СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОТГРАНИЧЕННОЙ ГЕМАНГИОМЫ ХОРИОИДЕИ И БЕСПИГМЕНТНОЙ МЕЛАНОМЫ ХОРИОИДЕИ Российский патент 2022 года по МПК G01N33/574 G01N33/49 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии, а именно, к офтальмоонкологии, и предназначено для неинвазивной дифференциальной диагностики отграниченной гемангиомы хориоидеи и беспигментной меланомы хориоидеи с помощью молекулярно-генетического исследования.

Отграниченная гемангиома хориоидеи - редкая доброкачественная внутриглазная опухоль, чаще всего представленная в виде солитарного розоватого узла, локализованного в заднем полюсе глазного дна. Первые симптомы заболевания проявляются во взрослом возрасте, обычно на 4-й декаде жизни, когда у пациентов выявляют суб- или интраретинальный экссудат в макулярной области, что приводит к резкому снижению остроты зрения [Shields C.L., Honavar S.G., Shields J.A., Cater J., Demirci H. Circumscribed choroidal hemangioma: Clinical manifestations and factors predictive of visual outcome in 200 consecutive cases. Ophthalmology. 2001; 108:2237-2248; Бровкина А.Ф., Стоюхина A.C., Мусаткина И.В. Отграниченная гемангиома хориоидеи: особенности течения, лечение. Клиническая офтальмология. 2020; 20(2):56-62.]. В ряде случаев диагноз устанавливают на основании данных офтальмоскопии. Однако в большинстве случаев при необходимости применяют инструментальные методы исследования, такие как флуоресцентная ангиография и оптическая когерентная томография, в том числе в ангиографическом режиме [Chawla R., Tripathy K., Sharma A., Vohra R. Swept source optical coherence tomography-angiography of choroid in choroidal hemangioma before and after laser photocoagulation. Indian J Ophthalmol 2017; 65(8):751-754.].

Наиболее часто при подозрении на отграниченную гемангиому хориоидеи проводят дифференциальную диагностику с другими внутриглазными новообразованиями, прежде всего беспигментной увеальной меланомой [Sen М., Honavar S.G. Circumscribed choroidal hemangioma: An overview of chnicai manifestation, diagnosis and management. Indian J Ophthalmol. 2019; 67(12): 1965-1973; Нероев В.В., Саакян С.В., Мякошина Е.Б., Охоцимская Т.Д., Фадеева В.А. Способ дифференциальной диагностики начальной увеальной меланомы и отграниченной гемангиомы хориоидеи с помощью оптической когерентной томографии-ангиографии. Патент на изобретение №2622380. Опубликовано: 14.06.2017 Бюл. №17].

Помимо вышеперечисленных клинических и инструментальных методов исследования, в последние годы уделяется особое внимание молекулярно-генетической диагностике и дифференциальной диагностике внутриглазных новообразований [Le Guin C.H.D., Metz К.A., Kreis S.H., Bechrakis N.E., Bornfeld N., Zeschnigk M. Lohmann D.R. GNAQ Q209R Mutations Are Highly Specific for Circumscribed Choroidal Hemangioma. Cancers (Basel). 2019; 11(7):1031; Francis J.H., Milman Т., Grossniklaus H., Albert D., Folberg R., Levitin G., Coupland S., Catalanotti F., Rabady D., Kandoth C., Busam K., Abramson D. GNAQ Mutations in Diffuse and Solitary Choroidal Hemangiomas. Ophthalmology. 2019; 126(5):759-763.]. В то же время полученные данные носят зачастую разноречивый характер, а сами исследования единичны. В связи с существенными различиями в тактике хирургического лечения, наблюдения и витального прогноза больных с отграниченноф гемангиомой и беспигментной меланомой хориоидеи в настоящее время существует потребность в разработке малоинвазивного способа молекулярно-генетической дифференциальной диагностики указанных внутриглазных новообразований.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ того же назначения, при котором проводят выявление мутаций в генах GNAO и CNA11 при тонкоигольной аспирационной биопсии или энуклеации у пациентов с отграниченной гемангиомой и беспигментной меланомой хориоидеи методом секвенирования, при этом в зависимости от частоты выявления указанных мутаций проводят дифференциальную диагностику данных внутриглазных новообразований [Le Guin C.H.D., Metz K.А., Kreis S.H., Bechrakis N.E., Bornfeid N., Zeschnigk M., Lohmann D.R. GNAQ Q209R Mutations Are Highiy Specific for Circumscribed Choroidai Hemangioma. Cancers (Basel). 2019; 11(7):1031]. Недостатком ближайшего аналога является необходимость выполнения инвазивного вмешательства (тонкоигольной аспирационной биопсии или энуклеации) для получения материала для молекулярно-генетического исследования, что может привести к развитию вторичных осложнений (гемофтальм, отслойка сетчатки, снижение остроты зрения при центральной локализации опухоли, локальное распространение опухоли в месте проведения тонкоигольной аспирационной биопсии).

Задачей предлагаемого изобретения является создание неинвазивного способа молекулярно-генетической дифференциальной диагностики отграниченной гемангиомы и беспигментной меланомы хориоидеи.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение достоверности исследования и предупреждение развития вторичных осложнений.

Технический результат достигается за счет определения цоДНК с мутациями в экзонах 4 и/или 5 генов GNAQ/CNA11 в периферической крови пациентов.

Преимуществом выявления мутаций в цоДНК периферической крови является отсутствие необходимости выполнения инвазивного вмешательства (тонкоигольной аспирационной биопсии), связанного с возможными вторичными осложнениями (гемофтальм, отслойка сетчатки, снижение остроты зрения при центральной локализации опухоли, локальное распространение опухоли в месте проведения тонкоигольной аспирационной биопсии), а также снижение риска получения ложноположительных результатов при попадании в просвет иглы клеток ретинального пигментного эпителия при биопсии отграниченной гемангиомы хориоидеи. Выполнение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с выявлением мутаций в экзонах 4 и/или 5 генов GNAQ/GNA11 позволяет также существенно сократить стоимость исследования по сравнению с секвенированием.

Нами было проведено исследование на 30 ранее не леченных пациентах с отграниченной гемангиомой хориоидеи, выявленной клинически и по данным эхографии и оптической когерентной томографии, в том числе в ангиографическом режиме. Для мутаций в генах GNAQ/GNA11 в качестве группы сравнения использовали пациентов с беспигментной меланомой хориоидеи, выявленной клинически и по данным эхографии и оптической когерентной томографии, в том числе в ангиографическом режиме, сопоставимую по возрасту и полу (n=30). В обеих группах определяли геномную цоДНК, выделенную из плазмы периферической крови с помощью протеиназы К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом. Выделенные образцы ДНК хранили при температуре -20°С. Качественную оценку ДНК проводили с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 (NanoDrop, США). Изучение мутаций в генах GNAQ/GNA11 выполняли с помощью ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) методом анализа кривых плавления. Амплификацию проводили в согласно протоколу амплификации для использованного набора и программным настройкам Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1х qPCRmix-HS SYBR, по 0,4 мкМ каждого праймера (Таблица 1), 50-100 нг ДНК матрицы; в 96-луночных планшетах «Optical Reaction Plate» по следующей программе: предварительная денатурация: 1 цикл, 950С, 5 мин; ПЦР: 40 циклов {950С - 30с; 600С - 30с; 720С - 30с}. Плавление продуктов амплификации выполняли в диапазоне 55-95°C с увеличением температуры на 0,5°С каждые 10с. Обработку полученных данных осуществляли в программной среде Precision Melt Analysis Software (Bio-Rad).

Проведенное исследование позволило выявить достоверную связь мутаций в экзонах 4 и 5 генов GNAQ/CNA11 с наличием беспигментной меланомы хориоидеи (27/30, 90%). В группе пациентов с отграниченной гемангиомой хориоидеи указанные мутации не выявлены. Результаты послужили основанием для использования предложенного способа в первичной диагностике отграниченной гемангиомы хориоидеи и беспигментной меланомы хориоидеи и обеспечили возможность отказаться от травматичного и не во всех случаях достоверного способа дифференциальной диагностики при проведении секвенирования после тонкоигольной аспирационной биопсии или энуклеации.

Способ осуществляют следующим образом.

В плазме периферической крови пациента с беспигментной меланомой или отграниченной гемангиомой хориоидеи определяют геномную цоДНК с мутациями в 4 и/или 5 экзоне генов GNAQ/GNA11 c помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. При их наличии определяют беспигментную меланому, а при отсутствии - отграниченную гемангиому хориоидеи.

Пример 1. Пациент С, в возрасте 53 лет направлен с диагнозом внутриглазное новообразование хориоидеи правого глаза. При осмотре установлено зрение OD=0,6 н/к, OS=1,0. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы, передний отрезок глаза без видимой патологии. При офтальмоскопии юкстапапиллярно выявлено слегка проминирующее розоватое образование без четких границ, вокруг образования определен отек прилежащих тканей. По данным ультразвукового исследования определяли «плюс-ткань» с высотой 2,2 мм, диаметром основания 7,9 мм. При выполнении оптической когерентной томографии-ангиографии под ретинальным пигментным эпителием определяли наличие неоваскулярного компонента в зоне новообразования с древовидным и диффузно-рассыпным типом васкуляризации, а также отсутствие аваскулярной зоны в области склона опухоли. По данным клинико-инструментальных методов исследования поставлен диагноз отграниченная гемангиома хориоидеи. Проведено молекулярно-генетическое исследование периферической крови: мутаций в экзонах 4 и/или 5 генов GNAQ/GNA11 не выявлено, что подтверждает поставленный ранее диагноз. Пациентке проведена отграничительная лазеркоагуляция образования в связи с высоким риском снижения зрения.

Пример 2. Пациентка В., в возрасте 66 лет направлена с диагнозом беспигментное внутриглазное новообразование хориоидеи левого глаза. При осмотре установлено зрение обоих глаз - 0,7. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы, передний отрезок глаза без видимой патологии. При офтальмоскопии на средней периферии определен проминирующий беспигментный очаг без четких границ. По данным эхографии «плюс»-ткань с высотой опухоли 2,5 мм, диаметром основания 7,1 мм, собственные сосуды опухоли. По данным оптической когерентной томографии-ангиографии определен под ретинальным пигментным эпителием выявлен неоваскулярный компонент в зоне новообразования с петлевидным характером собственной васкуляризации с многочисленными изгибами, переплетениями с ограничивающей аваскулярной зоной, соответствующей склону опухоли. В соответствии с полученными данными установлен диагноз начальная беспигментная меланома хориоидеи. Проведено молекулярно-генетическое исследование периферической крови: выявлена мутация в 5 экзоне гена CNA11, что свидетельствовало о наличии меланомы хориоидеи. В дальнейшем пациентке проведено органосохранное лечение (брахитерапия) с благоприятным функциональным эффектом (полный регресс опухолевой ткани).

Пример 3. Пациентка Д., в возрасте 62 лет обратилась с диагнозом беспигментное внутриглазное новообразование хориоидеи правого глаза. При осмотре установлено зрение OD=0,2sph-2,0=0,5, OS=0,2sph-2,5=0,9. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы, передний отрезок глаза без видимой патологии. При офтальмоскопии парамакулярно определен проминирующий беспигментный очаг без четких границ. По данным эхографии «плюс»-ткань с высотой опухоли 1,8 мм, диаметром основания 5,6 мм, собственные сосуды опухоли. По данным оптической когерентной томографии-ангиографии выявлены характерные для увеальной меланомы признаки. В соответствии с полученными данными установлен диагноз начальная беспигментная меланома хориоидеи. Пациентке выполнено молекулярно-генетическое исследование периферической крови: выявлена мутация в 4 экзоне гена GNAQ, что позволило подтвердить диагноз меланомы хориоидее. Больной выполнено органосохранное лечение (транспупиллярная термотерапия).

Пример 4. Пациент Ф., в возрасте 71 года направлен с диагнозом беспигментное внутриглазное новообразование хориоидеи левого глаза. При осмотре установлено зрение OD=0,7 н/к, OS=0,9 н/к. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы, передний отрезок глаза без видимой патологии. При офтальмоскопии на крайней периферии определен проминирующий беспигментный очаг без четких границ. По данным эхографии «плюс»-ткань с высотой опухоли 3,1 мм, диаметром основания 9,8 мм, собственные сосуды опухоли. По данным оптической когерентной томографии-ангиографии выявлены характерные для увеальной меланомы признаки. В соответствии с полученными данными установлен диагноз беспигментная меланома хориоидеи. Пациенту выполнено молекулярно-генетическое исследование периферической крови: выявлены мутации в 4 и 5 экзонах гена GN411, что позволило подтвердить диагноз меланомы хориоидее. Больному выполнено проведена брахитерапия опухоли, через 1 год наблюдений отмечена положительная динамика в виде лучевой реакции и резорбции опухолевого узла.

Таким образом, предложенный способ обеспечивает проведение неинвазивной достоверной дифференциальной диагностики у пациентов с отграниченной гемангиомой и беспигментной меланомой хориоидеи с помощью молекулярно-генетического исследования цоДНК в периферической крови.

Изобретение относится к области офтальмологии, в частности к офтальмоонкологии. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени определяют геномную цоДНК с мутациями генов GNAQ/GNA11. При наличии мутаций в 4 и/или 5 экзоне определяют беспигментную меланому, а при отсутствии - отграниченную гемангиому хориоидеи. Изобретение обеспечивает повышение достоверности исследования и предупреждение развития вторичных осложнений. 4 пр.

Способ дифференциальной диагностики отграниченной гемангиомы и беспигментной меланомы хориоидеи, включающий определение геномной цоДНК с мутациями генов GNAQ/GNA11, отличающийся тем, что геномную цоДНК определяют в плазме периферической крови с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и при наличии мутаций в 4 и/или 5 экзоне определяют беспигментную меланому, а при отсутствии - отграниченную гемангиому хориоидеи.