СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АЛЬВЕОЛЯРНЫХ МАКРОФАГОВ ИЗ МОКРОТЫ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно пульмонологии и аллергологии, и может использоваться для получения альвеолярных макрофагов (AM) человека.

Известен способ выделения альвеолярных макрофагов из бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) у новорожденных на градиенте перколла, описанный в одноименной статье авторов Чичахова Д.А. и Пулина A.M., сотрудников Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии (см. сайт: www.airspb.ru/biblio_49.shtml).

Известный способ использовался у недоношенных новорожденных детей, находящихся на искусственной вентиляции легких (ИВЛ).

Известный способ заключается в следующем.

Подготавливают раствор перколла: концентрированный раствор перколла (р=1,131 г/мл, индекс рефракции = 1,3536) изотонируют добавлением одной части 9%-ного раствора NaCl к девяти частям раствора перколла. Для выделения AM избраны градиенты: р=1,078 г/мл (наиболее используемый для выделения мононуклеаров в России) и р=1,048 г/мл (наиболее часто используемый за рубежом для выделения AM). Прерывистые градиенты перколла готовятся разведением изотонированного раствора перколла средой Хенкса до конечной концентрации 55% (р=1,078 г/мл, индекс рефракции -1,3455) и 35% (р=1,048 г/мл, индекс рефракции =1,342). Плотность раствора перед использованием контролируется на рефрактометре. В центрифужную (пластиковую) пробирку наливаются Градиенты перколла по 2 мл в убывающей концентрации, начиная от дна, и на них наслаивается взвесь клеток БАЛЖ (плотность суспензии клеток 2×10 в шестой степени кл/мл) в объеме 2 мл. Сепарация клеток производится при комнатной температуре центрифугированием при 1500 об/мин в течение 20 мин. Слой AM в виде полосы белого цвета над сепарирующим раствором отсасывается пастеровской пипеткой и дважды отмывается раствором Хенкса в течение 10 мин при 1500 об/мин, ресуспендируется. Идентификация клеток производится после окраски по Паппенгейму на светооптическом микроскопе. Полученные результаты показывают, что наибольшая концентрация макрофагов получена на градиенте плотности перколла с концентрацией 35% (р=1,048 г/мл, индекс рефракции =1,342).

Недостатком известного способа является то, что он является достаточно сложным, т.к приходится готовить раствор перколла, который к тому же является дорогостоящим. Кроме того, получение макрофагов по данному способу является весьма длительным - около 2, 5 часов. При этом в качестве исследуемого материала используется бронхоальвеолярный лаваж, который получают инвазивным способом

Известен способ выделения альвеолярных макрофагов, описанный в статье Лобановой Е.М. и Тагановича А.Д. «Фагоцитарная активность стимулированных альвеолярных макрофагов в условиях гипоксии и гипертермии» (см. сайт: http://itlab.anitex.by/msmi/bmm/01.2005/25html) и выбранный в качестве прототипа.

Известный способ заключается в следующем.

Проводят лаваж изолированных легких раствором, содержащим 140 ммоль NaCl, 5 ммоль KCl, 2,5 ммоль фосфатный буфер, 10 ммоль HEPES, 6 ммоль глюкоза, 0,2 ммоль EGNA, pH 7,40. Лаважную жидкость фильтруют и центрифугируют в течение 10 минут при 900 оборотах в минуту и температуре 40°С. Клеточный осадок ресуспендируют в 3 мл питательной среды DME9 (Sigma CШA) с добавлением в нее антибиотиков (пенициллин, гентамицин) и L-глутамина. Далее в среду вводят модуляторы клеточного метаболизма - тетрафорболмиристилацетат (ТФА), дибутирил ЦАМФ и АТФ (Sigma, CШA) в конечной концентрации 10^-7, 10^-4 и 10^-5 М соответственно. Клеточную суспензию высевают на пластиковые чашки Петри (Falcon, ФРГ) в конечной концентрации 2,5×10⁵ макрофагов на чашку (количество клеток подсчитывают в камере Горяева) и инкубируют 2 часа в условиях нормального снабжения кислородом и в условиях гипоксии (1-10% O₂, 5% СO₂, 85% N₂, 2-5% O₂, 5% СO₂, 90% N₂) и в интервале температур 37-42°С. AM выделяют из смеси альвеолярных клеток путем прилипания их к поверхности чашек Петри. После инкубации жидкую фазу отсасывают, к прилипшим макрофагам добавляют свежую питательную среду (без антибиотиков) и 0,1 мл бактериальной суспензии St. aureus из расчета 5×10⁴ на чашку. После 1 часа инкубации чашку промывают, клетки фиксируют метанолом, окрашивают по Романовскому - Гимзе и микроскопируют с применением иммерсионного объектива. Контролем служат AM, инкубировавшиеся при 37°С и нормальном снабжении кислородом.

Недостаток известного способа заключается в том, что возможности его применения ограничены: он используется только для получения альвеолярных макрофагов из умерщвленных животных, а именно - крыс. Кроме того, при получении макрофагов используется большое количество реактивов и питательных средств (антибиотики, модуляторы клеточного метаболизма), что увеличивает затратность способа и делает его недоступным для некоторых медицинских учреждений.

Задачей заявляемого способа является расширение возможностей его применения при высоком качестве получаемого продукта (альвеолярных макрофагов) и общедоступности.

Поставленная задача решается тем, что в способе выделения макрофагов из мокроты, заключающемся в том, что берут исследуемый материал, который фильтруют, получают осадок путем центрифугирования, приводят его к однородному составу путем ресуспендирования, удаляют жидкую фазу, высевают клетки на чашку Петри, инкубируют при нормальном снабжении кислородом и температуре 37°С и выделяют макрофаги, согласно изобретению в качестве исследуемого материала берут неселективную мокроту, затем уменьшают вязкость мокроты с помощью муколитического препарата, проводят ресуспендирование и перемешивание с помощью магнитной мешалки для повышения однородности смеси, после чего снижают концентрацию муколитического препарата, снова ресуспендируют, центрифугируют первый раз, затем удаляют жидкую фазу и снова ресуспендируют, проводят повторное центрифугирование смеси, уменьшают ее вязкость, ресуспендируют и высевают клетки, после чего инкубируют клетки в течение 30 мин, затем выделяют макрофаги, при этом ресуспендирование проводят стерильной пипеткой Пастера, а снижение концентрации муколитического препарата - разбавлением смеси теплым стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрия.

При этом мокрота может использоваться индуцированная или спонтанная, а в качестве муколитического препарата - 10%-ный раствор ацетилцистеина (АЦЦ).

Использование в качестве исследуемого материала мокроты позволяет применять заявляемый способ для пациентов любого возраста при высоком качестве получаемого материала.

Неоднократное ресуспендирование с помощью стерильной пипетки Пастера, дополненное изначально перемешиванием с помощью магнитной мешалки, обеспечивает более высокую однородность смеси, а ее фильтрование, снижение вязкости муколитическим препаратом и последующее разбавление 0,9%-ным раствором хлорида натрия для снижения концентрации препарата и более тщательного отмывания клеток от слизи в совокупности с повторным центрифугированием позволяет получить высокую чистоту конечного продукта, т.е. альвеолярных макрофагов. При этом выполнение большинства операций с помощью широкодоступных и недорогих расходных материалов (ресуспендирования с помощью пипетки Пастера, снижения вязкости смеси муколитическим препаратом, снижения его концентрации 0,9%-ным раствором хлорида натрия, а также неоднократного центрифугирования) делает способ общедоступным для любого медицинского учреждения. Кроме того, заявляемый способ, благодаря «щадящей» методике выделения макрофагов, обеспечивает высокую сохранность жизнеспособных клеток (до 96%).

Технический результат - обеспечение возможности использования способа для всех возрастов населения и доступности его для любого медицинского учреждения.

Заявляемый способ обладает новизной в сравнении с прототипом, отличаясь от него такими существенными признаками как использование в качестве исследуемого материала неселективной мокроты, уменьшение вязкости мокроты с помощью муколитического препарата, обеспечение однородности смеси посредством ресуспендирования и перемешивания с помощью магнитной мешалки, последующее снижение концентрации муколитического препарата, повторное ресуспендирование, центрифугирование, удаление жидкой фазы, очередное ресуспендирование, проведение повторного центрифугирования смеси, уменьшение вязкости смеси, ресуспендирование перед высеванием клеток, инкубирование в течение 30 мин перед выделением макрофагов, использование для ресуспендирования стерильной пипетки Пастера, а для снижения концентрации муколитического препарата - разбавление смеси теплым стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрия, обеспечивающими в совокупности достижение заданного результата.

Заявителю не известны технические решения, обладающие указанными отличительными признаками, обеспечивающими в совокупности достижение заданного результата, поэтому он считает, что заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ может найти широкое "применение в медицине, а именно в пульмонологии и аллергологии, а потому соответствует критерию «промышленная применимость».

Заявляемый способ заключается в следующем.

Берут исследуемый материал - неселективную мокроту. С помощью муколитического материала уменьшают вязкость мокроты. Полученную смесь фильтруют. Проводят ресуспендирование смеси и ее перемешивание с помощью магнитной мешалки для повышения однородности. После этого снижают концентрацию муколитического препарата и снова ресуспендируют смесь. Далее получают осадок путем центрифугирования смеси и удаляют жидкую фазу. Приводят получившийся осадок к однородному составу путем ресуспендирования и проводят повторное центрифугирование смеси. Затем уменьшают ее вязкость, снова ресуспендируют и высевают клетки на чашку Петри. Далее их инкубируют при нормальном снабжении кислородом и температуре 37°С в течение 30 минут и выделяют макрофаги. При этом ресуспендирование проводят стерильной пипеткой Пастера, а снижение концентрации муколитического препарата - разбавлением смеси теплым стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрия.

Мокрота может использоваться индуцированная или спонтанная, а в качестве муколитического препарата - 10%-ный раствор ацетилцистеина (АЦЦ).

Более конкретно заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Из неселективной мокроты не позднее, чем через 20 минут с момента ее получения, отделяют от слюны кусочки мокроты. Полученный материал (0, 5 мл) помещают в стерильный бюкс объемом 5 мл, куда добавляют 1 мл 10-ти процентного раствора ацетилцистеина для уменьшения вязкости мокроты, и фильтруют смесь через стерильную нейлоновую ткань.

Затем производят ресуспендирование полученной смеси в течение 2 минут при помощи стерильной пипетки Пастера. Далее полученную смесь устанавливают на магнитную мешалку на 5 минут при скорости вращения 200 оборотов в минуту, благодаря чему достигается более равномерное смешивание мокроты и раствора ацетилцистеина.

После этого в стерильный бюкс добавляют до 3 мл теплый 0, 9%-ный стерильный раствор хлорида натрия для снижения концентрации ацетилцистеина и вновь проводят ресуспендирование при помощи пипетки Пастера. Затем полученную смесь фильтруют через стерильную нейлоновую ткань в стерильную пробирку.

Добавляют в бюкс, из которого вылили смесь, 2 мл теплого 0, 9%-ного стерильного раствора хлорида натрия, слегка встряхивают и вновь профильтровывают через нейлоновую ткань в ту же пробирку. Отфильтрованную смесь осторожно ресуспендируют 30 секунд и затем центрифугируют 7 минут на 3000 об/мин при комнатной температуре с целью получения клеточного осадка на дне пробирки. Затем сливают жидкую часть. К оставшемуся на дне пробирки осадку добавляют 3 мл теплого 0, 9%-ного стерильного раствора хлорида натрия. Осадок ресуспендируют в течение 1 мин стерильной пипеткой Пастера.

Ресуспендированный осадок вновь центрифугируют 7 минут при 3000 об/мин при комнатной температуре.

Затем жидкую часть сливают, к осадку добавляют 0,5 мл теплого 0,9%-ного стерильного раствора хлорида натрия. Производят ресуспендирование стерильной пипеткой Пастера в течение 30 сек. Наносят 0,1 мл смеси на чистое обезжиренное предметное стекло. Затем предметное стекло переносят в чашку Петри, в которой на дне находится фильтровальная бумага, пропитанная теплым стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрия. Чашку Петри закрывают крышкой и помещают в термостат с температурой 37°С на 30 минут. После извлечения чашки Петри промывают предметное стекло 0, 5 мл теплого стерильного 0, 9%-ного раствора хлорида натрия с целью удаления неприлипших клеток.

Проведенные авторами стандартные тесты по оценке жизнеспособности макрофагов показали, что количество живых клеток, полученных с помощью данного способа составляет не менее 96%.

Полученные альвеолярные макрофаги далее могут использоваться для проведения различных имунно-гистохимических исследований, например, для исследования фагоцитарной активности клеток.

В сравнении с прототипом заявляемый способ получения альвеолярных макрофагов имеет более широкие эксплуатационные возможности при более высоком качестве конечного продукта.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии и аллергологии, и может использоваться для получения макрофагов легких человека. Для этого в качестве исследуемого материала берут неселективную мокроту. Уменьшают ее вязкость с помощью муколитического препарата, затем фильтруют, получают осадок путем центрифугирования, проводят ресуспендирование стерильной пипеткой Пастера и перемешивание с помощью магнитной мешалки. После этого снижают концентрацию муколитического препарата разбавлением смеси теплым стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрия, снова ресуспендируют и центрифугируют. Затем удаляют жидкую фазу, снова ресуспендируют, проводят повторное центрифугирование смеси, уменьшают ее вязкость, еще раз ресуспендируют и высевают клетки. Клетки инкубируют при нормальном снабжении кислородом и температуре 37°С в течение 30 мин, затем выделяют макрофаги. Изобретение позволяет достичь высокой чистоты альвеолярных макрофагов, а также обеспечивает высокую сохранность жизнеспособных клеток. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ выделения альвеолярных макрофагов из мокроты, заключающийся в том, что берут исследуемый материал, который фильтруют, получают осадок путем центрифугирования, приводят его к однородному составу путем ресуспендирования, удаляют жидкую фазу, высевают клетки на чашку Петри, инкубируют при нормальном снабжении кислородом и температуре 37°С, выделяют макрофаги, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала берут неселективную мокроту, затем уменьшают вязкость мокроты с помощью муколитического препарата, проводят ресуспендирование и перемешивание с помощью магнитной мешалки для повышения однородности смеси, после чего снижают концентрацию муколитического препарата, снова ресуспендируют, центрифугируют первый раз, затем удаляют жидкую фазу и снова ресуспендируют, проводят повторное центрифугирование смеси, уменьшают ее вязкость, ресуспендируют и высевают клетки, после чего инкубируют клетки в течение 30 мин, затем выделяют макрофаги, при этом ресуспендирование проводят стерильной пипеткой Пастера, а снижение концентрации муколитического препарата - разбавлением смеси теплым стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрия.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве мокроты берут индуцированную мокроту.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве мокроты берут спонтанную мокроту.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что вязкость мокроты снижают с помощью 10%-ного раствора ацетилцистеина.