружения, 3: Кружение, 4: Принудительное кружение, 5: Почти без движения, 6: Мертво.

[0064]

Результаты представлены на Фигуре 5. Было обнаружено, что неврологическое повреждение, вызванное церебральной ишемией, было более умеренным у мышей модели MCAO, полученных с использованием мышей, у которых имеется дефицит CD300a в макрофагах, чем у мышей модели MCAO, полученных с использованием контрольных мышей.

[0065]

[Пример 2]

Обработку для вызова транзиторной церебральной ишемии проводили на мышах дикого типа (C57BL/6J) тем же способом, что и в референсном Примере 4. Через 60 минут после обработки внутривенно вводили 20 мг/кг контрольного антитела (IC17-мышиный IgG1 sFc, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) или антитела против CD300a. После этого неврологические данные у каждой мыши были оценены на основе тех же показателей, что и в референсном Примере 4.

[0066]

Результаты представлены на Фигуре 6. Было обнаружено, что неврологическое повреждение, вызванное обработкой для вызова транзиторной церебральной ишемии, было относительно менее выраженным в группе мышей, которым вводили антитело к CD300a, чем в группе мышей, получавших контрольное антитело. Это говорит о том, что неврологическое повреждение, вызванное церебральной ишемией, такой как инфаркт мозга, может быть предотвращено антителом против CD300a.

[0067]

[Пример 3]

Обработку для вызова транзиторной церебральной ишемии проводили на мышах дикого типа (C57BL/6J) тем же способом, что и в референсном Примере 4. Через 3 часа после обработки отбирали мышей с вышеупомянутым неврологическим показателем 3 (кружение), и каждой из них внутривенно вводили 20 мг/кг контрольного антитела или антитела против CD300a, затем неврологические данные оценивали на основании неврологических показателей, приведенных в референсном Примере 4.

[0068]

На 5 день после введения антитела против CD300a мышей умерщвляли, собирали головной мозг для приготовления образца ткани головного мозга, который подвергали окрашиванию гематоксилин-эозином и наблюдали с помощью оптического микроскопа (keyence) для измерения площади области инфаркта.

[0069]

Результаты представлены на Фигуре 7. В группе мышей, которым вводили антитело к CD300a, неврологический показатель значительно улучшился по сравнению с группой мышей, которым вводили контрольное антитело, и результаты окрашивания также показали, что площадь области инфаркта была значительно уже.

[0070]

Это говорит о том, что неврологическое повреждение, вызванное церебральной ишемией, такой как инфаркт мозга, можно подвергать лечению с помощью антитела против CD300a.

[0071]

[Референсный Пример 5]

Для каждой из мышей CD300a^fl/flLysm-Cre и мышей дикого типа (C57BL/6J), полученных тем же способом, что и в референсном Примере 2, торакотомию выполняли с помощью искусственного дыхания после общей анестезии, и левую переднюю нисходящую артерию лигировали с помощью нити 6-0 Proline (зарегистрированная торговая марка) для создания модели инфаркта миокарда (Mahmoud et al. Nat Prot 2014). Спустя одну неделю после операции, гнезда инфаркта были подтверждены с помощью эха-Доплера, и для мышей, у которых было подтверждено гнездо инфаркта, наблюдали процент выживаемости.

[0072]

Результаты представлены на Фигуре 8. Было обнаружено, что выживаемость была значительно выше у мышей с моделью инфаркта миокарда, полученных с использованием мышей, дефицитных по CD300a в макрофагах, чем у мышей с моделью инфаркта миокарда, полученных с использованием контрольных мышей.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Представлены: модулятор активности, который является средством для модуляции активности CD300b-зависимого фагоцитоза, и его применение, лекарственное средство и способ для лечения или профилактики заболевания, в которых участвует эта активность. Модулятор активности содержит CD300a-связывающее вещество и модулирует CD300b-зависимые сигналы фагоцитоза в макрофагах, что приводит к эффективному лечению заболеваний. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 пр.

1. Модулятор активности для промотирования CD300b-зависимых сигналов фагоцитоза в макрофаге, содержащий CD300a-связывающее вещество, причем CD300a-связывающее вещество представляет собой CD300a-нейтрализующее антитело.

2. Модулятор активности по п.1, в котором антитело к CD300a представляет собой моноклональное антитело к CD300a.

3. Лекарственное средство против ишемических заболеваний, содержащее эффективное количество модулятора активности по п.1 или 2, причем лекарственное средство против ишемических заболеваний представляет собой лекарственное средство для лечения или профилактики одного или более заболеваний, выбранных из ишемической болезни сердца, ишемической болезни мозга, ишемической болезни кишечника, ишемической болезни почек, ишемии конечностей, ишемии сетчатки, ишемической болезни легких и ишемии спинного мозга.

4. Лекарственное средство против ишемических заболеваний по п.3, причем лекарственное средство против ишемических заболеваний представляет собой лекарственное средство для лечения или профилактики одного или более заболеваний, выбранных из ишемической болезни сердца, ишемической болезни мозга и ишемической болезни почек.

5. Способ профилактики или лечения ишемических заболеваний, включающий введение субъекту эффективного количества модулятора активности по п.1 или 2.

6. Способ по п.5, в котором ишемическая болезнь представляет собой одно или более заболеваний, выбранных из ишемической болезни сердца, ишемической болезни мозга, ишемической болезни кишечника, ишемической болезни почек, ишемии конечностей, ишемии сетчатки, ишемической болезни легких и ишемии спинного мозга.

7. Применение эффективного количества модулятора активности по п.1 или 2 для профилактики или лечения ишемических заболеваний.

8. Применение по п.7, в котором ишемические заболевания представляют собой одно или более заболеваний, выбранных из ишемической болезни сердца, ишемической болезни мозга, ишемической болезни кишечника, ишемической болезни почек, ишемии конечностей, ишемии сетчатки, ишемической болезни легких и ишемии спинного мозга.