Способ определения чувствительности кампилобактерий к пробиотикам и аутопробиотикам Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12Q1/08 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано для разработки медицинских технологий лечения кампилобактериоза.

Кампилобактерии вызывают инфекционный гастроэнтерит с такими тяжелыми последствиями, как реактивный артрит и синдром Гийена-Барре. Ежегодно в мире регистрируют около 140 миллионов случаев этого заболевания и более 30 тысяч случаев смерти, чаще всего среди детей в возрасте до 5 лет. Хотя кампилобактерии выделены впервые еще в 1963 г., до сих пор нет ни вакцин, ни средств для предотвращения инфекции.

Кампилобактериоз является одной из наиболее распространенных острых кишечных инфекций. Частота выявления данной инфекции у детей значительно выше, чем у взрослых. Согласно опубликованным данным, при надлежащей диагностике кампилобактериоз выявляется у 5-22% больных детского возраста с ОКИ. В США ежегодно регистрируется не менее 1,3-2 млн. случаев заболеваний, вызванных Campylobacter spp. [Kaakoush N.О. et al. Global epidemiology of Campylobacter infection //Clinical microbiology reviews. - 2015. - T. 28. - №. 3. - C. 687-720]. Особенно следует отметить частую регистрацию осложненного «негладкого течения кампилобактериоза у детей [Grzybowska-Chlebowczyk U. et al. Clinical course of Campylobacter infections in children // Pediatria polska. - 2013. - T. 88. - №. 4. - C. 329-334.]. Кроме того, за последние несколько десятилетий регистрируется значительный рост устойчивости кампилобактерий к антибактериальным препаратам [Ефимочкина Н.Р. и др. Антибиотикорезистентность штаммов Campylobacter jejuni, выделенных из пищевых продуктов // Вопросы питания. - 2017. - Т. 86. - №. 1. - С. 17-27; Economou V., Gousia P. Agriculture and food animals as a source of antimicrobial-resistant bacteria //Infection and drug resistance. - 2015. - T. 8. - C. 49]. Возможными механизмами преодоления данных трудностей является не только рациональное назначение антибиотиков, но и использование пробиотиков и аутопробиотиков, обладающих антагонистическим действием по отношению к кампилобактериям [Ермоленко К.Д., Болдырева Н.П., Мартене Э.А., Железова Л.И., Сидоренко С.В., Суворов А.Н., Ермоленко Е.И. Необходимость индивидуального подбора пробиотиков, содержащих лактобацилы и энтерококки для повышения эффективности терапии кампилобактериоза // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2021. №2(186). С. 88-93; Balta I. et al. Anti-Campylobacter probiotics: latest mechanistic insights // Foodborne Pathogens and Disease. - 2022. - T. 19. - №. 10. - C. 693-703].

Данные группы лекарственных препаратов и функциональные пищевые продукты могут применяться как в качестве дополнения, так и альтернативы антибактериальной терапии инфекционных заболеваний [Ермоленко Е.И., Молостова А.С., Гладышев Н.С. Эрадикационная терапия хеликобактериоза при помощи пробиотиков: проблемы и перспективы // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2021. №9 (193). С. 60-72].

Выбор адекватного антибактериального препарата в комплексе с дифференцированным подходом к назначению пробиотиков при кампилобактериозк также, как и в случае хеликобактерной инфекции необходим для быстрой элиминации возбудителя и восстановления микробиоценоза кишечника, профилактики осложненного течения болезни и хронической персистенции патогенных бактерий. Использование аутопробиотиков, индигенных лактобацилл, энтерококков и других представителей микробиоты организма хозяина, выделенные из кишечника и повторно введенные в организм, обладает рядом преимуществ по сравнению с применением других терапевтических средств, к которым относятся иммунологическая толерантность и отсутствие угнетения собственной микробиоты. Показано, что пробиотическиме средства не всегда бывают эффективны, не всегда вызывают эрадикацию возбудителей инфекционных заболеваний и безопасны. Это связано с неодинаковой чувствительностью штаммов возбудителя к действию пробиотиков и аутопробиотиков. Персонифицированный подход при терапии может обеспечиваться выбором пробиотиков и создание аутопробиотиков, эффективность которых предварительно устанавливается на основании исследований в системе in vitro.

Однако методические вопросы решения этой проблемы были разработаны недостаточно. Предложены различные подходы для оценки антимикробной активности, разработанные в основном с целью выявления антагонистической активности пробиотических штаммов лактобацилл, бифидобактерий и энтерококков по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям, представителям семейства Enterobacteriaceae, стафилококкам, стрептококкам, листериям.

В табл. 1 проведено сравнение известных методов оценки антагонистической активности пробиотических культур.

При использовании метода прямого антагонизма - метод штриховых посевов, когда осуществляется посев пробиотика и тестируемых культур на одну и ту же среду штрихами на расстоянии 2-5 мм индикаторные бактерии рекомендуется подсевать на середу МРС, на которой могут расти ограниченное число бактериальных таксонов и через 72-96 часов роста предполагаемого антагониста. Зоны роста зависят от качества посева и условий культивирования, характеризуется переменной величиной зоны подавления роста каждого тест-штамма, измеряемой в мм [ФС 42-3365-97 "Колибактерин сухой", Постникова Е.А., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2004. - №2. С. 64-69].

При прямом совместном культивировании (капельный метод) происходит непосредственное взаимодействие пробиотика и испытуемой культуры на поверхности среды, остаются высокие ограничения по выбору питательной среды [Глушанова Н.А., Блинов А.И., Бахаев В.В. Об антагонизме пробиотических лактобацилл // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2004. - №6. С. 37-39; Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях: приложение 1 к приказу Минздрава СССР №535. - 1986; Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Гайдеров А.А., Баснакьян И.А., Осипова И.Г. Количественный способ оценки отсроченного антагонизма пробиотических культур против оппортунистических дрожжей // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - №5. С. 53-54]. При использовании данного подхода отсутствует количественный контроль результатов и ограничен спектр индикаторных бактерий и пробиотических культур, что связано с применением в основном среды МРС.

Существует еще более сложный, но быстрый метод исследования антагонистической активности пробиотических микроорганизмов, основанный на использовании люминесцентных бактерий, реагирующих на интибирование их роста метаболитами пробиотиков снижением интенсивности люминесценции (А.с. СССР 1335569, кл. C12Q 1/04; G01N 33/48, 1987 и А.с. СССР 1540439, кл. G01N 33/18, 1987). Для выявления данного эффекта не требуется совместное культивирование бактерий испытуемой и контрольной культур [Способ определения антагонистической активности пробиотиков. Несчисляев В.А., Пшеничное Р.А., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В. Патент RU 2187801, опубл. 20.08.2002].

Проявление данного эффекта поддается количественному учету при кратковременной совместной экспозиции препарата и тест-культуры (в течение 2 часов). Этот способ, исключая необходимость применения питательных сред, позволяет оценить антагонистическую активность препаратов, содержащих бактериальные культуры или культуральные жидкости. Достигаемый технический результат заключается в упрощении, снижении продолжительности и трудоемкости способа контроля пробиотиков. Однако для использования данного метода необходимы индикаторные бактерии, обладающие люминесценцией, связанной с продукцией люциферазы. Метод годится для только для быстрого тестирования пробиотических культур в отношении референс штамма эшерихий.

При использовании метода перевернутого агара метаболиты пробиотиков (лактобацилл и бифидобактерий) в течение двух суток инкубации насыщают питательную среду и влияют на рост тест-штамма [Патент RU 2412989 «Способ индивидуального выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерий, в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника Оришак Е.А., Бойцов А.Г., Нилова Л.Ю. Патент RU 2412989. 27.02.2011. https://www.freepatent.ru/patents/2412989?ysclid=laso7h39hp891342346].

Метод перевернутого агара описан также для выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli, в отношении оппортунистических дрожжей [Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Гайдеров А.А., Баснакьян И.А., Осипова И.Г. Количественный способ оценки отсроченного антагонизма пробиотических культур против оппортунистических дрожжей // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - №5. С. 53-54.]. Этот метод трудоемок и требует специального подбора условий культивирования индикаторных бактерий и анатагонистов. Кроме того, не предусмотрена количественная оценка антагонистической активности пробиотиков.

Известен способ индивидуального выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерий, в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника [Патент RU 2412989. Оришак Е.А., Бойцов А.Г., Нилова Л.Ю. (27.02.2011), https://www.freepatent.ru/patents/2412989?ysclid=laso7h39hp891342346], в котором для оценки чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к пробиотическим лактобациллам и бифидобактериям применяется комбинация методов двуслойного агара, перевернутого агара и капельный метод. Предлагаемый авторами подход для определения чувствительности представляет значительные практические трудности. Каждый этап проводимого исследования крайне трудоемок, происходит дублирование повторяющихся рутинных процедур, а также постоянно требуется контроль результатов и их критическая переоценка в принятии решения о необходимости перехода к дополнительным методам исследования. Кроме того, в указанном способе оценки антагонистической активности не введен количественный показатель (такой как МИК), не предложен вариант исследования антагонистической активности пробиотических и аутопробиотических бактерий и грибов по отношению к Campylobacter различных видов.

В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности выбран разработанный нами метод двухслойного агара, применяемый при оценке антагонистической активности пробиотических лактобацилл и энтерококков к условно патогенным энтеробактериям и стафилококкам [Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2004. - №5. - С. 94-98]. Используют две среды: МРС4 для формирования нижнего слоя с молочнокислыми бактериями и мясопептонный агар для культивирования перечисленных условно-патогенных бактерий на поверхности верхнего слоя. Для выявления антагонистической активности пробиотиков по отношению стрептококкам верхний слой был заменен на кровяной агар [Ермоленко Е. И., Черныш А. Ю., Берлов М. Н., Тотолян А. А., Суворов А. Н. Антагонистическая активность энтерококков в отношении Streptococcus pyogenes // Вестник Санкт-Петербургского университета. Медицина. 2008. №3. URL: https://cyberleninka.ru/article/ri/antagonisticheskaya].

Техническим результатом описанных изобретений является повышение точности выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобациллы и/или энтерококки, в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника у конкретного пациента и расширение спектра оптимально подобранных препаратов. Однако в этих методах предлагается использование МРС4 агара, предназначенного в основном для культивирования лактобацилл. В этом случае нет возможности культивирования кампилобактерий, а также отсутствуют методы оценки чувствительности к аутопробиотикам.

Метод двухслойного агара является одним из наиболее эффективных методов оценки антагонистической активности пробиотических и аутопробиотических в отношении патогенных микроорганизмов. В методе двухслойного агара пробиотики растут в условиях, близких к анаэробным, и могут максимально проявлять свои свойства. Однако до этого времени не было предложено использования универсальной среды для культивирования широкого спектра индикаторных бактерий, в частности, весьма требовательных к условиям роста кампилобактерий.

Предлагаемый способ основан на использовании метода двухслойного агара и реализуется следующим образом.

Предварительно готовят образцы пробиотических микроорганизмов и выделенных из фекалий пациента аутопробиотических бактериальных культур, помещают их в морозильную камеру с температурой -80°С, затем выделяют из фекалий пациента чистую культуру кампилобактерий, выращивают ее на поверхности кампилобакагара и смывают газон в пробирку изотоническим раствором хлорида натрия. В три чашки Петри, содержащие расплавленный и остуженный до температуры 40-50°С слой триптиказо-соевого агара в количестве 9 мл на чашку, вносят, тщательно перемешивая, пробиотическую или аутопробиотическую культуру для достижения итоговой концентрации в нижнем слое агара в каждой чашке соответственно 9, 8 и 7 lg КОЕ/мл. После застывания агара на поверхность нижнего слоя наливают второй слой той же питательной среды в количестве 10 мл. Далее на поверхность застывшего верхнего слоя капельно наносят стандартизированную путем разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до концентрации 6 lg КОЕ/мл суспензию кампилобактерий, затем инкубируют в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 48 часов, после чего визуально оценивают наличие или отсутствие роста этих бактерий в каждой чашке и выбирают чашку с минимальной концентрацией пробиотических или аутопробиотических культур. Контролем является двухслойный агар без культур антагонистов. Чувствительной считали культуру кампилобактерий, которая не вырастала при наличии в нижнем слое агара антагониста в концентрации 7 lgKOE/мл, умеренно-устойчивой - при 8 lgKOE/мл, устойчивой - при 9 lgKOE/мл.

Для тестирования чувствительности кампилобактерий к пробиотикам и аутопробиотикам лучше использовать один посев и контролировать их количество при помощи титрования и использования стандарта мутности. Пробиотики или индигенные культуры, выделенные из фекалий хозяина, проявляющие высокую антикампилобактерную активность, рекомендуют для персонифицированной терапии кампилобактериоза.

Набор для обнаружения Campylobacter jejuni или Campylobacter coli, содержащий следующую конфигурацию: i) цефоперазон, ванкомицин, триметоприм и циклогексимид и рифампицин не менее 5 мг/л; ii) mCCDA (агар с модифицированным древесным углем цефоперазондезоксихолат) или агаровая среда Campyfood ID для селективного культивирования.

Идентификация кампилобактерий осуществляется на основании культуральных свойств, световой микроскопии препаратов чистых культур бактерий, окрашенных по методу Грама, и MALDI-Tof масс-спектрометрии.

Таким образом достигается технический результат изобретения -повышение точности и быстроты оценки чувствительности кампилобактерий к пробиотикам и аутопробиотикам.

Эффективность предлагаемого способа диагностики и его клиническая актуальность подтверждена клиническими и лабораторными примерами.

Пример 1.

Из фекалий пациента выделяли аутопробиотические бактериальные культуры и помещали их в морозильную камеру с температурой -80°С.

Пробиотические культуры выделяли из пробиотических препаратов или продуктов, используя метод истощающего штрихового посева на средах МРС (аципол, ламинолакт), триптиказо-соевый агар для выделения бифидобактерий и сахаромицетов (бифиформ, энтерол), азидная среда для выделения энтерококков (ламинолакт), приготовленные из этих культур инокулюмы помещали в морозильную камеру с температурой -80°С, затем выделяли из фекалий пациента чистую культуру кампилобактерий, выращивали ее на поверхности кампилобакагара, после чего смывали газон в пробирку изотоническим раствором хлорида натрия, заполняли 3 чашки Петри предварительно расплавленным и остуженным до 40-50°С триптиказо-соевым агаром в количестве по 9 мл на чашку, перед исследованием пробиотические и аутопробиотические культуры размораживали, готовили их десятикратные разведения и помещали в первую чашку 1 мл культуры в концентрации 9 lg КОЕ/мл, во вторую чашку 8 lg КОЕ/мл и 7 lg КОЕ/мл в третью чашку, затем в каждой чашке формировали второй слой агара, добавляя дополнительно 10 мл той же среды, после ее застывания на поверхность верхнего слоя агара капельно наносили стандартизированную до концентрации 6 lg КОЕ/мл суспензию кампилобактерий, затем инкубировали в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 48 часов.

Клинические изоляты Campylobacter spp., были посеяны на кампилобакагар с добавлением 5% бараньих эритоцитов и селективной добавки с антибиотиками, полученные колонии были идентифицированы при помощи MaldiTof масс-спектрометрии. Для исследования антагонистической активности пробиотических и аутопробиотических культур по отношению к кампилобактериям были использованы: метод штриховых посевов, метод совместного культивирования и метод двухслойного агара с разными составами сред.

Использование метода штриховых посевов со средой МРС было невозможно, так как на этой среде кампилобактерий не росли, а замена среды на триптиказо-соевый агар даже при подсеве индикаторных культур через 72 часа в анаэробных или аэробных условиях не приводила к задержке роста культур кампилобактерий. Установлено, что культуры лактобацилл и бифидобактерий, в отличие от культур сахаромицетов и энтерококков, росли только при создании анаэробных условий.

Использование метода двухслойного агара с использованием МРС агара для роста лактобацилл и энтерококков и формированием верхнего слоя из мясопептонного агара, в том числе с добавлением бараньих эритроцитов, не являлось приемлемым для контроля роста кампилобактерий, так как они не росли на указанной среде.

Использование совместного роста кампилобактерий, пробиотических или пробиотических культур на поверхности триптиказо-соевого агара не выявило ингибирования роста кампилобактерий, хотя все культуры в течение 48 часов культивирования в анаэробных условиях были способны расти на этой среде.

В табл.2 приведены результаты исследования антагонистического действия чистых культур, выделенных из готовых пробиотиков и аутопробиотиков в отношении кампилобактерий (МИК lg КОЕ /мл).

Saccharomyces boulardii (энтерол) не ингибировали рост всех штаммов кампилобактерий при добавлении в нижний слой агара культуры сахаромицетов в концентрации 7 lg КОЕ/мл. Как видно из описания антикампилобактерной активности S. boulardii, для задержки роста кампилобактерий под влиянием метаболитов сахаромицетов требовалась конечная концентрация более 7 lg КОЕ/мл. Для более активно действующих культур молочнокислых бактерий и бифидобактерий доза антагониста также была важна и имела особенности для каждой культуры или их смеси. Максимальное действие при концентрации 6 lg КОЕ/мл проявляли культуры, выделенные из ламинолакта и бифиформа, которые ингибировали индикаторные культуры во всех использованных концентрациях. Смесь L. acidophilus (аципол) слабо действовала на три индикаторные культуры (C.coli 1,2, 6, С.jejuni 1,3 и 4 (МИК 7 lg КОЕ/мл). Штамм Lactobacillus plantarum 8R-A3 (лактобактерин) был менее активен, он подавлял размножение только культуры С.jejuni 3 в количестве 8 lg КОЕ/мл, был эффективен in vitro в отношении трех культур С.jejuni 9, C.coli 8. (табл.2).

Таким образом, проведенное исследование подтвердило, что заявляемый метод позволяет осуществлять подбор пробиотических средств и аутопробиотиков и рекомендовать дозы их введения. Пример №2.

У пациента А, возраст 6 лет, при негладком течении кампилобактериоза не был выделен аутопробиотический энтерококк.

Пробиотические культуры выделяли из пробиотических препаратов или продуктов, используя метод истощающего штрихового посева на средах МРС (аципол, ламинолакт), триптиказо-соевый агар для выделения бифидобактерий и сахаромицетов (бифиформ, энтерол), азидная среда для выделения энтерококков (ламинолакт), приготовленные из этих культур инокулюмы помещали в морозильную камеру с температурой -80°С, затем выделяли из фекалий пациента чистую культуру кампилобактерий, выращивали ее на поверхности кампилобакагара, после чего смывали газон в пробирку изотоническим раствором хлорида натрия, заполняли 3 чашки Петри предварительно расплавленным и остуженным до 40-50°С триптиказо-соевым агаром в количестве по 9 мл на чашку, перед исследованием пробиотические и аутопробиотические культуры размораживали, готовили их десятикратные разведения и помещали в первую чашку 1 мл культуры в концентрации 9 lg КОЕ/мл, во вторую чашку 8 lg КОЕ/мл и 7 lg КОЕ/мл в третью чашку, затем в каждой чашке формировали второй слой агара, добавляя дополнительно 10 мл той же среды, после ее застывания на поверхность верхнего слоя агара капельно наносили стандартизированную до концентрации 6 lg КОЕ/мл суспензию кампилобактерий, затем инкубировали в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 48 часов.

Наиболее низкие МИК среди пробиотических культур были выявлены у штамма Е. faecium L3, входящего в состав ламинолакта, (МИК 6 lg КОЕ/мл). Больной был успешно пролечен данным пробиотиком в дозе 6 lg КОЕ/мл.

Для доказательства влияния бактериоцинов как ведущего компонента метаболитов с антикампилобактерной активностью проведен эксперимент с синтетическими бактериоцинами. Антагонистическая активность химически синтезированных (AppliedBiosystems 430-А, США) бактериоцинов: EntB, Епха и Enxp\ L50A, L50B, Ent Р, Ent Ашгантарицин NC8a и NC8p в отношении Campylobacter spp.была определена капельным методом. Капли антимикробных пептидов в концентрации 500 мкг/мл и 50 мкг/мл были добавлены на поверхность засеянных ex tempere штаммов Campylobacter spp.(6 lg КФЕ/мл). Обнаружена зона подавления роста кампилобактерий после нанесения энтероцина Ent В в концентрации 500 мкг/мл.

Следовательно, высокая антагонистическая активность штамма Е. faecium L3 могла быть обусловлена его способностью продуцировать бактериоцины, информация о возможности синтеза которых закодировано в его геноме [Karaseva A., Tsapieva A., Pachebat J., Suvorov A. Draft Genome Sequence of Probiotic Enterococcus faecium StrainL-3 // Genome announcements. -2016.-T.4, №1].

Пример 3.

Пациент Д, возраст 6 месяцев, поступил в приемное отделение на 3 сутки заболевания. Заболеванию предшествовал эпизод острой респираторной инфекции: более 2 недель назад родители заметили у пациента повышение температуры до 38,3°С, насморк и кашель. Лечился -местные антисептики, ингаляционная терапия, антибиотики (амоксициллин 5 дней, панцеф 7 дней). На фоне проводимой терапии отмечалось улучшение состояния. Однако через 2 дня после завершения курса терапии - появление боли в животе, жидкий стул, в связи с чем и был госпитализирован

Эпидемиологический анамнез: накануне болезни ребенка в семье у сестры 4 лет жидкий стул, отказ от еды.

Из анамнеза также известно, что ребенок находится на искусственном вскармливании, получает смесь, предназначенную гипоаллергенную смесь для кормления детей с пищевой аллергией.

При поступлении общее состояние средней тяжести, температура 36,9°С. В биохимическом анализе крови уровень С-реактивного белка повышен (29,1 мг/л). В копрограмме: макроскопически - консистенция жидкая, видимая слизь и кровь; микроскопически - лейкоциты, эритроциты в большом количестве. По результатам посева в кале выявлены Campylobacter coli (штамм 2 из таблицы 1).

На основании жалоб, анамнеза заболевания, умеренно выраженного синдрома общей инфекционной интоксикации, превалирования синдрома диареи (энтерит, гемоколит) и данных лабораторного исследования, установлен диагноз: Кампилобактериоз энтероколитическая форма, вызванный Campylobacter coli, средней степени тяжести. Осложнение: Эксикоз 1 ст.

С поступления назначена лечебная диета - смесь безлактозная и прикорм (безмолочная каша безглютеновая); этиотропные (энтерофурил) и патогенетические средства (аципол, креон, аминокапроновая кислота, этамзилат). Однако в связи с сохранением диареи интоксикационного синдрома со 2-ого дня госпитализации энтерофурил был заменен на азитромицин. Курс терапии азитромицином составил 5 дней. В связи с профузной водянистой диареей со 2 дня стационарного лечения также проведена коррекция лечебного питания: безлактозная смесь заменена на лечебную смесь на основе аминокислот.Длительность применения аминокислотной смеси составила 5 дней. В дальнейшем был осуществлен возврат к безлактозной смеси. На фоне коррекции отмечалось улучшение самочувствия ребенка, стул стал кашицеобразный, температура нормализовалась. Однако при контрольном обследовании в кале повторно обнаружены Campylobacter coli.

Из фекалий пациента выделяли аутопробиотические энтерококки и помещали их в морозильную камеру с температурой -80°С.

Пробиотические культуры выделяли из пробиотических препаратов или продуктов, используя метод истощающего штрихового посева на средах МРС (аципол, ламинолакт), триптиказо-соевый агар для выделения бифидобактерий и сахаромицетов (бифиформ, энтерол), азидная среда для выделения энтерококков (ламинолакт), приготовленные из этих культур инокулюмы помещали в морозильную камеру с температурой -80°С, затем выделяли из фекалий пациента чистую культуру кампилобактерий, выращивали ее на поверхности кампилобакагара, после чего смывали газон в пробирку изотоническим раствором хлорида натрия, заполняли 3 чашки Петри предварительно расплавленным и остуженным до 40-50°С триптиказо-соевым агаром в количестве по 9 мл на чашку, перед исследованием пробиотические и аутопробиотические культуры размораживали, готовили их десятикратные разведения и помещали в первую чашку 1 мл культуры в концентрации 9 lg КОЕ/мл, во вторую чашку 8 lg КОЕ/мл и 7 lg КОЕ/мл в третью чашку, затем в каждой чашке формировали второй слой агара, добавляя дополнительно 10 мл той же среды, после ее застывания на поверхность верхнего слоя агара капельно наносили стандартизированную до концентрации 6 lg КОЕ/мл суспензию кампилобактерий, затем инкубировали в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 48 часов.

Показано, что МИК Е. faecium L3, все клоны индигенных E.faecium составляет 6 lg КОЕ/мл, компонентов бифиформа 6 lg КОЕ/мл. Рекомендовано использование аутопробиотика. Произведена замена безлактозной смеси на кисломолочную, дополнительно назначен жидкий продукт основе аутоштамма Enterococcus faecium в виде закваски с титром 6 lg КОЕ/мл в дозе по 5 мл после утреннего и дневного приема пищи на 10 дней.

В результате проведенного лечения у пациента достигнута устойчивая положительная динамика клинических данных: нормализация температуры тела, частоты и консистенции стула, исчезновение примеси крови в стуле; положительная динамика данных копрограммы. В контрольном бактериологическом исследовании кала на кампилобактериоз - возбудителя не выявлено, что свидетельствовало о выздоровлении от кампилобактериоза. Определение чувствительности кампилобактерий к пробиотикам и аутопробиотикам занимает важное место в курации пациентов с кампилобактериозом. Данные, получаемые при проведении исследования, способствуют снижению негативных последствий кампилобактериоза и делают возможным не использовать антибиотики повторно.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения чувствительности кампилобактерий к пробиотикам и аутопробиотикам, заключающийся в том, что предварительно готовят образцы пробиотических микроорганизмов и выделенных из фекалий пациента аутопробиотических бактериальных культур, затем выделяют из фекалий пациента чистую культуру кампилобактерий, выращивают ее на поверхности кампилобакагара, готовят 3 чашки Петри, заполняют триптиказо-соевым агаром в количестве по 9 мл на чашку, готовят десятикратные разведения пробиотических и аутопробиотических культур, помещают в первую чашку 1 мл культуры в концентрации 9 lg КОЕ/мл, во вторую чашку- 8 lg КОЕ/мл и 7 lg КОЕ/мл в третью чашку, затем в каждой чашке формируют второй слой агара, добавляя дополнительно 10 мл той же среды, после ее застывания на поверхность верхнего слоя агара капельно наносят суспензию кампилобактерий в концентрации 6 lg КОЕ/мл, инкубируют в анаэробных условиях при 37°С в течение 48 ч, после чего визуально оценивают наличие или отсутствие роста этих бактерий в каждой чашке, выбирают чашку с минимальной концентрацией пробиотических или аутопробиотических культур, считают чувствительной культуру, которая не вырастала в третьей чашке, умеренно-устойчивой - во второй чашке, устойчивой - в первой чашке. Изобретение обеспечивает повышение точности оценки чувствительности кампилобактерий к пробиотикам и аутопробиотикам при персонифицированной терапии. 2 табл., 3 пр.

Способ определения чувствительности кампилобактерий к пробиотикам и аутопробиотикам, заключающийся в том, что предварительно готовят образцы пробиотических микроорганизмов и выделенных из фекалий пациента аутопробиотических бактериальных культур, помещают их в морозильную камеру с температурой -80°С, затем выделяют из фекалий пациента чистую культуру кампилобактерий, выращивают ее на поверхности кампилобакагара и смывают газон в пробирку изотоническим раствором хлорида натрия, готовят 3 чашки Петри, заполняют их предварительно расплавленным и остуженным до 40-50°С триптиказо-соевым агаром в количестве по 9 мл на чашку, перед исследованием пробиотические и аутопробиотические культуры размораживают, готовят их десятикратные разведения и помещают в первую чашку 1 мл культуры в концентрации 9 lg КОЕ/мл, во вторую чашку 8 lg КОЕ/мл и 7 lg КОЕ/мл в третью чашку, затем в каждой чашке формируют второй слой агара, добавляя дополнительно 10 мл той же среды, после ее застывания на поверхность верхнего слоя агара капельно наносят стандартизированную путем разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до концентрации 6 lg КОЕ/мл суспензию кампилобактерий, затем инкубируют в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 48 ч, после чего визуально оценивают наличие или отсутствие роста этих бактерий в каждой чашке, выбирают чашку с минимальной концентрацией пробиотических или аутопробиотических культур и считают чувствительной культуру, которая не вырастала в третьей чашке, умеренно-устойчивой - во второй чашке, устойчивой - в первой чашке.