Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli Rosetta 2(DE3)/pET24b(+)-ROS1 - продуцент метилцитозин-специфической ДНК-гликозилазы ROS1 Российский патент 2022 года по МПК C12N1/21 C12N9/24 C12N15/70 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, генетической и белковой инженерии, и касается нового рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli (E.coli), который может быть использован для получения рекомбинантного белка метилцитозин-специфической ДНК-гликозилазы ROS1, состоящей из гликозилазного домена С и C-концевого RRM-домена и способной направленно удалять 5-метилцитозин из ДНК.

Важную роль в регуляции экспрессии генов и, как следствие, в их фенотипическом проявлении играет эпигенетическое состояние генома. Эпигеном представляет собой сложную систему из взаимосвязанных эпигенетических меток ДНК и белков, которые организуют хроматин в пространстве и времени. Метилирование цитозина по положению C5 считается одной из наиболее изученных эпигенетических меток ДНК.

Правильный уровень метилирования различных участков ДНК в клетке крайне важен, поскольку от него зависит транскрипционная активность генов. Ошибки в процессе метилирования ДНК могут приводить к тяжелым последствиям, в частности, у человека глобальное деметилирование ДНК или гиперметилирование генов-онкосупрессоров служат маркерами онкозаболеваний. Поддержание статуса метилирования ДНК в клетках млекопитающих, так и растений основано на балансе процессов метилирования и активного и пассивного деметилирования. Активное деметилирование mC у всех организмов основано на системе эксцизионной репарации оснований ДНК. У млекопитающих оно инициируется регулируемым повреждением mC, которое может происходить двумя способами: либо с дезаминированием mC до тимина дезаминазами семейства AID/APOBEC, либо с его окислением до hmC и дальнейших производных (5-формилцитозина и 5-карбоксилцитозина) диоксигеназами семейства TET.

В отличие от млекопитающих, у растений обнаружены два уникальных фермента с mC специфичной ДНК-гликозилазной активностью. Эти ферменты, DEMETER (DME) и REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1), принимают участие в регуляции статуса метилирования отдельных участков ДНК растений, от которого зависит импринтинг генов при наследовании по отцовской или материнской линии и сайленсинг или активация промоторов отдельных генов в жизненном цикле растений [1].

Белок ROS1, относящийся к семейству DME, был впервые идентифицирован в качестве репрессора метилзависимого подавления трансгенов [2], насчитывает 1393 а.к.о., и его молекулярная масса составляет 156,5 кДа. Ген ROS1 содержит 20 экзонов и 19 интронов. В структуре белка ROS1 выделяется несколько доменов [3]. N-концевой домен содержит лизин-богатую область, которая вовлечена в неспецифическое связывание белка с ДНК и в скольжение вдоль неё в поисках субстратных оснований [4]. За этим доменом следует центральный ДНК-гликозилазный домен, содержащий мотивы HhH и GPD,а также FeS-домен с четырьмя консервативными остатками Cys, ответственными за удерживание железо-серного кластера. Помимо этого, центральный гликозилазный домен имеет нетипичную вставку в 230 аминокислотных остатков (а. к. о.), последовательность и длина которой варьирует среди числа белков семейства DME. Такой последовательности нет в ранее охарактеризованных ДНК-гликозилазах, имеющих домен HhH-GPD. Также в составе белков семейства DME есть уникальная C-концевая область, содержащая мотив, узнающий РНК, и мотив пермутированного цинкового пальца. Было показано, что наличие С-концевого домена необходимо для проявления активности фермента [3].

Таким образом, создание новых рекомбинантных белков для редактирования эпигенома, открывает новые возможности для перепрограммирования клеток, компенсации генетических дефектов, лечения патологий.

В частности, метилцитозин-специфическая-ДНК-гликозилаза ROS1 представляет собой идеальный инструмент для целей эпигенетического деметилирования ДНК, так как он способен направленно удалять 5-метилцитозин из ДНК за один шаг в отличие от аналогов у млекопитающих, которые задействованы только в одной из двух стадий активного деметилирования.

На сегодняшний день аналогов штаммов-продуцентов метил-специфических ДНК-гликозилаз ROS1 и DEMETER, а также их аналогов деметилирования ДНК у млекопитающих AID/APOBEC и TET не обнаружено.

Наиболее ближайшим к заявляемому штамму – прототипом, является бактериальный штамм-продуцент Kocuria rosea 307, выделенный из почвы и обеспечивающий получение сайт-специфической эндонуклеазы KroI, узнающей и расщепляющей обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GCCGGC-3'/3'-CGGCCG-5', в которых два центральных цитозина метилированы в положении С5 с образованием четырехнуклеотидных 5'-выступающих концов (патент RU 2394099 C1, опуб. 10.07.2010).

Недостатком известного штамма является его неспособность продуцировать рекомбинантную метил-специфическую ДНК-гликозилазу ROS1.

Задачей изобретения является создание рекомбинантного штамма - продуцента метил-специфической ДНК-гликозилазы ROS1

Технический результат изобретения заключается в получении рекомбинантного штамма-продуцента, обеспечивающего получение рекомбинантной метилцитозин-специфической ДНК-гликозилазы ROS1 с чистотой не менее 90%.

Поставленная задача достигается созданием рекомбинантного штамма E. coli Rosetta 2(DE3)/pET24b(+)-ROS1-продуцента метилцитозин-специфической ДНК-гликозилазы ROS1, полученного трансформацией культуры клеток E. coli Rosetta 2 (DE3) (генотип F^– omp Thsd S_B(r_B^–m_B^–) gal dcm (DE3) pRARE2 (Cam^R)) рекомбинантной плазмидной ДНК pET24b(+)-ROS1, сконструированной на основе вектора pET24b(+), несущего фрагмент гена, кодирующего ДНК-гликозилазу ROS1, из табака Nicotiana tabacum. На фиг. 1 представлена физическая карта плазмиды pET24b(+)-ROS1.

Культурально-морфологические особенности штамма E. coli Rosetta 2(DE3)/pET24b(+)-ROS1: грамотрицательные прямые палочки, размером 1,1-1,5×2,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих хлорамфеникол и канамицин, например, на среде LB (питательная среда Lisogeny Broth). На агаризованной среде - колонии гладкие, круглые, слабовыпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную светорассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно. Клетки растут в интервале температур от 8°C до 43°C, интервал для наиболее эффективного культивирования - 28-38°C, оптимум роста при 37°C. Оптимальный интервал pH для культивирования pH 5-7. Изначальный штамм E. coli Rosetta 2 (DE3) проявляет устойчивость к хлорамфениколу (34 мкг/мл), обусловленную наличием гена устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pRARE2.

Характеристики полезного вещества, синтезируемого штаммом: рекомбинантный белок ROS1 длиной 626 аминокислотных остатков, состоящий из гликозилазного домена С и C-концевого домена RRM (618 аминокислот), небольшого линкера (2 аминокислоты) и гистидиновой метки (6 аминоксилот).

Продуктивность созданного штамма - рекомбинантный белок ROS1, составляет не менее 20 % белка клеточного лизата при культивировании в жидкой питательной среде LB при 37^оС, 250 об/мин, в условиях индукции 1 мМ ИПТГ (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) в течение 3 часов с добавлением антибиотиков хлорамфеникола (34 мкг/мл) и канамицина (100 мкг/мл).

На фиг. 2 приведена электрофореграмма после разделения клеточных лизатов клеток E. coli Rosetta 2(DE3)/pET24b(+)-ROS1 при культивировании в условиях индукции синтеза белка при помощи ИПТГ и без индукции; где М – белковый маркер подвижности 14,4-116 кДа (ThermoScientific); 1 – контрольная неиндуцированная культура, 2 – 3 ч после индукции 1 мМ ИПТГ.

Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами получения и использования штамма Е. coli Rosetta 2(DE3)/pET24b(+)-ROS1.

Пример 1. Создание генетической конструкции, обеспечивающей синтез рекомбинантной метилцитозин-специфической ДНК-гликозилазы ROS1 в клетках Е. coli.

In silico была проведена оптимизация кодонов для E. Coli, синтез полученной оптимизированной последовательности фрагмента гена ROS1 был заказан в компании Gene Universal (США). Клонирование в экспрессионный вектор осуществлялось по сайтам рестрикции Nde I и Xho I: фрагмент ДНК и вектор подвергались обработке обозначенными эндонуклеазами рестрикции, рестрикционные смеси очищались. Затем проводилось лигирование фрагментов при +4°С в течении 16 ч. После чего полученной лигазной смесью трансформировались клетки штамма Escherichia coli DH5α. Позитивные по данным метода ПЦР колонии были пересеяны в ночные культуры, из ночных культур выделялась плазмидная ДНК для подтверждения последовательности секвенированием по Сэнгеру. Последовательность нуклеотидов синтезированного фрагмента гена соотносится с необходимой аминокислотной последовательностью и совпадает с последовательностью ROS1 Nicotiana tabacum, имеющейся в GenBank (BAF52855.1).

На фиг. 1 представлена физическая карта плазмиды pET24b(+)-ROS1, содержащая ориджин репликации f1, промотор фага T7, RBS-сайт посадки рибосомы, сайты рестрикции Nde I и Xho I, по которым встроен фрагмент гена, кодирующего ДНК-гликозилазу ROS1 из табака Nicotiana tabacum, гистидиновую метку His-tag, терминатор фага T7, ген устойчивости к канамицину Kan (R), а также лактозный репрессор lacI и лактозный оператор.

Полученная плазмида pET24b(+)-ROS1 обеспечивает синтез в клетках Escherichia coli метилцитозин-специфической ДНК-гликозилазы ROS1, содержащей гликозилазный домен С, C-концевой домен RRM, а также C-концевую гистидиновую метку, предназначенную для последующей очистки рекомбинантного белка ROS1 c помощью металлохелатной хроматографии.

Нуклеотидная последовательность рекомбинантной плазмиды pЕТ24b(+)-ROS1 представлена в перечне последовательностей.

Пример 2. Получение штамма-продуцента рекомбинантной ДНК-гликозилазы ROS1 и исследование его продуктивности.

Полученной плазмидой pЕТ24b(+)-ROS1 были трансформированы клетки E. coli штамма Rosetta 2(DE3), содержащие в своем геноме ген, кодирующий ДНК-зависимую РНК-полимеразу фага Т7, под контролем промотора lacUV5, индуцируемого лактозой или ИПТГ. Кроме того, клетки E. coli Rosetta 2(DE3) дефектны по генам протеаз Lon и ompT, что снижает деградацию гетерологичных белков.

В результате был получен штамм E. coli Rosetta 2(DE3)/pET24b(+)-ROS1-продуцент бактериального белка ROS1.

Для поддержания полученного штамма-продуцента белка ROS1 использовали плотную агаризованную LB-среду, содержащую 100 мкг/мл канамицина и 34 мкг/мл хлорамфеникола.

Продуктивность полученного штамма-продуцента изучали путем культивирования клеток в среде LB, в термостатированном шейкере роторного типа при температуре 37°С, скорости вращения платформы 250 об/мин до оптической плотности А₆₀₀ = 0,5-0,6. После этого индуцировали синтез целевого белка добавлением ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ. В качестве контроля использовали культуру без добавления ИПТГ. Образцы собранной центрифугированием биомассы клеток лизировали при помощи ультразвукового разрушения и анализировали методом электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в системе Лэммли в денатурирующих условиях. Результат представлен на фиг. 2, где М – белковый маркер подвижности 14,4-116 кДа (ThermoScientific); 1 – контрольная неиндуцированная культура, 2 – 3 ч после индукции 1 мМ ИПТГ. В результате выявлено, что индукция 1 мМ ИПТГ культуры клеток E. coli приводит к синтезу белка с молекулярной массой 70 кДа, что соответствует ожидаемой молекулярной массе для рекомбинантного белка ROS1 с гистидиновой меткой. Количество рекомбинантного белка составило не менее 20% от клеточного лизата при культивировании в условиях индукции.

Пример 3. Очистка рекомбинантного белка ROS1 и изучение его активности.

Очистку рекомбинантного белка проводили в две стадии. Первая стадия включала в себя ионообменную хроматографию на сорбентах SP- и Q-сефарозе. Вторая стадия очистки представляла собой аффинную хроматографию на металлхелатном агарозном сорбенте, модифицированном иминодиуксусной кислотой, заряженной ионами Ni². После этого белок диализовали против буфера, содержащего 50%-ный глицерин, и хранили при −20°C. Результат двухстадийной очистки ROS1 представлен на фиг. 3, где М – маркер подвижности 14,4-116 кДа (ThermoScientific); 1 – очищенный рекомбинантный белок ROS1. Как видно из фиг. 3 препарат белка ROS1 является практически гомогенным, и его чистота составляет не менее 90%.

Для исследования активности очищенного белка ROS1 in vitro в качестве субстрата использовали двуцепочечный олигодезоксирибонуклеотид длиной 20 пар оснований, содержащий полуметилированный CpG-динуклеотид и радиоактивную метку на 5’-конце в конечной концентрации 50 нМ. Реакцию проводили при 37°C в течение 30 мин. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 20%-полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с последующим радиолюминесцентным сканированием. Результат эксперимента представлен на фиг. 4, где 6 – субстрат без фермента; 1-5 – конечная концентрация очищенного белка ROS1 900 нМ, 600 нМ, 300 нМ, 30 нМ и 3 нМ соответственно; S–субстрат, P – продукт реакции. Из фиг. 4 видно, что очищенный в рекомбинантном виде белок ROS1 проявлял активность в отношении субстрата с полуметилированным CpG-динуклеотидом, однако наблюдаемая активность не превышала 20 %. Снижение активности белка могло произойти на стадиях его очистки.

Таким образом, создан штамм бактерий Escherichia сoli Rosetta 2(DE3)/pET24b(+)-ROS1, являющийся продуцентом рекомбинантной ДНК-гликозилазы ROS1, состоящей из гликозилазного домена С и C-концевого RRM-домена и способной направленно удалять эпигенетическую метку 5-метилцитозин из ДНК. Рекомбинантный белок ROS1 может служить эффективным инструментом для редактирования уровня метилирования ДНК клеток человека.

Источники информации

1. Zhang, M., Kimatu, J. N., Xu, K., Liu, B. DNA cytosine methylation in plant development// Journal of Genetics and Genomics. – 2010. – V. 37. – No. 1. – P. 1-12.

2. Gong, Z., Morales-Ruiz, T., Ariza, R. R., Roldán-Arjona, T., David, L., Zhu, J.-K. ROS1, a Repressor of Transcriptional Gene Silencing in Arabidopsis, Encodes a DNA Glycosylase/Lyase// Cell –2002. – V. 111. – No. 6. – P. 803-814.

3. Hong, S., Hashimoto, H., Kow, Y. W., Zhang, X., Cheng, X. The carboxy-terminal domain of ROS1 is essential for 5-methylcytosine DNA glycosylase activity// Journal of molecular biology. – 2014. – V. 426. – No. 22. – P. 3703-3712.

4. Ponferrada-Marín, M. I., Roldán-Arjona, T., Ariza, R. R. Demethylation initiated by ROS1 glycosylase involves random sliding along DNA// Nucleic Acids Research –2012. – V. 40. – No. 22. – P. 11554-11562.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт химической биологии и фундаментальной медицины

Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО

РАН)

<120> Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli

Rosetta 2(DE3)/pET24b(+)-ROS1 - продуцент метилцитозин-

специфической ДНК-гликозилазы ROS1

<160> 1

<210> 1

<211> 7088

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 1

agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60

ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat ggaagcccct 120

acctttagtg aagcaattgt ggatgttcgt gaagaagtga gtgtggtggt tgatagttgt 180

aaaagtgaac atattgcact gaaaagcaat agtaataaca agaaacacca cgccgatagc 240

accctggatc gcgccaatga taataccaaa gccaaaaaag aacgtccggg caaagaaaaa 300

cagaatgtgg attgggatag tctgcgtctg caggcacaga ataatggtaa aaaacgcgaa 360

gaaattgcac ataccattcg cgaacgcggc atgaataata tgctggccga acgcattaag 480

gattttctga atcgcatttt tcgtgaacat ggcagtattg atctggaatg gctgcgcgat 540

gtgccgccgg ataaagcaaa agaatatctg ctgagtattc gcggtctggg cctgaaaagc 600

gttgaatgcg ttcgcctgct gaccctgcat catctggcat ttccggtgga taccaatgtg 660

ggccgcattg cagttcgcct gggttgggtg ccgctgcagc cgttaccgga aagcctgcag 720

ctgcatctgc tggaactgta tccggttctg gaaagcattc agaaatatct gtggccgcgc 780

ctgtgtaaac tggatcagcg taccctgtat gaactgcatt atcacatgat tacctttggc 840

aaagttttct gtaccaaaag caaaccgaat tgtaatgcat gtccgctgcg tggtgaatgc 900

cgccattttg ccagtgcatt tgcaagcgca cgtctggcac tgccggcccc tgaagaaaaa 960

agtattgtga gtgcaaccga aaataaggcc gccggccaga atccgtttca gaattttagt 1020

cagctgctgc tgccgctgcc gcaggcagat cagaccccgc tggaacatag taaactgatt 1080

aatagtgcac cgattattga agttccggca accccggaac cgattgttga agaaccggca 1140

agtccggaac cggaacagaa tgccccggaa gtggatattg aagatgcata ttttgaagat 1200

ccgaatgaaa ttccgaccat taccctgaat atggcagaat tcactcagaa tgtgaaaaaa 1260

ttcatggaaa acaacatgga actgcagcag gttgaaatga gtaaagccct ggttgcactg 1320

accccggaag ccgcaagtat tccggtgccg aaactgaaac atattagtcg tctgcgtacc 1380

gaacatcagg tttatgaact gagtgatagt catccgctgc tggaaggctt tgataaacgc 1440

gaaccggatg atccgtgcag ttatctgctg gcaatttgga ccccgggtga aaccgcagat 1500

agtattcatc cgccggccat taagtgtaat agtcaggaag ccggtcgtct gtgcgatgat 1560

gaaacctgct ttgcatgtaa tagcctgcgc gaagcacata gccagaccgt gcgtggcacc 1620

attctgattc cgtgccgtac cgccatgcgt ggcagttttc cgctgaatgg tacctatttt 1680

caggttaatg aagtttttgc cgatcatgat agcagtctga atccgattga tgtgccgcgc 1740

gattggctgt ggaatctgcc gcgccgtacc gtgtattttg gtaccagtat tccgaccatc 1800

tttaaaggcc tgaccaccga aagtattcag cattgttttt ggcgcggctt tgtttgtgtt 1860

cgtggttttg ataaaaagac ccgcgcaccg cgcccgctga tggctagact gcattttccg 1920

gccagccgcc tgagccgtac caaaggtaaa ccggatgaaa atctcgagca ccaccaccac 1980

caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc 2040

gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg 2100

ctgaaaggag gaactatatc cggattggcg aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa 2160

gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 2220

ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 2280

ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 2340

aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 2400

gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 2460

cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 2520

attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 2580

cgtttacaat ttcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 2640

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgaatta attcttagaa aaactcatcg 2700

agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 2760

agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 2820

tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 2880

tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 2940

ggcaaaagtt tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 3000

tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 3060

aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg 3120

aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 3180

aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 3240

aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 3300

tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 3360

ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 3420

ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctaga gcaagacgtt 3480

tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt 3540

attgttcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 3600

agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 3660

aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 3720

ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta 3780

gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 3840

aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 3900

aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 3960

gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 4020

aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 4080

aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 4140

cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 4200

cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 4260

tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 4320

tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 4380

ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca 4440

ccgcatatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat 4500

acactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg 4560

ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 4620

tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc 4680

tgcggtaaag ctcatcagcg tggtcgtgaa gcgattcaca gatgtctgcc tgttcatccg 4740

cgtccagctc gttgagtttc tccagaagcg ttaatgtctg gcttctgata aagcgggcca 4800

tgttaagggc ggttttttcc tgtttggtca ctgatgcctc cgtgtaaggg ggatttctgt 4860

tcatgggggt aatgataccg atgaaacgag agaggatgct cacgatacgg gttactgatg 4920

atgaacatgc ccggttactg gaacgttgtg agggtaaaca actggcggta tggatgcggc 4980

gggaccagag aaaaatcact cagggtcaat gccagcgctt cgttaataca gatgtaggtg 5040

ttccacaggg tagccagcag catcctgcga tgcagatccg gaacataatg gtgcagggcg 5100

ctgacttccg cgtttccaga ctttacgaaa cacggaaacc gaagaccatt catgttgttg 5160

ctcaggtcgc agacgttttg cagcagcagt cgcttcacgt tcgctcgcgt atcggtgatt 5220

cattctgcta accagtaagg caaccccgcc agcctagccg ggtcctcaac gacaggagca 5280

cgatcatgcg cacccgtggg gccgccatgc cggcgataat ggcctgcttc tcgccgaaac 5340

gtttggtggc gggaccagtg acgaaggctt gagcgagggc gtgcaagatt ccgaataccg 5400

caagcgacag gccgatcatc gtcgcgctcc agcgaaagcg gtcctcgccg aaaatgaccc 5460

agagcgctgc cggcacctgt cctacgagtt gcatgataaa gaagacagtc ataagtgcgg 5520

cgacgatagt catgccccgc gcccaccgga aggagctgac tgggttgaag gctctcaagg 5580

gcatcggtcg agatcccggt gcctaatgag tgagctaact tacattaatt gcgttgcgct 5640

cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 5700

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gccagggtgg tttttctttt caccagtgag 5760

acgggcaaca gctgattgcc cttcaccgcc tggccctgag agagttgcag caagcggtcc 5820

acgctggttt gccccagcag gcgaaaatcc tgtttgatgg tggttaacgg cgggatataa 5880

catgagctgt cttcggtatc gtcgtatccc actaccgaga tatccgcacc aacgcgcagc 5940

ccggactcgg taatggcgcg cattgcgccc agcgccatct gatcgttggc aaccagcatc 6000

gcagtgggaa cgatgccctc attcagcatt tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca 6060

ctccagtcgc cttcccgttc cgctatcggc tgaatttgat tgcgagtgag atatttatgc 6120

cagccagcca gacgcagacg cgccgagaca gaacttaatg ggcccgctaa cagcgcgatt 6180

tgctggtgac ccaatgcgac cagatgctcc acgcccagtc gcgtaccgtc ttcatgggag 6240

aaaataatac tgttgatggg tgtctggtca gagacatcaa gaaataacgc cggaacatta 6300

gtgcaggcag cttccacagc aatggcatcc tggtcatcca gcggatagtt aatgatcagc 6360

ccactgacgc gttgcgcgag aagattgtgc accgccgctt tacaggcttc gacgccgctt 6420

cgttctacca tcgacaccac cacgctggca cccagttgat cggcgcgaga tttaatcgcc 6480

gcgacaattt gcgacggcgc gtgcagggcc agactggagg tggcaacgcc aatcagcaac 6540

gactgtttgc ccgccagttg ttgtgccacg cggttgggaa tgtaattcag ctccgccatc 6600

gccgcttcca ctttttcccg cgttttcgca gaaacgtggc tggcctggtt caccacgcgg 6660

gaaacggtct gataagagac accggcatac tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc 6720

acattcacca ccctgaattg actctcttcc gggcgctatc atgccatacc gcgaaaggtt 6780

ttgcgccatt cgatggtgtc cgggatctcg acgctctccc ttatgcgact cctgcattag 6840

gaagcagccc agtagtaggt tgaggccgtt gagcaccgcc gccgcaagga atggtgcatg 6900

caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa 6960

acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat 7020

ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta 7080

gaggatcg 7088

<---

Изобретение относится к рекомбинантному штамму бактерий Escherichia coli – продуценту метилцитозин-специфической ДНК-гликозилазы ROS1. Предложен штамм бактерий Escherichia coli Rosetta 2(DE3)pET24b(+)-ROS1, являющийся продуцентом рекомбинантной ДНК-гликозилазы ROS1. Указанный штамм получают путем трансформации клеток Escherichia coli штамма Rosetta 2(DE3) плазмидой pET24b(+)-ROS1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NО: 1, сконструированной на основе вектора pET24b(+), содержащего ориджин репликации f1, промотор фага T7, RBS-сайт посадки рибосомы, сайты рестрикции NdeI и XhoI, по которым встроен фрагмент гена, кодирующего ДНК-гликозилазу ROS1 из табака Nicotiana tabacum, гистидиновую метку His-tag, терминатор фага T7, ген устойчивости к канамицину Kan (R), а также лактозный репрессор lacI и лактозный оператор. Изобретение обеспечивает получение рекомбинантного белка ROS1 с чистотой не менее 90%. 4 ил., 3 пр.

Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli Rosetta 2(DE3)/pET24b(+)-ROS1–продуцент метилцитозин-специфической ДНК-гликозилазы ROS1, полученный путем трансформации клеток Escherichia coli штамма Rosetta 2(DE3) плазмидой pET24b(+)-ROS1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NО: 1, сконструированной на основе вектора pET24b(+), содержащего ориджин репликации f1, промотор фага T7, RBS-сайт посадки рибосомы, сайты рестрикции NdeI и XhoI, по которым встроен фрагмент гена, кодирующего ДНК-гликозилазу ROS1 из табака Nicotiana tabacum, гистидиновую метку His-tag, терминатор фага T7, ген устойчивости к канамицину Kan (R), а также лактозный репрессор lacI и лактозный оператор.