Способ восстановления собственной кишечной микробиоты после антибиотикотерапии Российский патент 2022 года по МПК A61K35/741 A61P1/00 

Изобретение относится к медицине, конкретнее к гастроэнтерологии, и может быть использовано для восстановления собственной кишечной микробиоты после антибиотикотерапии.

В настоящее время проблема побочных эффектов антибиотиков, возникающих со стороны желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), очень распространена. Антибиотик-ассоциированные расстройства кишечника возникают примерно у каждого третьего пациента и проявляются как в виде легких нарушений, так и развитием тяжелых угрожающих жизни состояний.

Антибиотик-ассоциированная диарея (ААД) - 2 или более эпизодов жидкого стула в течение 2 или более последовательных дней, развивающихся на фоне антибактериальной терапии (АБТ) (через 2 дня от ее начала и до 2 месяцев после отмены антибиотиков). По данным различных авторов, частота развития АДД составляет 6-80%, в среднем 35% пациентов отмечают симптомы ААД на фоне антибактериальной терапии. Частота развития симптомов ААД зависит от применяемого антибиотика. Так, среди причин развития ААД первое место занимают производные пенициллина (10-25%) и цефалоспорины (10-20%), макролиды (2-5%), фторхинолоны (1-2%). Диарея развивается одинаково часто независимо от пути введения антибиотика - перорально или парентерально. Риск развития ААД не зависит от продолжительности курса терапии. Существует 2 варианта ААД: идиопатический вариант (неинфекционная диарея) и патоген-специфическая диарея (инфекционная), обусловленная конкретными бактериями (Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Klebsiella oxytoca), которые отличаются патогенезом и клиническими проявлениями, подходами к лечению и прогнозом.

Заболевание при первом варианте (идиопатическая антибиотик-ассоциированная диарея, ИААД) характеризуется вздутием живота, абдоминальной болью, диареей 3 и менее раз в сутки без патологических примесей (крови, слизи), без повышения температуры тела и количества лейкоцитов в периферической крови. При эндоскопическом исследовании толстой кишки слизистая не изменена. ИААД возникает на фоне приема антибиотиков амоксициллина/клавуланата, цефиксима, фторхинолонов.

Название «идиопатическая» указывает на то, что в данном случае не удается выявить конкретного возбудителя, вызывающего диарею, и что существуют различные факторы ее развития.

Наиболее изученным патогенетическим механизмом развития ИААД является снижение в результате действия антибиотика количества и видового разнообразия бутират-продуцирующих бактерий (БПБ), образующих масляную кислоту, к которым относятся Eubacterium, Faecalibacterium, Ruminococcus, Butyrivibrio, а не бифидо и лактобактерии. В результате снижения продукции масляной кислоты, которая является основным источником энергии колоноцитов, контролирует обмен воды и электролитов в клетке, обеспечивает целостность слизистого кишечного барьера кишечника, возникает секреторная и осмотическая диарея.

Заболевание при втором варианте (патоген-специфическая, инфекционная диарея, ПСААД) характеризуется разнообразным течением от легких форм до осложненного течения со смертельным исходом. Характерна диарея 3 и более раз в сутки с примесью крови, слизи, боль в животе, лейкоцитоз, гипоальбуминемия. ПСААД возникает на фоне приема цефалоспоринов 2, 3 поколения, карбапенемов. ПСААД развивается в результате избыточного роста конкретных бактерий: Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Klebsiella oxytoca. В результате выработки данными бактериями токсинов у пациента развивается колит с вышеуказанной симптоматикой. Наиболее изученным возбудителем является Clostridium difficile (CD). Основными факторами ее вирулетности являются токсины А и В, которые вызывают повреждение кишечной стенки, воспаление в ней и некроз эпителиоцитов.

При ПСААД возникает дисбаланс между группой бактерий, обеспечивающих противовоспалительные эффекты, и условно-патогенными микроорганизмами, активирующими провоспалительный ответ. Как при ИААД так и при ПСААД возникает дисбиоз, дефицит бутирата, как ключевого противовоспалительного и энергетического субстрата эпителия кишечника.

В данной ситуации целесообразно восстановление кишечной микрофлоры. Известны несколько способов для достижения нормализации кишечной микрофлоры.

Наиболее часто используют пробиотики - средства, содержащие живые микроорганизмы и вещества микробного и другого происхождения, оптимизирующие микроэкологический статус организма и оказывающие за счет этого благоприятные эффекты на его физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции.

Положительные эффекты пробиотиков реализуются тремя основными способами: модуляция иммунного ответа, усиление барьерной функции, влияние на микробиоту. Однако при применении пробиотиков возникает проблема выживаемости бактерий в организме. Было установлено, что до толстой кишки (основной ареал обитания нормофлоры) в среднем доходит живой всего 1 из 1 000 000 бактерий в составе пробиотика, более того, пробиотические клетки, способны вступать в антагонистические взаимоотношения с аутоштаммами микроорганизмов пациента. Даже дошедшие до толстой кишки в жизнеспособном состоянии бактерии пробиотиков не способны прижиться на поверхности слизистой оболочке кишечника. 90% штаммов гибнет под воздействием кислой среды желудка, панкреатических ферментов и желчных кислот в тонкой кишке. Важно также отметить, что пробиотики не эквиваленты собственной индигенной флоре и не способны размножаться в кишечнике. Возможно, это является причиной их бионесовместимости.

Пробиотические штаммы обнаруживаются в кишечнике лишь во время их приема и спустя 3-7 дней после окончания их приема. Для борьбы с кишечными инфекциями также применяют пробиотики. Но даже при длительном применении пробиотиков, как об этом свидетельствует опыт клиницистов, их положительный эффект носит временный характер или полностью отсутствует (Токарева Н. Коррекция и профилактика дисбактериоза//Эффективная фармакотерапия. - 2011. - №3. - С. 77-84).

На сегодняшний день влияние пробиотиков на предотвращение АДД и ее лечение было изучено в нескольких исследованиях (O'Mahony et al., Lactobacillus and bifidobacterium in irritable bowel syndrome: Symptom responses and relationship to cytokine profiles. //Gastroenterology. Jan 2005. - 128. - P. 54-551).

Однако только в некоторых из них было показано значимое улучшение. Кроме того, ни один пробиотический штамм не показал одновременно значимого влияния, ослабляющего симптомы ААД, что может быть объяснено тем фактом, что эффективность пробиотиков строго штаммоспецифична. Принято считать, что свойства одного пробиотического штамма не могут передаваться другому (Brenner and Chey. Bifidobacterium infantis 35624: a novel probiotic for treatment of irritable bowel syndrome. //Rev Gastroenterol Disord. -2009. - №9 (1). - P. 7-15). Следовательно, эффективность и влияние отдельного пробиотического штамма не могут быть предсказаны.

Собственные штаммы бактерий (аутоштаммы), выделенные из кишечника отдельного человека и размноженные в производственных условиях, хорошо приживаются в кишечнике у данного индивида и могут за короткое время полностью восстановить микробиоценоз кишечника.

Например, известен способ ускорения лечения дисбактериозов кишечника путем введения аутоштаммов бифидобактерий и лактобацилл. Аутоштаммы выделяли из фекалий хозяина путем последовательных десятикратных разведений физиологическим раствором исследуемого материала до 10^-8. Исследуемый материал из различных разведений засевали на соответствующие питательные среды для определения исходных уровней энтеробактерий, энтерококков, стафилококков, лактобактерий, бифидобактерий. Через двое суток материал из изолированных колоний лактобактерий, выросших на среде МРС-4 в наибольшем разведении (10³), и из изолированных колоний бифидобактерий, выросших на питательной среде Блаурокка в наибольшем разведении (10⁷), вновь пересевали на соответствующие селективные питательные среды. Выросшие через 2 суток после второго пассажа изолированные колонии бифидобактерий и лактобактерий пересевали на жидкие среды МРС-4 и Блаурокка для получения биомассы микроорганизмов, которая была использована в виде аутоштаммов для лечения дисбактериоза кишечника (SU 1286212 А, опубл. 30.01.1987).

Недостатками известного способа являются длительность выделения аутоштаммов бифидо- и лактобактерий и недостаточная эффективность из-за низкой физиологической активности данных штаммов.

Известен способ профилактики постинфекционного синдрома раздраженной кишки (ПИ-СРК), включающий пероральный прием аутопробиотика, представляющего собой индивидуальный молочнокислый продукт, приготовленный на основе штамма Enterococcus faecium и содержащий 10⁸ КОЕ в 1 мл продукта. Аутопробиотик вводят в дозе не менее 100 мл/сутки курсом не менее 10 дней. Аутопробиотик получают следующим образом. Осуществляют посев бактерий из фекалий пациента на селективную питательную среду с последующим выращиванием культуры в селективной питательной среде, идентификацией и отбором типичных для Enterococcus faecium колоний, получением чистой культуры Enterococcus faecium и уточнением видовой принадлежности и содержания факторов патогенности методом полимеразной цепной реакции, отбором апатогенных клонов Enterococcus faecium, соответствующих стандартам генетической безопасности и физиологической функциональности, из которых готовят молочнокислую закваску. Отобранные апатогенные клоны Enterococcus faecium депонируют в криохранилище при температуре не выше -75°С со сроком хранения не более 1 года. В качестве селективной питательной среды используют энтерококк-агар. Способ позволяет повысить эффективность профилактики больных с ПИ-СРК за счет уменьшении частоты его развития (Патент RU 2553372 С1, опубл. 10.06.2015).

Недостатками известного способа являются невысокая эффективность лечения из-за использования аутопробиотиков на основе одного аутоштамма, низкая предсказуемость клинического эффекта, что приводит к частым рецидивам заболевания после отмены пробиотиков.

Известен способ лечения воспалительных заболеваний кишечника с использованием штаммов с пробиотической активностью, выделенных из фекалий детей, вскармливаемых исключительно материнским молоком. В качестве пробиотических штаммов используют штаммы Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4036, Lactobacillus paracasei CNCM I-4034 и Bifidobacterium breve CNCM I-4035. Пробиотики по изобретению могут также быть использованы в пищевых добавках и даже в фармацевтических продуктах, которые могут быть представлены в форме порошковых препаратов, таблеток, покрытых сахарной оболочкой, и так далее (Патент RU 2551315 С1, опубл. 20.05.2015).

Недостатком известного способа является кратковременность положительного эффекта - только на время приема пробиотических штаммов.

Известен способ выделения тотальной микробиоты кишечника донора и ее сохранение для трансплантации. Способ предусматривает выделение методами фильтрации через стрейнеры с ячейками 100 мкм и градиентного центрифугирования в фосфатно-солевом растворе и в градиентной жидкости перколл. После чего клетки отмывают 1% фосфатно-солевым раствором и концентрируют центрифугированием при 13000 об/мин 15 мин и замораживают в крио-среде с эмбриональной бычьей сывороткой с последующим хранением при температуре -80°С. Исследование КОЕ в образцах показало максимальное количество колоний в «свежем образце» - 3,3*10¹⁰, в образцах после криоконсервации 1 и 7 суток 2,2*10⁹ и 2,4*10⁹ соответственно. В образцах после 30 суток и 1 года криоконсервации количество КОЕ практически не изменялось и составляло 3,01-3,26*10⁸, что говорит о высоком потенциале способа криоконсервации микробиоты, сохранение ее терапевтических и пробиотических свойств по сравнению с аналогами (Патент RU 2727444 С1, опубл. 21.07.2020).

Недостатком данного способа является применение донорского материала, что может быть причиной бионесовместимости бактерий кишечника реципиента и привести к недостаточной эффективности данного метода лечения.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ лечения синдрома раздраженной кишки, сопровождающегося дисбиозом кишечника, включающий пероральный прием аутопробиотика, представляющего собой индивидуальный молочнокислый продукт, приготовленный на основе аутоштамма Lactobacillus spp. с титром не менее 1×10⁸ КОЕ/мл, который назначают пациенту в дозе не менее 50 мл с кратностью приема не менее 2 раза в сутки через 30-40 мин после еды в течение не менее 10 дней. Аутопробиотик получают забором пробы нативного материала, посевом и выращивание бактерий из фекалий пациента на селективной питательной среде, идентификацией и отбором типичных для лактобактерий колоний, получением чистой культуры, уточнением видовой принадлежности с использованием ПЦР, ее депонированием в криохранилище при температуре не выше -75°С со сроком хранения не более 1 года и приготовлением из полученной культуры молочнокислой закваски (Патент RU 2546253 С2, опубл. 10.04.2015).

Недостатками прототипа являются невысокая эффективность лечения из-за использования аутопробиотиков на основе одного аутоштамма, кратковременность положительного клинического эффекта. Кроме этого, способ отличается большой длительностью и трудоемкостью, поскольку для выделения облигатных лактобацилл из фекалий для создания аутопробиотических молочнокислых заквасок необходимо: 1) осуществить высев лактобацилл из фекалий пациента; 2) идентифицировать выделенные штаммы до рода; 3) осуществить ПЦР для определения вида лактобацилл и отбора пробиотических штаммов; 4) получить готовый продукт - аутопробиотическую молочнокислую закваску.

Задачей изобретения является разработка более эффективного и менее трудоемкого и длительного способа.

Техническим результатом является упрощение способа и повышение его эффективности.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

У пациента до планируемого курса антибиотикотерапии забирают его собственные фекалии без применения слабительных средств в количестве 150-180 г. Далее фекалии фасуют по 30-36 г в пять порций и замораживают при температуре -80 -82°С. Далее каждую порцию измельчают в замороженном виде и фасуют в желатиновые кишечнорастворимые капсулы по 0,7-0,9 г в каждую капсулу (из одной порции получается 35-50 капсул). Затем каждую капсулу с материалом помещают в пустую капсулу необходимого размера и хранят при температуре -80 -82°С. Срок хранения не более 12-ти месяцев.

После завершения курса антибиотикотерапии пациент принимает капсулы перорально в течение 24-36 часов порциями по 5-10 капсул с интервалом 3-6 часов, запивая их прохладной водой объемом не менее 150 мл. Способ позволяет уменьшить клинические проявления дисбактериоза после приема антибиотиков за счет восстановления собственной кишечной микробиоты.

Эффективность заявляемого способа лечения изучена у 29 пациентов с ААД (основная группа). В группу сравнения включены 25 пациентов с ААД, при лечении которых не использовали заявляемый способ (группа контроля). Группы были сопоставимы по полу, возрасту, степени тяжести ААД. По истечении 4-х недель с момента окончания приема капсул проведена оценка количества больных с купированием клинической симптоматики. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что у 86,2% больных, пролеченных заявляемым способом, клиническая симптоматика купирована полностью в сравнении с 6,8% пациентов, у которых клиническая симптоматика купирована частично. Осложнений, связанных с лечением, не отмечено, побочных эффектов не зарегистрировано.

Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность лечения пациентов с антибиотик-ассоциированной диареей, то есть купировать основные клинически проявления заболевания: болевой синдром, метеоризм, нормализовать частоту и форму стула и добиться долгосрочного результата, то есть удлинения сроков стойкого восстановления микрофлоры после лечение антибиотиками у большего числа пациентов.

Определяющими отличительными признаками заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1) Пациент после завершения курса антибиотикотерапии принимает внутрь собственную фекальную микробиоту, что позволяет на длительный период восстановить нормальный микробиоценоз кишечника за счет заселения толстого кишечника ассоциацией собственных, эквивалентах индигенной флоре хозяина микроорганизмов, которые при попадании в кишечник больного человека не являются чужеродными, не возникает бионесовместимости, в результате чего способны размножаться в кишечнике и полностью купировать дисбиотическое состояние на длительный период.

2) Собственные фекалии пациента замораживают при температуре -80 -82°С, фасуют в желатиновые кишечнорастворимые капсулы по 0,7-0,9 г, замораживают и хранят при этой же температуре до применения, что позволяет сохранить первоначальный состав микробиоты и при их применении повысить эффективность лечения пациентов, то есть купировать основные клинические проявления заболевания и получить стойкий положительный клинический ответ.

Предложенный способ характеризуется отсутствием побочных эффектов и хорошо переносится пациентами. Использование предложенного способа позволит значительно уменьшить частоту развития ААД и тяжесть течения ААД.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1

Пациентке К., 29 лет, по поводу воспалительного заболевания органа малого таза (ВЗОМТ) лечащим врачом - гинекологом назначена антибиотикотерапия по схеме: амоксициллин/клавуланат + азитромицин курсом 14 дней. По завершению лечения беспокоили неприятные ощущения внизу живота, позывы на дефекацию, диарея до 3 раз в сутки без патологических примесей. В анамнезе имелась антибиотик-ассоциированная диарея, в связи с этим пациентка была направлена на консультацию к гастроэнтерологу. Диагностирована антибиотик-ассоциированная диарея.

Проведено лечение заявляемым способом.

У пациентки за четыре месяца до проведения назначенной антибиотикотерапии забрали ее собственные фекалии без применения слабительных средств в количестве 150 г. Далее фекалии расфасовали по 30 г в пять порций и заморозили при температуре -82°С. Далее каждую порцию измельчили в замороженном виде и расфасовали в желатиновые кишечнорастворимые капсулы типового размера по 0,7 г в каждую капсулу. Затем каждую капсулу с материалом поместили в пустую капсулу соответствующего типового размера и хранили до использования при температуре -82°С.

После завершения курса назначенной гинекологом антибиотикотерапии, консультации гастроэнтеролога и постановки диагноза, пациентка принимала капсулы перорально в течение 36 часов порциями по 7 капсул с интервалом 5 часов, запивая их 150 мл прохладной воды.

Пациентка хорошо перенесла лечение, побочных эффектов не наблюдалось. Через 2 суток клиническая симптоматика купирована полностью. В течение 6 месяцев наблюдения диспепсических жалоб не наблюдалось.

Пример 2

Пациентка М., 50 лет. Жалобы на диарею 3-4 раза в сутки без крови, слизи, температура тела не повышается, периодически тупая боль в нижней части живота перед дефекацией. Пациентка 1 месяц назад получала курс антибактериальной терапии в амбулаторных условиях по поводу внебольничной пневмонии нетяжелого течения по схеме: Амоксиклав 500 мг + 125 мг 2 раза в сутки в течение 10-ти дней. Анамнез по заболеваниям желудочно-кишечного тракта не отягощен.

Пациентка была направлена на консультацию к гастроэнтерологу. На основании клинико-анамнестических данных и результатов проведенного лабораторного обследования, установлен диагноз: антибиотик-ассоциированная диарея.

Проведено лечение заявленным способом.

У пациентки за три месяца до проведения антибиотикотерапии забрали ее собственные фекалии без применения слабительных средств в количестве 160 г. Далее фекалии расфасовали по 32 г в пять порций и заморозили при температуре -80°С. Далее каждую порцию измельчили в замороженном виде и расфасовали в желатиновые кишечнорастворимые капсулы по 0,8 г в каждую капсулу. Затем каждую капсулу с материалом поместили в пустую капсулу соответствующего типового размера и хранили до использования при температуре -80°С.

После завершения курса назначенной антибиотикотерапии, пациентка принимала капсулы перорально в течение 24 часов порциями по 5 капсул с интервалом 3 часа, запивая их прохладной водой. Пациентка хорошо перенесла лечение, побочных эффектов не наблюдалось. Через 3-е суток клиническая симптоматика купирована полностью. Через 6 месяцев наблюдения явления диспепсии отсутствовали.

Пример 3

Пациент Б., 49 лет, предъявлял жалобы на диарею до 5-7 раз в сутки.

Получал антибиотик цефиксим по поводу обострения хронического пиелонефрита. Диарея 1-2 раза в день без крови появилась на 2 день лечения антибиотиком. К 7-му дню лечения частота диареи увеличилась до 5-7 раз в сутки, умеренная боль в животе, вздутие живота. До лечения антибиотиками жалоб на диарею не было.

Пациент осмотрен гастроэнтерологом, поставлен диагноз: антибиотик-ассоциированная диарея. В связи с сохранением жалоб и неэффективностью медикаментозной терапии пациенту проведено лечение заявленным способом.

У пациента за один месяц до антибиотикотерапии забрали его собственные фекалии в количестве 180 г. Далее фекалии расфасовали по 36 г в пять порций и заморозили при температуре -80°С. Далее каждую порцию измельчили в замороженном виде и расфасовали в желатиновые кишечнорастворимые капсулы по 0,9 г в каждую капсулу и хранили аналогично примеру 2.

После завершения курса назначенной антибиотикотерапии пациент принимал капсулы перорально в течение 24 часов порциями по 10 капсул с интервалом 6 часов, запивая их прохладной водой. Пациент хорошо перенес лечение, побочных эффектов не наблюдалось. Через 2 суток клиническая симптоматика купирована полностью. Через 6 месяцев наблюдения явления диспепсии отсутствовали.

Использование предлагаемого способа позволит улучшить качество жизни пациентов, страдающих антибиотик-ассоциированной диареей, за счет нормализации консистенции и частоты стула, купирования клинической симптоматики (исчезновение абдоминальной боли, метеоризма, диареи), стойкого восстановления микрофлоры кишечника.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии. Для восстановления собственной кишечной микробиоты у пациента до планируемого курса антибиотикотерапии осуществляют забор собственных фекалий без применения слабительных средств. Далее фекалии разделяют на порции и замораживают при температуре -80÷-82°С. Затем каждую порцию измельчают в замороженном виде, фасуют в желатиновые кишечнорастворимые капсулы по 0,7-0,9 г и назначают пациенту после завершения курса антибиотикотерапии перорально по 5-10 капсул с интервалом 3-6 часа в течение 24-36 часов, запивая водой. Способ упрощает и повышает эффективность восстановления кишечной микробиоты после курса антибиотикотерапии. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

1. Способ восстановления собственной кишечной микробиоты после антибиотикотерапии, включающий пероральный прием аутопробиотического продукта, отличающийся тем, что у пациента до планируемого курса антибиотикотерапии осуществляют забор собственных фекалий без применения слабительных средств, далее фекалии разделяют на порции, замораживают при температуре -80÷-82°С, затем каждую порцию измельчают в замороженном виде, фасуют в желатиновые кишечнорастворимые капсулы по 0,7-0,9 г и назначают пациенту после завершения курса антибиотикотерапии перорально по 5-10 капсул с интервалом 3-6 часов в течение 24-36 часов, запивая водой.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что забор фекалий проводят в количестве 150-180 г и фасуют по 30-40 г в пять порций.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что до использования капсулы хранят при температуре -80÷-82°С в течение не более 12-ти месяцев.