ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ Российский патент 2024 года по МПК A61K31/714 A61K9/08 A61P25/28 A61P25/00 A61P9/00 A61P9/10 C07D487/22 

[Область техники]

[0001]

Настоящее изобретение относится к терапевтическому средству для лечения заболеваний нервной системы или тому подобному.

[Уровень техники]

[0002]

Заболевания нервной системы возникают в головном, спинном мозге, периферических нервах и мышцах. Среди заболеваний, которые поражают головной и спинной мозг, называют заболевания центральной нервной системы. Типичные примеры заболеваний центральной нервной системы, возникающих в головном мозге, включают церебральный инфаркт и деменцию. Типичные примеры заболеваний центральной нервной системы, возникающих в спинном мозге, включают повреждение спинного мозга.

[0003]

Церебральный инфаркт составлял около 60 процентов случаев цереброваскулярного расстройства, которое было четвертым основным фактором смертности за 2014 год. Учитывая, что пациенты с большой вероятностью нуждаются в уходе после перенесенного церебрального инфаркта, болезнь сильно влияет на общество с точки зрения затрат на здравоохранение. Зоны церебрального инфаркта делятся на ишемическое ядро (также называемое просто ядром), в котором кровоток полностью заблокирован, и периферическую ишемическую полутень (полутенистая зона), в которой кровоток поддерживается коллатеральным кровообращением. Хотя спасти центральную часть, где нервные клетки быстро умирают (первичное повреждение), трудно, полутеневая область может выжить, потому что клетки остаются в живых в этой части. Таким образом, способ спасения полутеневой области является жизненно важным моментом в лечении острой фазы церебрального инфаркта. Гистологические изменения в очаге инфаркта головного мозга включают (1) апоптоз нервных клеток, (2) индукцию воспаления и (3) разрушение гематоэнцефалического барьера (BBB). Примеры лекарственных средств для лечения церебрального инфаркта, используемых в настоящее время в Японии, включают урокиназу, антикоагулянтные средства и антитромбоцитарные средства, а также средства, которые разбавляют кровь, и средства, которые уменьшают отек. Эдаравон (торговое наименование Radicut) был одобрен в качестве препарата для удаления свободных радикалов в Японии в 2001 году, но не был одобрен в Европе, Соединенных Штатах и т.п. Тромболитическая терапия (терапия тканевым активатором плазминогена [tPA]) была одобрена в 2005 году, но ее применение ограничено лечением, проводимым в течение 4,5 часов от начала заболевания. Затем, с 2005 года не было доступно никаких дополнительных терапевтических средств для церебрального инфаркта.

[0004]

Сообщается, что ежегодно в Японии насчитывается около 5000 новых пациентов с повреждением спинного мозга. Боль, онемение, нарушение координации движений и тому подобное связаны с чрезвычайно сниженным качеством жизни пациентов. Патогенез повреждения спинного мозга включает повреждение нервных клеток и сосудистой ткани из-за прямого внешнего воздействия во время травмы (первичное повреждение), после чего следует ряд реакций, связанных с разрушением барьера между кровью и спинным мозгом (вторичное повреждение), что приводит к расширению области поражения. Поскольку первичное повреждение неизбежно, то, как уменьшить вторичное повреждение, очень важно при лечении острой или подострой фазы повреждения спинного мозга. Однако в настоящее время не существует безопасного и эффективного терапевтического препарата для лечения острой фазы повреждения спинного мозга в клинических условиях. В руководствах по лечению острого повреждения спинного мозга, выпущенных в Соединенных Штатах, четко указано, что обычные методы лечения с использованием высоких доз метилпреднизолона не следует применять регулярно из-за их тяжелых побочных эффектов. Таким образом, существует неудовлетворенная медицинская потребность в новом терапевтическом средстве, эффективном при повреждении спинного мозга.

[0005]

Периферические нервы способны восстанавливаться после повреждения, но этого недостаточно для восстановления функций нервной системы. При повреждении нерва происходит Валлерова дегенерация, то есть фагоцитозная элиминация аксонов и миелиновых оболочек. В последующем процессе регенерации регенерированный аксон распространяется в дистальном направлении вдоль ленты Бюнгнера, образованной недифференцированными шванновскими клетками, что приводит к реиннервации целевой мышцы. В конечном итоге миелиновая оболочка формируется шванновскими клетками, которые окружают регенерированный аксон. Тем не менее, регенерированный нерв распространяется с очень низкой скоростью, и мышечная атрофия возникает, если расстояние до целевой мышцы велико; таким образом, нельзя ожидать достаточного функционального восстановления. В последние годы было обнаружено, что макрофаги играют важную роль на каждом этапе процесса регенерации, и это открытие привлекает внимание. Хотя провоспалительная функция макрофагов хорошо известна, существует также другой фенотип, который имеет противовоспалительную функцию, противоположную ему, и эти два фенотипа, обозначаемые как M1 и M2, соответственно, рассматриваются как континуум (может произойти переключение между М1 и М2). В целом, говорят, что регенерация нервов может быть стимулирована увеличением макрофага М2, который является противовоспалительным фенотипом.

[0006]

С другой стороны, известно, что центральная нервная система обладает меньшей способностью к регенерации по сравнению с периферической нервной системой. Известно, что после повреждения центрального нерва ингибитор роста аксона экспрессируется в олигодендроцитах, которые представляют собой клетки, образующие миелиновую оболочку вокруг аксона, и что макрофаг/микроглия, астроцит и тому подобное образуют глиальный рубец, который оказывает ингибирующее действие на рост аксона. Поэтому говорят, что подавление провоспалительного эффекта макрофага/микроглии является важным после повреждения центрального нерва, и что регенерации нерва можно способствовать путем увеличения макрофага/микроглии М2, являющегося противовоспалительным фенотипом, как в случае периферической нервной системы.

[0007]

Известно, что витамин B₁₂ эффективен для лечения дефицита витамина B₁₂ и что неврологические изменения, такие как периферический неврит или изменение спинного мозга, могут происходить при дефиците витамина B₁₂ (патентный документ 1).

[0008]

В дополнение, пациенты с церебральной ишемией имеют повышенный уровень гомоцистеина в крови по сравнению со здоровыми людьми, что указывает на связь между уровнем гомоцистеина в крови и церебральной ишемией. Кроме того, было обнаружено, что уровень гомоцистеина в крови снижается при введении фолиевой кислоты, витамина B₆ и витамина B₁₂, что позволяет предположить, что снижение уровня гомоцистеина может потенциально снизить риск церебральной ишемии (непатентный документ 1).

[0009]

Кроме того, известно, что активины оказывают противовоспалительное действие, индуцируя макрофаг М2 (патентный документ 2), и что иммуносупрессивное средство, содержащее мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, индуцирует макрофаг М2 (патентный документ 3).

[0010]

Однако не было раскрыто, что витамин B₁₂ способствует индукции макрофага/микроглии M2, ингибирует индукцию макрофага/микроглии M1 и облегчает неврологические заболевания, такие как церебральный инфаркт.

[Документы предшествующего уровня техники]

[Патентные документы]

[0011]

Патентный документ 1: Japanese Patent Laid-Open No. 2016-513694

Патентный документ 2: International Publication No. WO 2011/149036

Патентный документ 3: International Publication No. WO 2011/043136

[Непатентный документ]

[0012]

Непатентный документ 1: Current Medicinal Chemistry, 2007, Vol. 14, No. 3, p. 249-263

[Сущность изобретения]

[Задача, решаемая изобретением]

[0013]

Целью настоящего изобретения является создание терапевтического средства для лечения заболевания нервной системы. Предпочтительно, целью настоящего изобретения является предоставление терапевтического средства для лечения заболевания нервной системы, обладающего по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из ингибирующего апоптоз действия, ингибирующего некроз действия, промотирующего рост аксонов действия, действия, промотирующего индукцию макрофага/микроглии М2, действия, ингибирующего индукцию макрофага/микроглии M1, и промотирующего регенерацию нервов действия.

[Средства для решения задач]

[0014]

Авторы настоящего изобретения провели обширные исследования с учетом вышеуказанных задач и обнаружили, что витамин B₁₂ оказывает терапевтический эффект на заболевания нервной системы. Кроме того, авторы настоящего изобретения также обнаружили, что витамин B₁₂ обладает ингибирующим апоптоз действием, ингибирующим некроз действием, промотирующим рост аксонов действием, действием, промотирующим индукцию макрофага/микроглии М2, действием, ингибирующим индукцию макрофага/микроглии M1, промотирующим регенерацию нервов действием, и тому подобное. Авторы настоящего изобретения провели дополнительные исследования на основе этих результатов и выполнили настоящее изобретение.

[0015]

В частности, настоящее изобретение охватывает следующие аспекты:

Пункт 1. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы, включающее витамин B₁₂.

[0016]

Пункт 1A. Способ лечения заболевания нервной системы, включающий введение витамина B₁₂ пациенту, нуждающемуся в лечении заболевания нервной системы.

[0017]

Пункт 1B1. Витамин В₁₂ для применения при лечении заболевания нервной системы.

[0018]

Пункт 1B2. Композиция, включающая витамин B₁₂, для применения при лечении заболевания нервной системы.

[0019]

Пункт 1C. Применение витамина В₁₂ для получения терапевтического средства для лечения заболевания нервной системы.

[0020]

Пункт 2. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по пункту 1, где терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы представляет собой средство, промотирующее индукцию М2 макрофага/микроглии.

[0021]

Пункт 3. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по пункту 1, где терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы представляет собой средство, ингибирующее индукцию M1 макрофага/микроглии.

[0022]

Пункт 4. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по любому из пунктов 1-3, где терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы представляет собой средство, промотирующее регенерацию нервов.

[0023]

Пункт 5. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по любому из пунктов 1-4, где заболевание нервной системы представляет собой заболевание центральной нервной системы.

[0024]

Пункт 6. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по пункту 5, где заболевание центральной нервной системы представляет собой цереброваскулярное заболевание.

[0025]

Пункт 7. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по пункту 6, где цереброваскулярное заболевание представляет собой по меньшей мере одно заболевание, выбранное из группы, состоящей из церебрального инфаркта, внутримозгового кровоизлияния, церебрального тромбоза, церебрального атеросклероза и деменции.

[0026]

Пункт 8. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по любому из пунктов 1-4, где заболевание нервной системы представляет собой повреждение нерва.

[0027]

Пункт 9. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по пункту 8, где повреждение нерва представляет собой повреждение центрального нерва.

[0028]

Пункт 10. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по пункту 9, где повреждение центрального нерва представляет собой повреждение спинного мозга.

[0029]

Пункт 11. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по любому из пунктов 1-10, где витамин В₁₂ представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из метилкобаламина, цианокобаламина, гидроксокобаламина, сульфитокобаламина, аденозилкобаламина и их солей.

[0030]

Пункт 12. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по любому из пунктов 1-11, где витамин B₁₂ представляет собой метилкобаламин.

[0031]

Пункт 13. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по любому из пунктов 1-12, где терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы используется для непрерывного введения.

[0032]

Пункт 14. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по пункту 13, где терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы представляет собой лекарственную форму для внутривенного капельного вливания.

[0033]

Пункт 15. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по любому из пунктов 1-14, где терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы используется таким образом, что введение начинают через 12-24 часа после начала заболевания.

[0034]

Пункт 16. Терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы по любому из пунктов 1-14, где терапевтическое средство для лечения заболевания нервной системы используется таким образом, что введение начинают сразу же после начала заболевания или не позднее 12 часов после начала заболевания.

[Краткое описание фигур]

[0035]

На фиг.1 показаны результаты TUNEL-анализа в примере 1. На вертикальной оси указана доля апоптотических клеток. На горизонтальной оси указаны типы добавленных лекарственных средств и были ли добавлены лекарственные средства (+) или нет (-). Две звездочки «**» означают, что результат статистического анализа с использованием метода Тьюки-Крамера имел значение р менее 0,01.

На фиг.2 показаны результаты анализа лактатдегидрогеназы (LDH) в примере 2. На вертикальной оси указана активность LDH, которая является показателем некроза, в процентах по сравнению с таковой при высоком контроле. На горизонтальной оси указан тип добавленного лекарственного средства и было ли добавлено лекарственное средство (10 мкМ) или нет (-). Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием t-критерия Стьюдента имел значение p менее 0,05.

На фиг.3 показаны результаты анализа роста нейритов в примере 3. На вертикальной оси указана средняя длина 30 или более нейронных аксонов. На горизонтальной оси указаны концентрации добавленного лекарственного средства. Контроль (CTR) не содержит лекарственное средство. Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием теста Даннетта против CTR имел значение p менее 0,05, и "**" означает, что результат имел значение р менее 0,01.

На фиг.4 показаны результаты окрашивания 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида (ТТС) в примере 4. На вертикальной оси указан объем ишемического поражения. На горизонтальной оси указан тип добавленного лекарственного средства и было ли добавлено лекарственное средство (MeCbl) или нет (контроль). Две звездочки «**» означают, что результат статистического анализа с использованием t-критерия Стьюдента имел значение р менее 0,01.

На фиг.5 показаны результаты вестерн-блоттинга в примере 5. На вертикальных осях указано отношение количества маркера M1 (левый график, белок IL-1β; правый график, белок iNOS) к количеству белка глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH). На горизонтальных осях указаны типы добавленных лекарственных средств и были ли добавлены лекарственные средства (+ или концентрация) или нет (-). Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием теста Даннетта имел значение p менее 0,05, и "**" означают, что результат имел значение р менее 0,01.

На фиг.6 показаны результаты вестерн-блоттинга в примере 5. На вертикальных осях указано отношение количества маркера М2 (левый график, белок аргиназы I (Arg1); правый график, белок CD206) к количеству белка GAPDH. На горизонтальных осях указаны типы добавленных лекарственных средств и были ли добавлены лекарственные средства (+ или концентрация) или нет (-). Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием теста Даннетта имел значение p менее 0,05, и "**" означают, что результат имел значение р менее 0,01.

На фиг.7 показаны результаты иммуногистологического анализа в примере 5. На вертикальных осях указан процент макрофагов M1 (процент iNOS-позитивных клеток) на левом графике и процент макрофагов M2 (процент Arg1-позитивных клеток) на правом графике. На горизонтальной оси указаны типы добавленных лекарственных средств и были ли добавлены лекарственные средства (+ или концентрация) или нет (-). Две звездочки «**» означают, что результат статистического анализа с использованием теста Даннетта имел значение р менее 0,01.

На фиг. 8-1 показаны результаты вестерн-блоттинга в примере 6. На вертикальной оси указано отношение количества фосфорилированного белка Akt к количеству белка Akt. На горизонтальной оси указаны типы добавленных лекарственных средств и были ли добавлены лекарственные средства (+ или концентрация) или нет (-). Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием метода Тьюки-Крамера имел значение p менее 0,05, "**" означают, что результат имел значение р менее 0,01, и "***" означают, что результат имел значение р менее 0,001.

На фиг. 8-2 показаны результаты вестерн-блоттинга в примере 6. На вертикальной оси указано отношение количества фосфорилированного белка 4EBP1 к количеству белка 4EBP1. На горизонтальной оси указаны типы добавленных лекарственных средств и были ли добавлены лекарственные средства (+ или концентрация) или нет (-). Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием метода Тьюки-Крамера имел значение p менее 0,05, "**" означают, что результат имел значение р менее 0,01, и "***" означают, что результат имел значение р менее 0,001.

На фиг. 8-3 показаны результаты вестерн-блоттинга в примере 6. На вертикальной оси указано отношение количества фосфорилированного белка S6K к количеству белка S6K. На горизонтальной оси указаны типы добавленных лекарственных средств и были ли добавлены лекарственные средства (+ или концентрация) или нет (-). Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием метода Тьюки-Крамера имел значение p менее 0,05, "**" означают, что результат имел значение р менее 0,01, и "***" означают, что результат имел значение р менее 0,001.

На фиг.9 показаны результаты иммуногистологического анализа в примере 7. На графиках в левом ряду показаны результаты на расстоянии 2,5 мм в проксимальном направлении от места повреждения, место повреждения и 2,5, 5,0 и 7,5 мм в дистальном направлении. На вертикальных осях указано количество макрофагов на верхних графиках, количество макрофагов М1 на средних графиках и доля макрофагов М1 на нижних графиках. На горизонтальных осях указано количество дней, прошедших после повреждения седалищного нерва. CTR относится к не подвергшейся лечению группе, MeCbl относится к группе лечения метилкобаламином, и Sham относится к группе без повреждений, которая подверглась только экстериоризации седалищного нерва. Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием метода Тьюки-Крамера (CTR vs. MeCbl) имел значение p менее 0,05, и "#" означает, что результат статистического анализа с использованием t-критерия Стьюдента (CTR vs. MeCbl) имел значение p менее 0,05.

На фиг. 10 показаны результаты иммуногистологического анализа в примере 7. На графиках в левом ряду показаны результаты на расстоянии 2,5 мм в проксимальном направлении от места повреждения, место повреждения и 2,5, 5,0 и 7,5 мм в дистальном направлении. На вертикальных осях указано количество макрофагов на верхних графиках, количество макрофагов М2 на средних графиках и доля макрофагов М2 на нижних графиках. На горизонтальных осях указано количество дней, прошедших после повреждения седалищного нерва. CTR относится к не подвергшейся лечению группе, MeCbl относится к группе лечения метилкобаламином, и Sham относится к группе без повреждений, которая подверглась только экстериоризации седалищного нерва. Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием метода Тьюки-Крамера (CTR vs. MeCbl) имел значение p менее 0,05, и "#" означает, что результат статистического анализа с использованием t-критерия Стьюдента (CTR vs. MeCbl) имел значение p менее 0,05.

На фиг. 11 показаны результаты иммуногистологического анализа в примере 8. На вертикальных осях указано количество аксонов на верхнем графике, количество миелиновых аксонов на среднем графике и миелинизации на нижнем графике. На горизонтальных осях указаны положения, в которых были получены поперечные срезы нерва (слева, 2,5 мм в проксимальном направлении от места повреждения, место повреждения и 2,5, 5,0 и 7,5 мм в дистальном направлении). CTR относится к не подвергшейся лечению группе, MeCbl относится к группе лечения метилкобаламином, и Sham относится к группе без повреждений, которая подверглась только экстериоризации седалищного нерва. Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием метода Тьюки-Крамера (CTR vs. MeCbl) имел значение p менее 0,05.

На фиг.12 показаны результаты измерения показателей BBB в примере 9. На вертикальной оси указан показатель BBB. На горизонтальной оси указано количество дней, прошедших после операции по созданию модели повреждения спинного мозга, где 0 означает до операции. CTR относится к не подвергшейся лечению группе, MeCbl относится к группе лечения метилкобаламином, и Sham относится к группе без повреждений, которая подверглась только экстериоризации седалищного нерва. Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием теста Стила-Двасса (CTR vs. MeCbl) имел значение p менее 0,05.

На фиг.13 показаны результаты тепловой альгезиметрии в примере 9. По вертикальной оси указано время, прошедшее после раздражения инфракрасным излучением правой подошвы задней конечности модели крысы, пока крыса не убрала конечность из-за приложенного тепла. На горизонтальной оси указано количество дней, прошедших после операции по созданию модели повреждения спинного мозга, где 0 означает до операции. CTR относится к не подвергшейся лечению группе, MeCbl относится к группе лечения метилкобаламином, и Sham относится к группе без повреждений, которая подверглась только экстериоризации седалищного нерва. Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием теста Стила-Двасса (CTR vs. MeCbl) имел значение p менее 0,05.

На фиг.14 показаны результаты вестерн-блоттинга маркеров М1 (белок IL-1β и белок iNOS) в примере 10. На вертикальной оси указано соотношение количества маркера М1 (белок IL-1β или белок iNOS) к количеству белка GAPDH. На горизонтальной оси указаны типы добавленных лекарственных средств и были ли добавлены лекарственные средства (+ или концентрация) или нет (-). Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием теста Даннетта имел значение р менее 0,05, и "**" означают, что результат имел значение р менее 0,01.

На фиг.15 показаны результаты вестерн-блоттинга маркеров М2 (белок Arg1 и белок CD206) в примере 10. Вертикальные оси, горизонтальные оси и каждый символ имеют такое же значение, как описано для фиг. 14.

На фиг.16 показаны результаты иммунофлуоресцентного окрашивания через 7 дней после операции в примере 11. Каждый график показывает разницу в зависимости от положения. На горизонтальной оси на каждом графике указано направление и расстояние от участка поражения. На вертикальных осях указано количество макрофагов на верхних графиках, количество макрофагов М1 или М2 на средних графиках и доля макрофагов М1 или М2 на нижнем графике. CTR относится к не подвергшейся лечению группе, и MeCbl относится к группе лечения метилкобаламином. Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием U-критерия Манна-Уитни (CTR vs. MeCbl) имел значение р менее 0,05, и "**" означают, что результат имел значение р менее 0,01.

На фиг.17 показаны результаты иммунофлуоресцентного окрашивания через 14 дней после операции в примере 11 и в остальном они такие же, как на фиг. 16.

На фиг.18 показаны результаты иммунофлуоресцентного окрашивания через 28 дней после операции в примере 11 и в остальном они такие же, как на фиг. 16.

На фиг.19 показаны результаты иммунофлуоресцентного окрашивания макрофагов М1 в примере 11. Каждый график показывает разницу в зависимости от количества дней, прошедших после операции. Графики в каждом ряду показывают результаты в зависимости от направления и расстояния от участка повреждения: 2 и 1 мм со стороны головы и 1 и 2 мм со стороны хвоста. На вертикальных осях указано количество макрофагов на верхних графиках, количество макрофагов М1 на средних графиках и доля макрофагов М1 на нижнем графике. На горизонтальных осях указано количество дней, прошедших после операции по созданию модели повреждения спинного мозга. CTR относится к не подвергшейся лечению группе, и MeCbl относится к группе лечения метилкобаламином. Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием U-критерия Манна-Уитни (CTR vs. MeCbl) имел значение р менее 0,05, и "**" означают, что результат имел значение р менее 0,01.

На фиг.20 показаны результаты иммунофлуоресцентного окрашивания макрофагов М2 в примере 11 и в остальном они такие же, как на фиг. 19.

На фиг.21 показаны результаты иммунофлуоресцентного окрашивания для отношения M1/M2 в примере 11. Каждый график показывает разницу в зависимости от количества дней, прошедших после операции. Графики показывают результаты в зависимости от направления и расстояния от участка повреждения: 2 и 1 мм со стороны головы и 1 и 2 мм со стороны хвоста. На вертикальных осях указано отношение M1/M2. На горизонтальных осях указано количество дней, прошедших после операции по созданию модели повреждения спинного мозга. CTR относится к не подвергшейся лечению группе, и MeCbl относится к группе лечения метилкобаламином. Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием U-критерия Манна-Уитни (CTR vs. MeCbl) имел значение р менее 0,05, и "**" означают, что результат имел значение р менее 0,01.

На фиг.22 показаны результаты иммунофлуоресцентного окрашивания для отношения M1/M2 в примере 11. Каждый график показывает разницу в зависимости от положения. На графиках слева показаны результаты через 7, 14 и 28 дней после операции по созданию модели повреждения спинного мозга. На вертикальных осях указано отношение M1/M2. На горизонтальных осях указано количество дней, прошедших после операции по созданию модели повреждения спинного мозга. На горизонтальных осях указано направление и расстояние от участка повреждения. CTR относится к не подвергшейся лечению группе, и MeCbl относится к группе лечения метилкобаламином. Звездочка "*" означает, что результат статистического анализа с использованием U-критерия Манна-Уитни (CTR vs. MeCbl) имел значение р менее 0,05, и "**" означают, что результат имел значение р менее 0,01.

На фиг. 23 показаны результаты теста вращающегося стержня в примере 12. На горизонтальной оси указано количество дней, прошедших после операции, вызвавшей церебральный инфаркт, и на вертикальной оси указано относительное время до тех пор, пока модель-мышь не упала с вращающегося стержня. CTR относится к не подвергшейся лечению группе, и MeCbl относится к группе лечения метилкобаламином. Две звездочки «**» означают, что результат статистического анализа с использованием U-критерия Манна-Уитни (CTR vs. MeCbl) имел значение р менее 0,01.

[Способ осуществления изобретения]

[0036]

Как используется в настоящем документе выражения "содержащий" и "включающий" охватывают понятия "содержащий", "включающий", "существенно содержащий" и "состоящий из".

[0037]

Как используется в настоящем документе термин «макрофаг/микроглия» относится к «макрофагам и/или микроглии» и охватывает как значение «макрофаги и микроглия», так и значение «макрофаги или микроглия».

[0038]

В одном аспекте настоящее изобретение относится к терапевтическому средству для лечения заболеваний нервной системы, средству, ингибирующему апоптоз, средству, ингибирующему некроз, средству, промотирующему рост аксона, средству, промотирующему индукцию макрофага/микроглии M2, средству, ингибирующему индукцию макрофага/микроглии M1, средству, промотирующему регенерацию нервов, или тому подобное, которое включает витамин B₁₂ (в настоящем документе также может упоминаться как «средство по настоящему изобретению»). Эти средства будут описаны ниже.

[0039]

1. Активный ингредиент

Витамин B₁₂ включает кобаламин, его производные и соли вышеуказанного. Конкретные примеры витамина B₁₂ включают кобаламин, продукт замещения кобальта кобаламином и его производные. Более конкретные примеры включают метилкобаламин, цианокобаламин, гидроксокобаламин, сульфитокобаламин, аденозилкобаламин, и их соли. Среди них, метилкобаламин, цианокобаламин, гидроксокобаламин, и их соли являются предпочтительными, и метилкобаламин его соли являются более предпочтительными.

[0040]

Соли кобаламина и их производные конкретно не ограничены, при условии, что соли являются фармакологически приемлемыми, и могут быть использованы как кислые, так и основные соли. Примеры кислых солей включают соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, нитраты и фосфаты; соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, тартраты, фумараты, малеаты, малаты, цитраты, метансульфонаты и п-толуолсульфонаты; и соли аминокислот, такие как аспартаты и глутаматы. Примеры основных солей включают соли щелочных металлов, такие как соли натрия и соли калия; и соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и соли магния.

[0041]

Витамин В₁₂ может быть в форме сольватов. Растворители конкретно не ограничены, если они являются фармакологически приемлемыми, и примеры включают воду, этанол, глицерин и уксусную кислоту.

[0042]

В качестве витамина B₁₂ один тип может использоваться отдельно или два или более типа могут использоваться в комбинации.

[0043]

2. Применение

Витамин В₁₂ оказывает терапевтический эффект на заболевания нервной системы. Следовательно, витамин B₁₂ можно использовать в качестве активного ингредиента в терапевтическом средстве при заболеваниях нервной системы.

[0044]

Витамин B₁₂ обладает ингибирующим апоптоз действием, ингибирующим некроз действием, промотирующим рост аксонов действием, действием, промотирующим индукцию макрофага/микроглии М2, действием, ингибирующим индукцию макрофага/микроглии M1, промотирующим регенерацию нервов действием, и тому подобное. Следовательно, витамин B₁₂ можно использовать в качестве активного ингредиента средств, таких как средство, ингибирующее апоптоз, средство, ингибирующее некроз, средство, промотирующее рост аксона, средство, промотирующее индукцию макрофага/микроглии M2, средство, ингибирующее индукцию макрофага/микроглии M1, средство, промотирующее регенерацию нервов, средство, восстанавливающее отношение M1:M2 (отношение макрофаг/микроглия M1 к макрофагу/микроглии M2), или средство, промотирующее регенерацию нервов.

[0045]

Кроме того, витамин B₁₂ может быть использован в качестве активного ингредиента в предпочтительной форме терапевтического средства для лечения заболеваний нервной системы, который является активным ингредиентом в терапевтическом средстве для лечения заболеваний нервной системы на основе по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из ингибирующего апоптоз действия, ингибирующего некроз действия, промотирующего рост аксонов действия, действия, промотирующего индукцию макрофага/микроглии М2, действия, ингибирующего индукцию макрофага/микроглии M1 и промотирующего регенерацию нервов действия.

[0046]

Заболевание нервной системы конкретно не ограничено и включает заболевание центральной нервной системы и заболевание периферической нервной системы. Примеры заболевания центральной нервной системы включают цереброваскулярное заболевание и повреждение центральной нервной системы.

[0047]

Примеры цереброваскулярного заболевания включают церебральный инфаркт, внутримозговое кровоизлияние, церебральный тромбоз, церебральный атеросклероз и деменцию.

[0048]

Повреждение нерва может быть повреждением периферического нерва или повреждением центрального нерва. Повреждение центрального нерва включает повреждение спинного мозга. Причины повреждения нерва особо не ограничены, и могут быть задействованы повреждения нерва по различным причинам, таким как травматическое повреждение, давление, вызванное гипсовой повязкой, повреждение электричеством, грыжа диска или облучение. Тяжесть соответствующих повреждений нервов особо не ограничена, и соответствующие случаи включают все случаи, включая случай, когда аксоны сохранены, но произошла демиелинизация, случай, когда сопровождается Валлеровой дегенерации, и случай, когда нервы разделены анатомически. Повреждение нерва охватывает различные симптомы, связанные с повреждением нерва, включая, например, дискинезию (например, двигательный паралич и мышечную слабость в верхних и нижних конечностях), сенсорное расстройство (например, гипестезия, онемение и боль), расстройство вегетативной нервной системы (например, дисгидроз, изменение цвета кожи) или тому подобное в поврежденной области иннервации.

[0049]

Заболевание нервной системы предпочтительно представляет собой заболевание нервной системы, которое можно лечить посредством по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из ингибирующего апоптоз действия, ингибирующего некроз действия, промотирующего рост аксонов действия, действия, промотирующего индукцию макрофага/микроглии М2, действия, ингибирующего индукцию макрофага/микроглии M1, и промотирующего регенерацию нервов действия.

[0050]

Средство по настоящему изобретению конкретно не ограничено, при условии, что средство содержит витамин B₁₂ (используемый в настоящем описании, может упоминаться просто как «активный ингредиент») и может содержать другие ингредиенты, при необходимости. Другие ингредиенты не ограничены, если они являются фармакологически приемлемыми. Другие ингредиенты включают добавки в дополнение к ингредиенту, обладающему фармакологическим действием. Примеры добавок включают основы, носители, растворители, диспергаторы, эмульгаторы, буферы, стабилизаторы, эксципиенты, связующие, разрыхрители, смазывающие вещества, загустители, увлажнители, красители, ароматизаторы и хелатирующие агенты.

[0051]

Витамин В₁₂, используемый отдельно, может оказывать терапевтическое действие при заболеваниях нервной системы, ингибирующее апоптоз действие, ингибирующее некроз действие, промотирующее рост аксонов действие, действие, промотирующее индукцию макрофага/микроглии М2, действие, ингибирующее индукцию макрофага/микроглии M1 (здесь не исключается эффект переключения макрофага/микроглии M1 на макрофаг/микроглию M2), промотирующее регенерацию нервов действие, и тому подобное. Следовательно, средство по настоящему изобретению может оказывать желаемый эффект без содержания других ингредиентов, имеющих эти эффекты и/или действия. Однако средство по настоящему изобретению может содержать другие ингредиенты, обладающие фармакологическим действием.

[0052]

Способы применения для средства по настоящему изобретению конкретно не ограничены, и подходящий способ применения может быть выбран в соответствии с типом средства. Средство по настоящему изобретению может быть использовано in vitro (например, добавлено в среду культивируемых клеток) или in vivo (например, введено животным), например, в зависимости от цели.

[0053]

Цели для применения средства по настоящему изобретению конкретно не ограничены. Примеры целевых млекопитающих включают человека, обезьян, мышей, крыс, собак, кошек, кроликов, свиней, лошадей, крупный рогатый скот, овец, коз и оленей. Примеры клеток-мишеней включают клетки животных. Типы клеток также особо не ограничены, и примеры включают клетки крови, гемопоэтические стволовые клетки, клетки-предшественники, гаметы (сперматозоиды и яйцеклетка), фибробласты, эпителиальные клетки, сосудистые эндотелиальные клетки, нервные клетки, клетки печени, кератиноциты, мышечные клетки, эпидермальные клетки, эндокринные клетки, клетки ES, клетки iPS, стволовые клетки ткани и раковые клетки.

[0054]

Средство по настоящему изобретению может быть в любой лекарственной форме. Примеры лекарственной формы включают лекарственные формы для перорального применения, такие как таблетки (включая таблетки, диспергируемые в полости рта, жевательные таблетки, пенные таблетки, пастилки и желатиновые составы в виде капель), пилюли, гранулы, мелкие гранулы, порошки, твердые капсулы, мягкие капсулы, препараты сухого сиропа, жидкости (включая питьевые лекарственные формы, суспензии и сиропы) и желеобразные лекарственные формы; и парентеральные лекарственные формы, такие как составы для инъекций (например, капельное вливание [например, лекарственные формы для внутривенного капельного вливания], внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции, подкожные инъекции и внутрикожные инъекции), средства для местного применения (например, мази, пластыри и лосьоны), суппозитории, лекарственные формы для ингаляции, офтальмологические составы, офтальмологические мази, капли для носа, ушные капли и липосомальные лекарственные формы.

[0055]

Способы введения средства по настоящему изобретению конкретно не ограничены, при условии, что может быть достигнут желаемый эффект, и примеры включают пероральное введение и парентеральное введение, включая энтеральное введение, такое как введение с помощью зонда для кормления и клизмы, внутривенное введение, внутриартериальное введение, внутримышечное введение. введение, интракардиальное введение, подкожное введение, внутрикожное введение и внутрибрюшинное введение.

[0056]

Содержание активного ингредиента в средстве по настоящему изобретению не ограничено и варьируется в зависимости от способа использования, цели применения, условий цели применения, и тому подобное. Например, содержание может составлять от 0,0001 до 100% масс. и предпочтительно от 0,001 до 50% масс.

[0057]

Доза средства по настоящему изобретению для введения животным конкретно не ограничена, если доза представляет собой эффективную дозу, которая дает лечебный эффект. Обычная доза (масса активного ингредиента) составляет от 0,1 до 1000 мг/кг массы тела в день и предпочтительно от 0,5 до 500 мг/кг массы тела в день для перорального введения; и от 0,01 до 100 мг/кг массы тела в день и предпочтительно от 0,05 до 50 мг/кг массы тела в день для парентерального введения. Вышеописанные дозы могут быть соответствующим образом скорректированы в зависимости от возраста, патологических состояний и симптомов.

[0058]

Средство по настоящему изобретению предпочтительно используют при непрерывном введении с точки зрения дополнительного эффективного достижения действия, промотирующего индукцию макрофага/микроглии М2, действия, ингибирующего индукцию макрофага/микроглии M1, промотирующего регенерацию нервов действия или тому подобного. При непрерывном введении концентрация активного ингредиента, который действует на клетки-мишени для введения (например, клетки в пораженном участке заболевания нервной системы, предпочтительно макрофаг/микроглия), может поддерживаться в пределах концентраций, подходящих для достижения действия, промотирующего индукцию макрофага/микроглии М2, действия, ингибирующего индукцию макрофага/микроглии M1, и промотирующего регенерацию нервов действия (например, 5-100 мкМ, предпочтительно 10-50 мкМ, более предпочтительно 20-10 мкМ, еще более предпочтительно 50-5 мкМ и наиболее предпочтительно 100-1 мкМ), и эффекты могут быть достигнуты более эффективно. Кроме того, средство по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой капельную инфузию и, более предпочтительно, лекарственную форму для внутривенного капельного вливания, хотя в зависимости от цели применения.

[0059]

Время введения средства по настоящему изобретению особо не ограничено.

[0060]

В качестве примера используют средство по настоящему изобретению таким образом, что введение средства начинают через 12-24 часа после начала заболевания. Начало представляет собой время, когда симптом заболевания или фактор, непосредственно вызывающий заболевание, могут быть распознаны. Например, начало представляет собой время, когда развивается ишемическое поражение при ишемическом цереброваскулярном заболевании, таком как церебральный инфаркт. Поскольку средство по настоящему изобретению может действовать на механизм репарации, который может действовать относительно долго после развития ишемического поражения (действие, промотирующее индукцию макрофага/микроглии М2, действие, ингибирующее индукцию макрофага/микроглии M1, и промотирующее регенерацию нервов действие), терапевтические эффекты могут быть достигнуты, даже если средство вводят в описанные выше сроки (через 12-24 часа после начала) при введении средства при ишемическом цереброваскулярном заболевании, таком как церебральный инфаркт.

[0061]

В качестве другого примера, средство по настоящему изобретению используется так, что введение средство начинают во время острой фазы (например, сразу после начала или в течение 12 часов после начала) заболевания нервной системы, такого как повреждение нерва (предпочтительно повреждение спинного мозга). Начало представляет собой время, когда симптом заболевания или фактор, непосредственно вызывающий заболевание, могут быть распознаны. Например, при повреждении нерва, например, при повреждении спинного мозга, начало представляет собой время, когда поврежден нерв.

[Примеры]

[0062]

Настоящее изобретение будет подробно описано ниже на основе примеров, но настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

[0063]

Пример 1. Ингибирующее апоптоз действие на церебральные кортикальные нейроны

Ингибирующее апоптоз действие метилкобаламина на церебральные кортикальные нейроны исследовали с помощью TUNEL-анализа. В частности, исследование проводили следующим образом.

[0064]

<Пример 1-1. Получение церебральных кортикальных нейронов>

Церебральные кортикальные нейроны собирали и культивировали обычным способом. Кору головного мозга вскрывали у плода крысы Sprague-Dawley (SD) (18-й день беременности) и извлекали в охлажденную льдом среду Игла, модифицированную по Дульбекко (DMEM), содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин/стрептомицин. Мягкую мозговую оболочку и кровеносные сосуды удаляли, и оставшуюся кору головного мозга переносили в DMEM (содержащий 1% пенициллин/стрептомицин и без FBS) и разрезали на маленькие кусочки размером 1 мм хирургическими ножницами. Папаин (конечная концентрация, 2 мг/мл) добавляли к смеси клеток, и смеси давали реагировать при 37°С в течение 30 минут. К реакционной смеси добавляли ДНКазу I (70 Ед/мл) и реакцию проводили в течение 30 секунд. Затем DMEM, содержащий 10% FBS и 1% пенициллин/стрептомицин, добавляли для прекращения реакции. Смесь клеток центрифугировали при 800 об/мин, остаток повторно суспендировали в DMEM, содержащей 10% FBS и 1% пенициллин/стрептомицин, и суспензию высевали на чашку, покрытую поли-L-лизином (PLL). Через 4 часа после посева клеток среду заменяли средой Neurobasal (содержащей 10% добавки B27 и 1% пенициллин/стрептомицин).

[0065]

<Пример 1-2. TUNEL-анализ>

К церебральным кортикальным нейронам (пример 1-1), культивируемым на 8-луночном предметном стекле с покрытием PLL, добавляли 20 мМ глутаминовую кислоту и 10 мкМ метилкобаламина (MeCbl). Через 18 часов долю апоптотических клеток оценивали с использованием флуорометрической системы Promega's DeadEnd Fluorometric TUNEL System. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) при 4°C в течение 25 минут. После того, как клетки пермеабилизировали 0,2% Triton X-100 в течение 5 минут, добавляли инкубационный буфер и смесь оставляли стоять при 37°C с защитой от света в течение 60 минут, чтобы пометить пермеабилизированные клетки. Ядра были помечены 4'6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). Определяли общее количество клеток и количество TUNEL-положительных клеток.

[0066]

<Пример 1-3. Результаты>

Результаты показаны на фиг. 1. Значения, соответствующие данным на графике фиг. 1, приведены в таблице 1. В TUNEL-анализе, когда добавляли только метилкобаламин, доля апоптотических клеток (%) была аналогична таковой в контроле. Когда добавляли только глутаминовую кислоту, доля апоптотических клеток значительно увеличивалась. Однако, когда метилкобаламин добавляли вместе с глутаминовой кислотой, доля апоптотических клеток значительно снижалась до уровня контроля.

[0067]

[Таблица 1]

Глутамат - - + + MeCbl - + - + Cреднее 6,0 5,9 15,0 5,6 Cтандартная ошибка 1,2 1,3 1,3 0,6 Cтандартное отклонение 2,0 2,2 2,2 1,1

[0068]

Пример 2. Ингибирующее некроз действие на церебральные кортикальные нейроны

Ингибирующее некроз действие метилкобаламина на церебральные кортикальные нейроны оценивали с помощью анализа LDH. В частности, исследование проводили следующим образом.

[0069]

<Пример 2-1. Анализ LDH>

К церебральным кортикальным нейронам (пример 1-1), культивируемым на 6-луночном предметном стекле с покрытием PLL, добавляли 10 мкM метилкобаламина за 30 минут до воздействия стресса кислородно-глюкозной депривации (OGD). N-метил-D-аспарагиновую кислоту (NMDA) добавляли к высокому контролю в качестве эталона. Среду заменили сбалансированным солевым раствором Эрла (EBSS), и нейроны подвергались стрессу OGD в атмосфере с концентрацией кислорода 1% в течение 3 часов. Среду заменили сбалансированным солевым раствором Эрла (EBSS), и нейроны подвергали стрессу OGD в атмосфере с концентрацией кислорода 1% в течение 3 часов. Нейроны возвращали в нормальную среду и атмосферу с нормальной концентрацией кислорода. Через 24 часа супернатант собирали и активность LDH измеряли с использованием набора для определения цитотоксичности Cytotoxicity Detection Kit^PLUS (SIGMA). Активность LDH в контрольной группе и группе добавления метилкобаламина рассчитывали как пропорции (%) по отношению к активности LDH в группе высокого контроля.

[0070]

<Пример 2-2. Результаты>

Результаты показаны на фиг. 2. Значения, соответствующие данным на графике фиг. 2, приведены в таблице 2. В анализе LDH в условиях стресса OGD доля активности LDH в группе добавления метилкобаламина по отношению к высокому контролю была значительно снижена по сравнению с таковой в контрольной группе.

[0071]

[Таблица 2]

MeCbl(-) MeCbl(+) Cреднее 3,1 1,3 Cтандартная ошибка 0,6 0,5 Cтандартное отклонение 1,0 0,8

[0072]

Пример 3. Промотирующее рост аксонов действие на церебральные кортикальные нейроны

Промотирующее рост аксонов действие метилкобаламина на церебральные кортикальные нейроны исследовали с помощью анализа роста нейритов. В частности, исследование проводили следующим образом.

[0073]

<Пример 3-1. Анализ удлинения нейритов>

Церебральные кортикальные нейроны (пример 1-1) высевали, и лекарственное средство добавляли в различных концентрациях через 24 часа. Концентрации добавленного метилкобаламина составляли 1, 10 и 100 нМ и 1, 10 и 100 мкМ. Через 72 часа после посева клеток проводили иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием анти-TuJ1 антитела и измеряли длину аксонов (самая длинная длина нейрита на нейрон). Измерение проводили на клетках, которые не были в контакте с другими клетками. При каждой оценке измеряли не менее 30 нейронных аксонов, а среднее из полученных значений было рассчитано и обозначено как измеренное значение.

[0074]

<Пример 3-2. Результаты>

Результаты показаны на фиг. 3. Значения, соответствующие данным на графике фиг. 3, приведены в таблице 3. Результаты анализа роста нейритов показали тенденции к стимулированию роста аксонов в зависимости от концентрации с пиком при концентрации метилкобаламина 10 мкМ. При концентрациях 1 и 10 мкМ рост аксонов был значительно увеличен по сравнению с контрольной группой, не содержащей лекарственного средства.

[0075]

[Таблица 3]

[0076]

Пример 4. Эффект уменьшения объема ишемического повреждения мозга

Эффект метилкобаламина, уменьшающий объем ишемического повреждения мозга, исследовали с использованием метода окрашивания 2,3,5-трифенилтетразолий хлоридом (ТТС). В частности, исследование проводили следующим образом.

[0077]

<Пример 4-1. Конструирование транзиторной модели окклюзии средней мозговой артерии (tMCAO) и введение лекарственного средства>

Использовали самцов мышей C57BL/6J в возрасте от 8 до 9 недель (около 24 г). Зонд для лазерного доплеровского измерителя объемного кровотока помещали на правую часть черепа так, чтобы можно было контролировать кровоток в средней мозговой артерии. Правую область шеи разрезали и открывали, а наружную сонную артерию перевязывали. Затем общую сонную артерию разрезали, и в общую сонную артерию вставляли нейлоновая нить, и кончик продвигали вперед, в то время как кровоток проверяли с помощью монитора кровотока. Когда кончик достиг бифуркации средней мозговой артерии и наблюдалось уменьшение кровотока, это состояние сохраняли в течение 1 часа при ректальной температуре 37°C. Затем удаляли нейлоновую нить и перевязывали общую сонную артерию. Для непрерывного введения метилкобаламина, осмотический мининасос помещали и оставляли в дорсальном подкожном пространстве. После построения модели, метилкобаламин вводили в дозе 1 мг/кг/день. В не подвергшейся лечению группе вводили физиологический раствор вместо метилкобаламина в соответствии с той же процедурой. После операции температуру поддерживали с ректальной температурой 37°С, пока мышь не оправилась от анестезии.

[0078]

<Пример 4-2. Метод окрашивания ТТС>

Через 2 дня после операции мышь (пример 4-1) умерщвляли и удаляли головной мозг. Головной мозг разрезали с интервалами 1 мм для получения коронарных срезов, и разрезанные срезы погружали в 2% раствор ТТС на 30 минут. Изображения получали с помощью стереоскопического микроскопа, рассчитывали площадь ишемического повреждения в каждом срезе и суммировали все площади ишемического повреждения срезов головного мозга для расчета объема ишемического повреждения. Площадь ишемического поражения в каждом срезе рассчитывали по следующей формуле: площадь непораженного полушария - площадь неповрежденной части пораженной стороны.

[0079]

<Пример 4-3. Результаты>

Результаты показаны на фиг. 4. Значения, соответствующие данным на графике фиг. 4, приведены в таблице 4. Через 2 дня после операции tMCAO объем ишемического поражения головного мозга оценивали с использованием окрашивания TTC. В группе, получавшей лечение метилкобаламином, объем ишемического повреждения значительно уменьшился примерно на 1/2 по сравнению с контрольной группой.

[0080]

[Таблица 4]

Контроль MeCbl Cреднее 59,1 28,8 Cтандартная ошибка 8,0 3,2 Cтандартное отклонение 22,6 9,0

[0081]

Пример 5. Действие, промотирующее индукцию макрофагов М2, и действие, ингибирующее индукцию макрофагов М1

Действие, промотирующее индукцию макрофагов М2, и действие, ингибирующее индукцию макрофагов М1, метилкобаламина исследовали методом вестерн-блоттинга и методом иммуногистологического анализа. В частности, исследование проводили следующим образом.

[0082]

<Пример 5-1. Получение клеточной линии макрофагов>

Клеточную линию мышиных макрофагов J774A.1 (JCRB9108) была приобретена JCRB Cell Bank (Laboratory of Cell Cultures), Osaka, Japan. Клетки культивировали в DMEM, содержащей 10% FBS и 1% пенициллин/стрептомицин.

[0083]

<Пример 5-2. Вестерн-блоттинг>

Клетки J774A.1 (пример 5-1) высевали на чашку диаметром 6 см. Через 4 дня белки собирали с использованием буфера для лизиса клеток, содержащего смесь ингибиторов протеаз. Концентрацию белка измеряли с помощью анализа BCA. Затем 50 мкг каждого образца подвергали SDS-PAGE, и электрофоретические белки переносили на поливинилидендифторидную мембрану. Мембрану блокировали блокирующим буфером в течение 1 часа, а затем белкам давали взаимодействовать с первичными антителами при 4°С в течение ночи. Затем белкам давали возможность взаимодействовать с вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа и детектировали с использованием системы ECL Western Blotting Detection System. Для обнаружения маркеров M1 iNOS и IL-1β липополисахарид (LPS) (100 нг/мл) и метилкобаламин добавляли за 24 часа до сбора белков. Для обнаружения маркеров M2 Arg1 и CD206, IL-4 (20 нг/мл) и метилкобаламин добавляли за 72 часа до сбора белков.

[0084]

В качестве первичных антител использовали кроличьи поликлональные антитела против IL-1 (Santa Cruz), кроличьи моноклональные антитела против iNOS (Abcam), кроличьи поликлональные антитела против Arg1 (Santa Cruz), и кроличьи моноклональные антитела против CD206 (Abcam). В качестве вторичного антитела использовали анти-кроличьи IgG, полное антитело, связанное с пероксидазой хрена, из осла (GE Healthcare Life Sciences).

[0085]

<Пример 5-3. Метод иммуногистологического анализа>

Клетки J774A.1 (пример 5-1) высевали на чашку диаметром 6 см. Через 4 дня клетки фиксировали 4% PFA в течение 20 минут. Блокирование проводили в течение 30 минут, и клеткам давали взаимодействовать с первичными антителами при 4°С в течение ночи. Затем клеткам давали возможность взаимодействовать с вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа, для того, чтобы ядра были помечены DAPI. Для обнаружения маркера M1 iNOS, LPS (100 нг/мл) и метилкобаламин добавляли за 24 часа до фиксации клеток. Для обнаружения маркера M2 Arg1, IL-4 (20 нг/мл) и метилкобаламин добавляли за 72 часа до фиксации клеток.

[0086]

В качестве первичных антител использовали кроличье моноклональное антитело против iNOS (Abcam) и кроличье поликлональное антитело против Arg1 (Santa Cruz). В качестве вторичного антитела использовали козье антитело к кроличьему IgG, меченное Alexa 488 (Life Technologies), или козье антитело к кроличьему IgG, меченное Alexa 568 (Life Technologies).

[0087]

<Пример 5-4. Результаты>

Результаты вестерн-блоттинга показаны на фиг. 5 и 6. Значения, соответствующие данным на графиках на фиг. 5, показаны в таблице 5, и значения, соответствующие данным на графиках на фиг. 6, показаны в таблице 6. Уровни маркера M1 были следующими: по сравнению с одним LPS уровень IL-1β значительно снижался при добавлении 100 нМ метилкобаламина в комбинации, и уровень iNOS значительно снижался при добавлении от 100 нМ до 10 мкМ метилкобаламина в комбинации. По сравнению с одним IL-4 уровень маркера M2 Arg1 значительно повышался при добавлении 100 нМ и 1 мкМ метилкобаламина в комбинации. Пики уровней CD206 наблюдали при добавлении метилкобаламина при 100 нМ до 1 мкМ.

[0088]

[Таблица 5]

[0089]

[Таблица 6]

[0090]

Результаты иммуногистологического анализа показаны на фиг. 7. Значения, соответствующие данным на графиках на фиг. 7, показаны в таблице 7. По сравнению с одним LPS, доля клеток, положительных по маркеру M1 iNOS, была значительно снижена при добавлении от 10 нМ до 100 мкМ метилкобаламина в комбинации. По сравнению с добавлением только IL-4 доля клеток, положительных по маркеру M2 Arg1, значительно увеличивалась при добавлении от 10 нМ до 1 мкМ метилкобаламина в комбинации.

[0091]

При иммунофлуоресцентном окрашивании наблюдали переход от М1 к М2 с пиком около 100 нМ метилкобаламина, как в вышеописанном вестерн-блоттинге.

[0092]

[Таблица 7]

[0093]

Пример 6. Анализ механизма действия индукции макрофагов

Анализировали механизм индукции макрофага (пример 5) метилкобаламином. В частности, анализ проводили следующим образом. Через 30 минут после добавления IL-4 и метилкобаламина (100 нМ и 1 мМ) активацию Akt, 4EBP1 и S6K в пути Akt-mTOR (одном из основных сигнальных путей, который индуцирует экспрессию гена M2) оценивали с помощью вестерн-блоттинга. На этом пути фосфорилирование Akt происходит в ответ на восходящий сигнал, а фосфорилирование 4EBP1 и фосфорилирование S6K далее происходят через mTORC1 в нисходящем направлении. Фосфорилирование S6K обеспечивает отрицательную обратную связь с восходящим сигнальным путем. Вестерн-блоттинг осущствляли, как в примере 5-2, за исключением того, что за 30 минут до сбора белков добавляли IL-4 (20 нг/мл), метилкобаламин и RAD001 (200 нМ) и первичные антитела для обнаружения меняли.

[0094]

Результаты показаны на фиг. 8-1, 8-2, и 8-3. Значения, соответствующие данным на графиках на фиг. 8-1, 8-2, и 8-3, показаны в таблице 8. Когда добавляли IL-4, наблюдали активацию Akt и как 4EBP1, так и S6K в нисходящем направлении. По сравнению с одним IL-4 активация 4EBP1 и активация S6K усиливались, когда IL-4 и 100 нМ метилкобаламина использовали в комбинации. Однако когда концентрация метилкобаламина составляла 1 мМ, активность Akt в восходящем направлении снижалась, хотя 4EBP1 и S6K были активированы. Когда RAD001, который является ингибитором mTOR, дополнительно добавляли в дополнение к IL-4 и метилкобаламину, активность Akt в восходящем направлении восстановливалась, и активность 4EBP1 и S6K в нисходящем направлении ослаблялась. Таким образом, был предложен механизм, в котором активность Akt по индукции гена M2 в восходящем направлении подавлялась механизмом отрицательной обратной связи в нисходящем направлении при добавлении высокой концентрации метилкобаламина.

[0095]

[Таблица 8]

[0096]

Пример 7. Анализ фенотипов макрофагов после повреждения седалищного нерва

Эффекты метилкобаламина на фенотип макрофагов после повреждения седалищного нерва анализировали методом иммуногистологического анализа. В частности, анализ проводили следующим образом. Используя поперечные срезы нерва на расстоянии 2,5 мм в проксимальном направлении, в месте повреждения, и на расстоянии 2,5, 5,0 и 7,5 мм в дистальном направлении, макрофаги оценивали иммунофлуоресцентным окрашиванием через 1, 3, 7 и 14 дней после повреждения седалищного нерва. Проксимальное направление относится к стороне тела клетки аксона относительно места повреждения, а дистальное направление относится к конечной стороне аксона относительно места повреждения. Каждое из расстояний указывает расстояние от места повреждения (то же самое относится к примеру 8). Макрофаги метили CD68, маркером M1 iNOS и маркером M2 CD206. Долю макрофагов М1 рассчитывали по следующей формуле: доля макрофагов М1 (%) = количество М1-маркер положительных макрофагов на мм²/количество макрофагов на мм² × 100. Более подробное описание будет предоставлено ниже.

[0097]

<Пример 7-1. Хирургическое лечение (модель повреждения седалищного нерва у крыс)>

Использовали шестинедельных самцов крыс Wistar (около 200 г). Левый седалищный нерв выводили наружу, и повреждение раздавливанием седалищного нерва осуществляли на проксимальной стороне с помощью щипцов. Нерв раздавливали в течение 10 секунд три раза с 10-секундными интервалами. Фасцию и кожу зашивали с использованием 3-0 нейлона. Сравнивали группу без повреждения, которая подверглась только обнажению седалищного нерва, группу без лечения и группу, получавшую лечение метилкобаламином. Для непрерывного введения метилкобаламина, осмотический мининасос помещали и оставляли в дорсальном подкожном пространстве, и метилкобаламин вводили в дозе 1 мг/кг/день. В группе, не получавшей лечение, вводили физиологический раствор вместо метилкобаламина по той же методике.

[0098]

<Пример 7-2. Морфологический и гистологический анализ>

Через 1, 3, 7 и 14 дней после операции крыс анестезировали анестезирующим средством. Левый седалищный нерв собирали, фиксировали 4% PFA в течение 7 дней и 20% сахарозой в течение 24 часов, и фиксированный нерв замораживали. Залитую ткань разрезали на срез толщиной 5 мкм в направлении по короткой оси нерва и помещали на предметное стекло. Срезы получали из 5 положений 2,5 мм в проксимальном направлении от поврежденной области, поврежденной области и 2,5, 5,0 и 7,5 мм в дистальном направлении. Срезы сушивали в течение 1 часа и фиксировали 95% метанолом в течение 30 минут. Фиксированные срезы блокировали и давали взаимодействовать с первичными антителами при 4°С в течение ночи. Затем клеткам давали возможность взаимодействовать с вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа, для того, чтобы ядра были помечены DAPI.

[0099]

В качестве первичных антител использовали мышиное моноклональное антитело против CD68 (Abcam), кроличье моноклональное антитело против iNOS (Abcam), кроличье моноклональное антитело против CD206 (Abcam), кроличье поликлональное антитело против нейрофиламента 200 (NF 200) (SIGMA) и мышиное моноклональное антитело против основного белка миелина (MBP) (Calbiochem). В качестве вторичных антител использовали козье антитело против мышиного IgG, меченное Alexa 488 (Life Technologies), козье антитело против кроличьего IgG, меченное Alexa 488 (Life Technologies), козье антитело против мышиного IgG, меченное Alexa 568 (Life Technologies) и козье антитело против кроличьего IgG, меченное Alexa 568 (Life Technologies).

[0100]

<Пример 7-3. Результаты>

Результаты показаны на фиг. 9 и 10. Значения, соответствующие данным на графиках на фиг. 9, показаны в таблицах 9-1, 9-2, и 9-3, и значения, соответствующие данным на графиках на фиг. 10, показаны в таблицах 10-1, 10-2 и 10-3. В группе, получавшей метилкобаламин, количество макрофагов, накопленных в месте повреждения, было значительно снижено через 3, 7 и 14 дней после операции по сравнению с группой, не получавшей лечение. В дистальных положениях число макрофагов было увеличено за местом повреждения, и через 14 дней после операции была значительная разница.

[0101]

В группе, получавшей лечение метилкобаламином, количество макрофагов М1 значительно снижалось во все дни оценки. В дистальных отделах были значительные различия через 7 и 14 дней после операции. Аналогичные тенденции наблюдали для долей макрофагов М1.

[0102]

В группе, получавшей лечение метилкобаламином количество макрофагов М2 значительно увеличилось через 1, 7 и 14 дней после операции в месте повреждения. Была значительная разница при 5 мм в дистальном направлении через 7 дней после операции и при 7,5 мм в дистальном направлении через 7 и 14 дней после операции. Аналогичные тенденции наблюдали для долей макрофагов М2.

[0103]

[Таблица 9-1]

[0104] [Таблица 9-2]

[0105] [Таблица 9-3]

[0106] [Таблица 10-1]

[0107] [Таблица 10-2]

[0108] [Таблица 10-3]

[0109]

Пример 8. Анализ регенерации нерва после повреждения седалищного нерва

Влияние метилкобаламина на регенерацию нерва после повреждения седалищного нерва анализировали методом иммуногистологического анализа. В частности, анализ проводили следующим образом. Для анализа использовали поперечные срезы поврежденного седалищного нерва, полученные через 2 недели после повреждения седалищного нерва. Как и при анализе макрофагов, анализ проводили для срезов на расстоянии 2,5 мм в проксимальном направлении от места повреждения, место повреждения и 2,5, 5,0 и 7,5 мм в дистальном направлении. Регенерированные аксоны были помечены NF 200, а миелиновые оболочки были помечены MBP. Процент миелинизации регенерированных аксонов рассчитывали по следующей формуле: Процент миелинизации (%) = количество миелиновых аксонов на мм²/ количество аксонов на мм² × 100. Более конкретно, анализ осуществляли таким же образом, как в Примере 7.

[0110]

Результаты показаны на фиг. 11. Значения, соответствующие данным на графиках на фиг. 11, показаны в таблицах 11-1, 11-2, и 11-3. В группе лечения метилкобаламином количество аксонов и количество миелиновых аксонов были значительно повышено в месте повреждения. Существовали значительные различия в количестве аксонов на 5,0 и 7,5 мм в дистальном направлении, в количестве миелиновых аксонов на 2,5, 5,0 и 7,5 мм в дистальном направлении и в проценте миелинизации на 5,0 и 7,5 мм в дистальном направлении. Эти результаты и результаты в примере 7 показали, что метилкобаламин способствует регенерации нервов противовоспалительным образом путем уменьшения макрофагов М1 и увеличения макрофагов М2 в реальном процессе регенерации нервов.

[0111] [Таблица 11-1]

[0112] [Таблица 11-2]

[0113][Таблица 11-3]

[0114]

Пример 9. Терапевтический эффект на повреждение спинного мозга

Терапевтические эффекты метилкобаламина на повреждение спинного мозга оценивали по шкале Бассо-Битти-Бреснахан (BBB) и тепловой альгезиметрии. В частности, исследование проводили следующим образом.

[0115]

<Пример 9-1. Конструирование модели повреждения спинного мозга у крыс (модель боковой гемисекции) и введение лекарственного средства>

Использовали шестинедельных самок крыс Wistar. Крыс приобретали в Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japan). Анестезию осуществляли следующим образом. Разведение 1:10 смеси трех анестетиков в физиологическом растворе вводили путем внутрибрюшинной инъекции. Одна доза включала 0,2 мг/кг мидазолама, 0,015 мг/кг медетомидина и 0,25 мг/кг буторфанола. Крысу фиксировали в прон-позиции на операционном столе и делали дорсальный срединный разрез. Дужку позвонка T10 удаляли, чтобы обнажить заднюю поверхность спинного мозга, а левый спинномозговой нерв подрезали с использованием острого хирургического скальпеля (spitz mess). Кожу зашивали с помощью нейлоновой нити 4-0 и операцию завершали. Проводили сравнение между тремя группами: группой, получавшей лечение метилкобаламином, группой, не получавшей лечение, и sham-группой. Сразу после хирургической операции осмотический мининасос, заполненный метилкобаламином (1 мг/кг/день) или физиологическим раствором, устанавливали в группе лечения метилкобаламином и группе, не получавшей лечение, соответственно, и оставляли в левом дорсальном подкожном пространстве. Sham-группу подвергали только резекции дужки позвонка Th10.

[0116]

<Пример 9-2. Определение показателя BBB>

Каждую крысу отдельно помещали в клетку, позволяли свободно перемещаться и наблюдали в течение 5 минут. Согласно общепринятому способу, функцию левой нижней конечности оценивали с использованием баллов от 0 (без локомоторной активности) до 21 (нормальная локомоторная активность). Оценки проводили до операции, а также через 1, 7, 14, 21 и 28 дней после операции.

[0117]

<Пример 9-3. Тепловая альгезиметрия>

Каждую крысу помещали в специально отведенную клетку, по отдельности, раздражение инфракрасным излучением применяли к правой подошве и измеряли время, пока крыса не втянула заднюю конечность. Чтобы избежать повреждения кожи, стимуляция продолжали максимум 15 секунд. Оценки проводили до операции, а также через 7, 14, 21 и 28 дней после операции.

[0118]

<Пример 9-4. Результаты>

Баллы ВВВ показаны на фиг.12. Значения, соответствующие данным на графике фиг. 12, приведены в таблице 12. По сравнению с группой, не получавшей лечение, двигательная функция левой нижней конечности была значительно улучшена в группе введения метилкобаламина через 14, 21 и 28 дней после операции.

[0119]

[Таблица 12]

[0120]

Результаты тепловой альгезиметрии показаны на фиг. 13. Значения, соответствующие данным на графике фиг. 13, приведены в таблице 13. В группе лечения метилкобаламином гиперестезия правой нижней конечности была значительно улучшена через 21 и 28 дней после операции.

[0121]

[Таблица 13]

[0122]

Пример 10. Промотирующее индукцию микроглии М2 действие и ингибирующее индукцию микроглии М1 действие

Промотирующее индукцию микроглии М2 действие и ингибирующее индукцию микроглии М1 действие метилкобаламина исследовали методом вестерн-блоттинга. В частности, исследование проводили следующим образом.

[0123]

<Пример 10-1. Вестерн-блоттинг>

К клеточной линии микроглии (6-3 клеток) добавляли LPS (100 нг/мл) и противовоспалительный цитокин IL-4 (20 нг/мл). К смеси добавляли растворы метилкобаламина, каждый из которых имел различную концентрацию в диапазоне от 1 нМ до 1 мМ, и белки выделяли из каждой смеси через 1 и 3 дня после добавления. Осуществляли электрофорез и перенос на мембрану, мембрану блокировали и клеткам давали взаимодействовать с каждым из первичных антител против маркеров M1 (iNOS и IL-1β) и маркеров M2 (Arg1 и CD206) при 4°C в течение ночи. Клеткам давали взаимодействовать со вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа, и полосы детектировали с использованием детектора.

[0124]

В качестве первичных антител использовали антитело против iNOS, антитело против IL-1β, антитело против Arg1 и антитело против CD206 (маннозный рецептор). В качестве вторичного антитела использовали антитело против IgG кролика, HRP-связанный целое Ab овец.

[0125]

<Пример 10-2. Результаты>

Результаты вестерн-блоттинга показаны на фиг. 14-15. Значения, соответствующие данным на графиках на фиг. 14, показаны в таблице 14, и значения, соответствующие данным на графиках на фиг. 15, показаны в таблице 15. Количества провоспалительных (M1) маркеров микроглии были следующими: по сравнению с одним только LPS случая количество белка IL-1β значительно уменьшалось, когда в комбинации добавляли по меньшей мере 1 мкМ метилкобаламин, и количество белка iNOS значительно уменьшалось, когда в комбинации добавляли по меньшей мере 10 нМ метилкобаламина. Количества противовоспалительных (М2) маркеров были следующими: по сравнению с одним IL-4 количество белка Arg1 значительно увеличивалось, когда в комбинации добавляли от 1 нМ до 10 мкМ метилкобаламина. Количество CD206 значительно увеличивалось, когда в комбинации добавляли от 10 нМ до 100 нМ метилкобаламина.

[0126]

[Таблица 14]

[0127]

[Таблица 15]

[0128]

Пример 11. Промотирующее индукцию макрофага М2 действие и ингибирующее индукцию макрофага М1 действие

Исследовали промотирующее индукцию макрофага М2 действие и ингибирующее индукцию макрофага М1 действие. В частности, исследование проводили следующим образом.

[0129]

<Пример 11-1. Иммунофлуоресцентное окрашивание>

Использовали модель повреждения спинного мозга у крысы из примера 9-1. Через 7, 14 и 28 дней после операции крыс анестезировали анестезирующим средством и проводили перфузионную фиксацию с 4% PFA. Затем спинной мозг, включая место повреждения, собирали и фиксировали 20% сахарозой в течение 24 часов, и фиксированный спинной мозг замораживали. Залитую ткань разрезали на срез толщиной 5 мкм в направлении короткой оси нерва и помещали на предметное стекло. Срезы сушили в течение 1 часа и фиксировали 100% метанолом в течение 30 минут. Фиксированные срезы блокировали, и клеткам давали взаимодействовать с первичными антителами при 4°С в течение ночи. Затем клеткам давали возможность взаимодействовать с вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа, для того, чтобы ядра были помечены DAPI.

[0130]

Используя поперечные срезы спинного мозга на пораженной стороне на расстоянии 2 и 1 мм на стороне головы и на 1 и 2 мм на стороне хвоста от места повреждения, количество макрофагов, количество макрофагов М1 (провоспалительного типа), доля макрофагов М1, количество макрофагов М2 (противовоспалительного типа) и доля макрофагов М2 на единицу площади, а также отношение М1/М2 измеряли и рассчитывали.

[0131]

В качестве первичных антител использовали антитело против CD68, антитело против iNOS и антитело против Arg1. В качестве вторичных антител использовали козье антитело против кроличьего IgG, меченное Alexa 488, и козье антитело против мышиных IgG, меченное Alexa 568.

[0132]

<Пример 11-2. Результаты>

Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания показаны на фиг. 16-22. На фиг.16-18 показывают различия в количестве макрофагов, количестве макрофагов М1 (провоспалительного типа), доле макрофагов М1, количестве макрофагов М2 (противовоспалительного типа) и доле макрофагов М2 на единицу площади для каждого положения. На фиг. 19-20 показаны изменения во времени в днях после операции. На фиг. 21 показаны изменения в соотношении M1/M2 со временем в днях после операции. На фиг. 22 показаны изменения в каждом положении. Значения, соответствующие данным на графиках на фиг. 16-18, показаны в таблицах 16-18, соответственно, и значения, соответствующие данным на графиках на фиг. 22, показаны в таблице 19.

[0133]

В группе, получавшей лечение метилкобаламином, наблюдали тенденцию к меньшему количеству накопленных макрофагов на единицу площади по сравнению с группой без лечения. Кроме того, с учетом фенотипов макрофагов, были тенденции к снижению макрофагов М1 и увеличению макрофагов М2. Были значительные различия в некоторых результатах.

[0134]

[Таблица 16]

[0135]

[Таблица 17]

[0136]

[Таблица 18]

[0137]

[Таблица 19]

[0138]

Пример 12. Промотирующее восстановление функции действие метилкобаламина в модели церебрального инфаркта, индуцированного фотокоагуляция

<Пример 12-1. Субъект и способ>

Использовали самцов мышей C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель (около 24 г). Получали модель церебрального инфаркта, индуцированного фотокоагуляцией, для облучения лазерным излучением после введения бенгальского розового. В этой модели череп каждой мыши просверлили, чтобы открыть отверстие, имеющее центр в 2 мм от переднего родничка в направлении наружу. Через 5 минут после введения светочувствительного красителя бенгальского розового правую двигательную область коры головного мозга как центр облучали лазерным излучением для создания церебрального инфаркта в правосторонней двигательной области коры головного мозга. Осмотический насос (осмотические насосы ALZET, для двухнедельной работы) встраивали сразу после создания церебрального инфаркта. Мышей разделяли на группу лечения метилкобаламином (N=3) и группу, не получавшую лечение (N=4), и проводили тесты вращающегося стержня (метод ускорения скорости) через 2, 4, 7, 9, 11 и 14 дней после операции по созданию церебрального инфаркта. Измеряли время до падения мыши с вращающегося стержня и рассчитывали отношение к максимуму 300 секунд в качестве базовой линии.

[0139]

<Пример 12-2. Результаты>

Результаты показаны на фиг. 23. Значение, соответствующее данным на графике фиг. 23, показаны в таблице 20. Через 2, 4 и 9 дней после операции, приводящей к церебральному инфаркту, функция мозга, исследованная в тесте вращающегося стержня, значительно улучшилась в группе, получавшей метилкобаламин, по сравнению с группой, не получавшей лечение.

[0140]

[Таблица 20]

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к использованию метилкобаламина в промотировании регенерации нервов, и может быть использовано в медицине для лечения заболеваний нервной системы. Предложен способ, включающий введение средства, состоящего из метилкобаламина в качестве активного ингредиента посредством непрерывной внутривенной капельной инфузии. Изобретение обеспечивает эффективное лечение такого заболевания нервной системы как церебральный инфаркт или повреждение спинного мозга. 4 з.п. ф-лы, 23 ил., 20 табл., 12 пр.

1. Способ лечения заболевания нервной системы, причем указанный способ включает введение средства, состоящего из метилкобаламина в качестве активного ингредиента, посредством непрерывной внутривенной капельной инфузии, где заболевание нервной системы представляет собой церебральный инфаркт или повреждение спинного мозга.

2. Способ по п. 1, где лечение заболевания нервной системы обеспечивается посредством промотирования индукции макрофага/микроглии М2.

3. Способ по п. 1 или 2, где лечение заболевания нервной системы обеспечивается посредством ингибирования индукции макрофага/микроглии M1.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где лечение заболевания нервной системы обеспечивается посредством снижения отношения макрофаг/микроглия M1 к макрофагу/микроглии M2.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где лечение заболевания нервной системы обеспечивается посредством промотирования регенерации нервов.