СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО БЕЛКОВОГО ПРЕПАРАТА И ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛ, ПОЛУЧЕННЫЙ ПО ТАКОМУ СПОСОБУ Российский патент 2022 года по МПК A61K39/395 A61K47/18 A61K47/26 

Область техники

Представленное изобретение касается способа получения белкового препарата, который включает эксципиенты и по меньшей мере один терапевтический белок.

Изобретение представляет особый интерес в области составов на основе антител, предназначенных для терапевтического применения, и также направлено на препарат на основе антител, полученного по этому способу.

Предпосылки создания изобретения

Изобретение более конкретно касается способов, последовательно включающих:

обеспечение раствора, включающего указанный белок;

концентрирование белка в растворе с использованием первой стадии ультрафильтраци и;

диафильтрование раствора, полученного таким образом, с использованием буфера для диафильтрации, который включает, по меньшей мере, один первый эксципиент, посредством которого получают ретентат, включающий белок и первый эксципиент;

дальнейшее концентрирование белка в ретентате на второй стадии ультрафильтрации в ультрафильтрационном оборудовании;

добавление, по меньшей мере, одного конечного эксципиента, посредством которого получают белковый препарат с требуемой концентрацией белка и который включает указанный первый и конечный эксципиенты.

В общем, конечные белковые препараты для терапевтических антител включают, по меньшей мере, аминокислоту, такую как гистидин, который добавляют на стадии диафильтрации, и сахар, действующий как стабилизатор, такой как трегалоза. Трегалоза обычно добавляют с другими эксципиентами на конечной стадии добавления.

В общепринятых способах, применяемых к терапевтическим антителам, указанные выше стадии проводят с использованием белкового раствора, после того, как его почистили с помощью нескольких стадий очистки, обычно включающих фильтрацию, удерживающую вирус, в качестве последней стадии очистки. Белковый раствор (или "продукт") концентрируют на первой стадии ультрафильтрации, исходя из концентрации приблизительно 5-20 г/л до концентрации приблизительно 40-100 г/л (в зависимости от белка). Затем концентрированный продукт подвергают диафильтрации в буфере для диафильтрации, таком как гистидиновый. В некоторых случаях, буфер для диафильтрации может представлять собой другой стандартный буфер, такой как ацетатный, трис или фосфатный. Буфер для диафильтрации выбирают на основании конечного белкового препарата, а также какого-либо отклонения, которое требуется в связи с доннановским эффектом. Доннановский эффект происходит, поскольку продукт концентрируют и в результате приводит к исключению некоторых заряженных буферных компонентов, например, гистидина. Буфер для диафильтрации, поэтому, как правило, регулируют до более высокой концентрации буфера и более низкого значения рН, чем указано для белкового препарата. Как только диафильтрация завершится, продукт идет на вторую стадию ультрафильтрации для концентрирования приблизительно на 50% выше желаемой концентрации белка для конечного белкового препарата. Затем продукт удаляют из системы ультрафильтрации, и систему промывают для того, чтобы извлечь дополнительный продукт. При конечной концентрации более чем на 50% выше желаемой концентрации в белковом препарате, все промывные могут быть обратно добавлены в продукт для максимального извлечения, без чрезмерного разбавления продукта. Затем добавляют эксципиенты (сахар, поверхностно-активное вещество, хелатирующий агент, и т.п.) в виде концентрированного раствора, как правило, с коэффициентом разбавления приблизительно 4, что означает, что 1 единичный объем концентрированного раствора эксципиента добавляют к 3 единичным объемам продукта. Коэффициент разбавления 4 основан на максимальной растворимости сахарного компонента раствора эксципиента, которая, как правило, является ограничивающим фактором. Если необходимо, продукт затем дополнительно разбавляют буфером для формуляции для регулирования конечной требуемой концентрации.

Такие общепринятые способы поэтому не могут быть применимы, когда желательным является получить высококонцентрированный белок в конечном препарате, и даже больше, когда белок имеет особенно высокую вязкость.

Например, в случае терапевтического препарата на основе антител с желаемой конечной концентрацией 150 г/л, вязкость молекулы исключает концентрирование до целевого значения на 50% выше желаемой конечной концентрации.

Целью изобретения является создание способа получения белкового препарата, который может быть применен к высоковязким и высококонцентрированным белкам.

Еще одной целью изобретения является то, что данный способ может быть реализован в масштабе производства без отрицательного влияния на общий выход производственного процесса и без дополнительных затрат из-за чрезмерных отходов некоторых эксципиентов. В частности, целью является сохранение использования компонентов сахара, которые являются особенно дорогостоящими, на том же уровне, что и в общепринятых способах.

Еще одной целью изобретения является сохранить стабильность белка на всех стадиях способа и защитить белок от агрегации.

Сущность изобретения

В соответствии с первым аспектом представленного изобретения, предусматривается способ указанного выше типа, дополнительно включающий, перед второй стадией ультрафильтрации, добавление второго эксципиента к ретентату, полученному на стадии диафильтрации.

За счет внесения добавки второго эксципиента, в частности трегалозы (или, в более общем случае, сахара), до постдиафильтрации, оставшиеся эксципиенты могут быть добавлены в гораздо более высокой концентрации на последующей стадии, таким образом, образуя более низкое разбавление продукта. Это, в свою очередь, означает, что максимальная требуемая концентрация может быть доведена до только приблизительно на 10% (в некоторых случаях от 5 до 15%) выше конечной желаемой концентрации по сравнению со значением приблизительно на 50% для общепринятых способов. Данное значение 10% может быть получено с использованием стандартного ультрафильтрационного оборудования, даже при более высокой молекулярной вязкости. Это также позволяет извлекать продукт из промывных и, таким образом, позволяет получить 90% выход по способу ультрафильтрации/диафильтрации.

Кроме того, добавление второго эксципиента (сахара) перед конечным концентрированием защищает белок от агрегации.

В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления изобретения:

- способ дополнительно включает, после стадии (е) и перед стадией (f), промывание ультрафильтрационного оборудования буфером для промывки, в результате чего улучшается выделение белка;

- буфер для промывки содержит первый и второй эксципиенты в концентрациях по существу равных, соответственно, концентрациям первого и второго эксципиентов в белковом препарате;

- первый эксципиент представляет собой аминокислоту, предпочтительно гистидин;

- первый эксципиент в белковом препарате имеет концентрацию от 16 до 24 мМ, предпочтительно от 17 до 23 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 20 мМ;

- второй эксципиент представляет собой сахар, предпочтительно дисахарид;

- конечные эксципиенты включают поверхностно-активное вещество, предпочтительно полисорбат 80;

- конечные эксципиенты включают хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА;

- белковый препарат имеет концентрацию белка от 110 до 165 г/л;

- белок представляет собой антитело.

В первом предпочтительном варианте осуществления:

- антитело представляет собой анти-PCSK9 (пропротеинконвертаза 9-го субтилизин-кексинового типа) антитело;

- анти-PCSK9 антитело выбирают из группы, состоящей из бокоцизумаба, эволокумаба (REPATHA™), алирокумаба (PRALUENT™), REGN728, 31Н4, 11F1, 12Н11, 8А1, 8А3, 3С4, 300N, 1D05, LGT209, RG7652, и LY3015014;

- анти-PCSK9 антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), включающий область определения комплементарности CDR1, CDR2, и CDR3 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1; и вариабельный участок легкой цепи (VL), включающий CDR1, CDR2, и CDR3 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2; или, альтернативно, анти-PCSK9 антитело содержит VH CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 4, или 5, VH CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6 или 7, VH CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8, VL CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 9, VL CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10, и VL CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 11;

- белковый препарат имеет концентрацию белка от 135 до 165 г/л, предпочтительно от 142 до 158 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 150 г/л;

- второй эксципиент в белковом препарате представляет собой трегалозу в концентрации от 67,2 до 100,8 г/л, предпочтительно от 71,4 до 96,6 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 84 г/л;

- конечные эксципиенты включают полисорбат 80, который в белковом препарате имеет концентрацию от 0,16 до 0,24 г/л, предпочтительно от 0,17 до 0,23 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 0,2 г/л;

- конечные эксципиенты включают ЭДТА, который в белковом препарате, имеет концентрацию от 0,04 и 0,06 г/л, предпочтительно от 0,0425 до 0,0575 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 0,05 г/л;

- белковый препарат имеет рН от 5,2 до 5,8, предпочтительно приблизительно 5,5;

- раствор, предусмотренный на стадии (а) имеет концентрацию белка от 5 до 20 г/л;

- белок концентрируют до 80-120 г/л, предпочтительно 90-110 г/л, и наиболее предпочтительно до приблизительно 100 г/л, на первой стадии ультрафильтрации;

- белок концентрируют до 143-173 г/л, предпочтительно до 150-166 г/л, и наиболее предпочтительно до приблизительно 158 г/л, на второй стадии ультрафильтраци и;

- первый эксципиент в буфере для диафильтрации имеет концентрацию более высокую, чем концентрация первого эксципиента в белковом препарате, причем указанная концентрация первого эксципиента в буфере для диафильтрации составляет предпочтительно от 29,75 и 40,25 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 35 мМ;

- буфер для диафильтрации имеет рН от 5,1 до 5,5, предпочтительно приблизительно 5,3;

- добавление второго эксципиента к ретентату полученному на стадии диафильтрации, достигается добавлением первого аддитивного раствора к ретентату, причем указанный первый аддитивный раствор включает второй эксципиент в концентрации от 340 до 460 г/л, предпочтительно от 380 до 420 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 400 г/л;

- первый аддитивный раствор содержит первый эксципиент в концентрации более низкой, чем концентрация первого эксципиента в буфере для диафильтрации и более высокой, чем концентрация первого эксципиента в белковом препарате, причем указанная концентрация первого эксципиента в первом аддитивном растворе составляет предпочтительно от 25,5 до 34,5 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 30 мМ;

- первый аддитивный раствор дополнительно содержит конечный эксципиент;

- первый аддитивный раствор содержит приблизительно 30 мМ гистидина и приблизительно 400 г/л трегалозы;

- добавление первого аддитивного раствора к ретентату осуществляется при коэффициенте разбавления приблизительно 4,15, при этом один объем первого аддитивного раствора добавляют приблизительно в 3,15 раза к такому же объему ретентата;

- добавление конечных эксципиентов включает стадию добавления второго аддитивного раствора к раствору, полученному на второй стадии ультрафильтрации, причем указанный второй аддитивный раствор включает второй эксципиент в концентрации более низкой, чем концентрация второго эксципиента в первом аддитивном растворе, и более высокой, чем концентрация второго эксципиента в белковом препарате;

- второй аддитивный раствор содержит первый эксципиент в концентрации по существу равной концентрации первого эксципиента в белковом препарате;

- второй аддитивный раствор содержит приблизительно 20 мМ гистидина, приблизительно 84 г/л трегалозы, приблизительно 1 г/л ЭДТА и приблизительно 4 г/л полисорбата 80;

- добавление второго аддитивного раствора осуществляется при коэффициенте разбавления приблизительно 20, в результате чего один объем второго аддитивного раствора добавляют в приблизительно 19 кратном таком же объеме к раствору, полученному на второй стадии ультрафильтрации.

Во втором предпочтительном варианте осуществления:

- антитело представляет собой анти-IL7R антитело;

- предпочтительно, анти-IL-7R антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), включающий область определения комплементарности один CDR1, CDR2, и CDR3 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13 (примеры последовательностей таких CDR представляют собой SEQ ID NO. 17, 18 и 19, соответственно); и вариабельный участок легкой цепи (VL), включающий CDR1, CDR2, и CDR3 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 14 (примеры последовательностей таких CDR представляют собой SEQ ID No. 20, 21 и 22, соответственно);

- более предпочтительно, участок VH анти-IL-7R антитела содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 13, и участок VL анти-IL-7R антитела содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 14;

- еще более предпочтительно, тяжелая цепь анти-IL-TR антитела содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 15, и легкая цепь анти-IL-17 антитела имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 16;

- белковый препарат имеет концентрацию белка от 110 до 130 г/л, предпочтительно приблизительно 120 г/л;

- второй эксципиент в белковом препарате представляет собой сахарозу в концентрации от 42 до 58 г/л, предпочтительно приблизительно 50 г/л;

- конечные эксципиенты включают полисорбат 80, который в белковом препарате имеет концентрацию от 0,017 до 0,023 г/л, предпочтительно приблизительно 0,02 г/л;

- конечные эксципиенты включают ЭДТА, который в белковом препарате имеет концентрацию от 0,42 до 0,58 г/л, предпочтительно приблизительно 0,5 г/л;

- конечные эксципиенты включают аргинин, который в белковом препарате имеет концентрацию от 85 до 115 мМ, предпочтительно приблизительно 100 мМ;

- белковый препарат имеет рН от 6,5 до 7,5, предпочтительно приблизительно 7,0;

- раствор, предусмотренный на стадии (а) имеет концентрацию белка от 2,6 до 3,4 г/л, предпочтительно приблизительно 3 г/л;

- белок концентрируют до 36-54 г/л, предпочтительно до 40-50 г/л, и наиболее предпочтительно до приблизительно 45 г/л, на первой стадии ультрафильтрации;

- белок концентрируют до 170-210 г/л, предпочтительно до приблизительно 190 г/л, на второй стадии ультрафильтрации;

- первый эксципиент в буфере для диафильтрации имеет концентрацию более высокую, чем концентрация первого эксципиента в белковом препарате, причем указанная концентрация первого эксципиента в буфере для диафильтрации составляет предпочтительно от 19 до 25 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 22 мМ;

- буфер для диафильтрации включает аргинин в концентрации от 95 до 125 мМ, предпочтительно приблизительно 110 мМ;

- буфер для диафильтрации имеет рН от 6,5 до 7,5, предпочтительно приблизительно 7,0;

- добавление второго эксципиента к ретентату, полученному на стадии диафильтрации, достигается добавлением первого аддитивного раствора к ретентату, причем указанный первый аддитивный раствор включает второй эксципиент в концентрации от 230 до 320 г/л, предпочтительно приблизительно 275 г/л;

- первый аддитивный раствор содержит первый эксципиент в концентрации по существу равной концентрации первого эксципиента в буфере для диафильтрации и более высокую, чем концентрация первого эксципиента в белковом препарате, причем указанная концентрация первого эксципиента в первом аддитивном растворе составляет предпочтительно от 19 до 25 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 22 мМ;

- первый аддитивный раствор дополнительно содержит конечный эксципиент;

- первый аддитивный раствор содержит приблизительно 22 мМ гистидина, 110 мМ аргинина и приблизительно 275 г/л сахарозы, при рН приблизительно 7,0;

- добавление первого аддитивного раствора к ретентату осуществляется при коэффициенте разбавления приблизительно 5, в результате чего один объем первого аддитивного раствора добавляют в приблизительно 4-кратном таком же объеме ретентата;

- добавление конечных эксципиентов включает стадию добавления второго аддитивного раствора к раствору, полученному на второй стадии ультрафильтрации, причем указанный второй аддитивный раствор включает ЭДТА и полисорбат 80;

- добавление второго аддитивного раствора осуществляется при коэффициенте разбавления приблизительно 20, в результате чего один объем второго аддитивного раствора добавляют в приблизительно 19-кратном таком же объеме к раствору, полученному на второй стадии ультрафильтрации.

В соответствии со вторым аспектом изобретения, предусматривается препарат на основе антител, полученный по указанному выше способу.

В предпочтительном варианте осуществления, белковый препарат содержит:

от 135 мг/мл до 165 мг/мл, предпочтительно приблизительно 150 мг/мл, анти-PCSK9 антитела, и

от 16 мМ до 24 мМ, предпочтительно приблизительно 20 мМ, гистидинового буфера.

В другом предпочтительном варианте осуществления, белковый препарат содержит:

от 135 мг/мл до 165 мг/мл, предпочтительно приблизительно 150 мг/мл, анти-PCSK9 антитела, и

от 67,2 мг/мл до 100,8 мг/мл, предпочтительно приблизительно 84 мг/мл, трегалозы.

В другом предпочтительном варианте осуществления, белковый препарат содержит:

от 135 мг/мл до 165 мг/мл, предпочтительно приблизительно 150 мг/мл, анти-PCSK9 антитела, и

от 0,16 мг/мл до 0,24 мг/мл, предпочтительно приблизительно 0,2 мг/мл, полисорбата.

В другом предпочтительном варианте осуществления, белковый препарат содержит:

от 135 мг/мл до 165 мг/мл, предпочтительно приблизительно 150 мг/мл, анти-PCSK9 антитела,

от 16 мМ до 24 мМ, предпочтительно приблизительно 20 мМ, гистидинового буфера, и

от 67,2 мг/мл до 100,8 мг/мл, предпочтительно приблизительно 84 мг/мл, трегалозы.

В другом предпочтительном варианте осуществления, белковый препарат содержит:

от 135 мг/мл до 165 мг/мл, предпочтительно приблизительно 150 мг/мл, анти-PCSK9 антитела,

от 16 мМ до 24 мМ, предпочтительно приблизительно 20 мМ, гистидинового буфера, и

от 0,16 мг/мл до 0,24 мг/мл, предпочтительно приблизительно 0,2 мг/мл, полисорбата.

В другом предпочтительном варианте осуществления, белковый препарат содержит:

от 135 мг/мл до 165 мг/мл, предпочтительно приблизительно 150 мг/мл, анти-PCSK9 антитела,

от 67,2 мг/мл до 100,8 мг/мл, предпочтительно приблизительно 84 мг/мл, трегалозы, и

от 0,16 мг/мл до 0,24 мг/мл, предпочтительно приблизительно 0,2 мг/мл, полисорбата.

В еще предпочтительном варианте осуществления, белковый препарат содержит:

от 135 мг/мл до 165 мг/мл, предпочтительно приблизительно 150 мг/мл, анти-РСБК9 антитела,

от 16 мМ до 24 мМ, предпочтительно приблизительно 20 мМ, гистидинового буфера,

от 67,2 мг/мл до 100,8 мг/мл, предпочтительно приблизительно 84 мг/мл, трегалозы, и

от 0,16 мг/мл до 0,24 мг/мл, предпочтительно приблизительно 0,2 мг/мл, полисорбата.

В некоторых вариантах осуществления, препарат на основе антител имеет рН от 5,2 до 5,8, предпочтительно приблизительно 5,5.

В другом предпочтительном варианте осуществления, белковый препарат содержит:

от 110 г/л до 130 г/л, предпочтительно приблизительно 120 г/л, анти-IL-7R антитела;

от 17 мМ до 23 мМ, предпочтительно приблизительно 20 мМ, гистидина;

от 42 г/л до 58 г/л, предпочтительно приблизительно 50 г/л, сахарозы; и

от 0,017 г/л до 0,023 г/л, предпочтительно приблизительно 0,02 г/л, полисорбата

и имеет рН от 6,5 до 7,5, предпочтительно приблизительно 7,0.

SEQ ID NO: 1-12, о которых идет речь в указанном выше описаны в таблице ниже:

SEQ ID No. 13-16 в указанном выше описаны в таблице ниже

Подробное описание

В представленном описании и формуле изобретения будут использованы следующие определения:

- термин "белковый препарат" обозначает конечный продукт, который включает представляющий интерес белок и эксципиенты. Когда речь идет о белках, предназначенных для терапевтического применения, термин "лекарственная субстанция" может быть использован вместо термина "белковый препарат", и представляющий интерес белок может обозначаться термином "активный ингредиент" или "продукт". "Эксципиенты" определяются всеми составляющими "белкового препарата", которые не являются "белком" или "активным ингредиентом". Эксципиенты обычно включают стабилизаторы белка, поверхностно-активные вещества, аминокислоты, например, которые способствуют стабилизации белка и т.д.;

- в связи со стадией диафильтрации, термин "ретентат" относится к раствору, удерживаемому на стороне ретентата мембраны и содержащему молекулы, которые слишком велики для прохождения через мембрану, такие как представляющий интерес белок. Ретентат представляет собой раствор, который переносится в последующую часть системы ультрафильтрации / диафильтрации. Другой раствор, циркулирующий с другой стороны (пермеатная сторона) мембраны в диафильтрационной части системы, называется, как "буфер для диафильтрации" (или "базальный буфер");

- термин "концентрированный пул" обозначает раствор, непосредственно полученный на заключительной стадии ультрафильтрации;

- термин "конечные эксципиенты" обозначает эксципиенты, которые добавляются в «концентрированный пул» после заключительной стадии ультрафильтрации, то есть после стадии конечной концентрации;

- термин "nx добавка", с n численным значением, обозначает раствор эксципиентов, который добавляется к определенному объему содержащего белок раствора, с коэффициентом разбавления, равным n, который означает, что один объем раствора эксципиентов добавляют к n-1 кратному такого же объема содержащего белок раствора. Например, 4х добавка представляет собой раствор, который добавляют в соответствии с соотношением: 1 объем добавки для 3 объемов содержащего белок раствора;

- если не указано иное, термины "приблизительно", "около" или "по существу", связанные с численным значением, означают в пределах диапазона ±5% от указанной величины;

- "вязкость," как используется в данном документе, может быть «абсолютной вязкостью» или «кинематической вязкостью». "Абсолютная вязкость," иногда называемая динамической или простой вязкостью, представляет собой величину, которая описывает сопротивление текучей среды течению. "Кинематическая вязкость" представляет собой соотношение абсолютной вязкости и плотности жидкости. Кинематическая вязкость часто сообщается при характеристике резистивного потока жидкости с использованием капиллярного вискозиметра. Когда две жидкости с равным объемом помещаются в идентичные капиллярные вискозиметры и позволяют течь под действием силы тяжести, вязкая жидкость течет дольше, чем менее вязкая жидкость, которая течет через капилляр. Если одной жидкости требуется 200 секунд, чтобы завершить свое течение, а другой текучей среде требуется 400 секунд, то вторая жидкость является в два раза более вязкой, чем первая, по шкале кинематической вязкости. Если обе жидкости имеют одинаковую плотность, вторая жидкость является в два раза более вязкой, чем первая, по абсолютной шкале вязкости. Размерности кинематической вязкости представляют собой L²/Т, где L представляет собой длину, и Т представляет собой время. Единицы кинематической вязкости СИ составляют м²/с. Обычно кинематическая вязкость выражается в сантистоксах сСт, что является эквивалентным мм²/с. Размерности абсолютной вязкости представляют собой M/L/T, где М представляет собой массу, a L и Т представляют собой длину и время, соответственно. Единицы абсолютной вязкости СИ представляют собой Па⋅с, что является эквивалентным кг/м/с.Абсолютная вязкость обычно выражается в единицах сантипуаз, сП, что является эквивалентным миллипаскаль-секунде, мПа⋅с. В контексте изобретения антитело считается имеющим высокую вязкость, если его вязкость составляет по меньшей мере 20 сП.

Для краткости, сокращения "UF", "DF" и "UF/DF" (или "UFDF") могут быть использованы по всему описанию и должны пониматься следующим образом: "UF" означает "ультрафильтрацию", "DF" означает "диафильтрацию" и "UF/DF" (или "UFDF") означает "ультрафильтрацию/диафильтрацию". Способ согласно изобретению, который определен как способ получения белкового препарата, может быть назван как UFDF способ.

Изобретение сейчас будет дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, каждый из которых связан с конкретным терапевтическим моноклональным антителом и конкретным препаратом данного моноклонального антитела. Примеры приведены только для иллюстративной цели и не должны толковаться как ограничивающие объем изобретения.

А - Пример 1

В иллюстративном примере 1, представляющий интерес белок представляет собой бокоцизумаб, моноклональное антитело, нацеленное на PCSK9, которое специфически связывается с PCSK9 (пропротеинконвертаза 9-го субтилизин-кексинового типа), например, SEQ ID NO: 12 или номер доступа Uniprot Q8NBP7. Способ был разработан для достижения целевой концентрации продукта 150 г/л в лекарственной субстанции, с лекарственной субстанцией, котрая включает следующие эксципиенты при рН 5,5:

- гистидин в концентрации 20 мМ,

- трегалоза в концентрации 84 г/л, и

- PS80 (Полисорбат 80) в концентрации 0,2 г/л.

Считается приемлемым, что указанные выше требования достигаются с допуском ±8 г/л для концентрации белка, ±15% для концентрации эксципиентов и ±0,2 для значения рН.

С точки зрения выхода, способ требуется для достижения извлечения продукта больше чем на 90%.

Эксперименты были проведены для определения предпочтительных режимов работы и установления того, что способ, согласно изобретению, является подходящим для достижения указанных выше требований (в то время как общепринятые методы не являются). Некоторые из данных экспериментов представлены в следующей части описания.

А.1 Материалы

Исходный материал, использованный для экспериментов, представлял собой полностью очищенный раствор бокоцизумаба, который подвергался обработке на колонне MabSelect® для удаления компонентов эксципиента перед использованием. После очистки MabSelect®, рН элюата регулировали до рН 5,0 уксусной кислотой, что в результате приводило к концентрации продукта 17,09 г/л.

Устройство для ультрафильтрации / диафильтрации

Все эксперименты проводились с использованием системы GE Crossflow® (резервуар объемом 300 мл), снабженный регенерируемыми целлюлозными мембранами Pellicon® 3 (30 кДа, С-скрининг, 88 см²) или регенерируемыми целлюлозными мембранами Sartocon® (30 кДа Е-канал 200 см²). Трансмембранное давление (ТМР) поддерживалось на уровне приблизительно 14-22 фунтов на квадратный дюйм с Р_подачи меньше, чем 55 фунтов на квадратный дюйм. Если не указано иное, все промывания генерировались рециркуляционным буфером для промывки в течение, по меньшей мере, 15 минут, затем концентрировали до минимального рабочего объема системы.

А.2 Дизайн и результаты эксперимента

Определение растворимости трегалозы

Начальный эксперимент был завершен для оценки предела растворимости трегалозы в 30 мМ растворе гистидина с рН 5,35 (концентрацию и рН гистидин регулируют исходя из конечных характеристик для того, чтобы предусмотреть исключение иона гистидина по мере увеличения концентрации белка). Для того, чтобы получить конечную целевую концентрацию лекарственной субстанции 150 г/л, минимальная концентрация концентрированного пула должна была бы составлять 180 г/л с 6х добавкой трегалозы /ЭДТА/PS80, или 187,5 г/л с 5х добавкой трегалозы/ЭДТА/PS80. При концентрации трегалозы, необходимой для обеспечения 6х добавки (~500 г/л), трегалоза не растворялась (частицы все еще присутствовали) при комнатной температуре (22°С) после длительного перемешивания и ее необходимо было нагревать до 30°С для того, чтобы она растворилась. Раствор фильтровали через шприцевый фильтр 0,22 мкм Pall Acrodisc® под давлением 15 фунт/кв. дюйм без повторного осаждения при комнатной температуре.

Однако, данный способ производства может быть трудно масштабированным, поэтому максимальная практическая концентрация добавки трегалозы может быть ограничена 5х (~420 г/л трегалозы).

Соответственно, в предпочтительном способе концентрация трегалозы добавочного раствора может составлять приблизительно 400 г/л.

Разработка производственных технологий

Первый эксперимент был разработан для исследования концентрации гистидина, необходимой для раствора диафильтрации, для того, чтобы проверить концентрации гистидина в диафильтрованном растворе при различных концентрациях белка (76,6 г/л и 114 г/л), и для того, чтобы получить материал для измерение плотности. Исходный материал концентрировали до 76,6 г/л с использованием 200 см² мембраны Е-канала Sartocon® с нагрузочной способностью 345 г/м², и затем диафильтровали с помощью 35 мМ гистидина, рН буфера 5,26. Поток диафильтрации составлял 17 LMH (литры/м²/час) при пропускной способности подачи 300 LMH и 22 фунтов на квадратный дюйм ТМР. Материал затем дополнительно концентрировали до 213 г/л (данные не показаны) и образцы как из диафильтрованного пула, так и конечного концентрированного материала анализировали на концентрацию гистидина и трегалозы (смотрите таблицу 1).

Второй эксперимент был проведен для того, чтобы определить, когда диафильтрованный материал, который содержит трегалозу, в результате приводил к более низкой конечной концентрации по сравнению с материалом без трегалозы в буфере для диафильтрации. Исходный материал концентрировали до 114 г/л и диафильтровали с использованием 35 мМ гистидина, рН буфера 5,26. Поток диафильтрации составлял 10 LMH в рабочих условиях, описанных в таблице 2, эксперимента 2А. Диафильтрованный раствор концентрировали до 184,9 г/л при давлении подачи <55 фунтов на квадратный дюйм и 22 фунтов на квадратный дюйм ТМР. Концентрированный материал сливали с

резервуара и объединяли с 35 мМ гистидином, рН раствора для промывания 5,26 для достижения концентрации 153,7 г/л. В пул добавлялся 4х трегалозный эксципиентный буфер (30 мМ гистидин, 400 г/л трегалозы, рН 5,4) для достижения конечной концентрации белка 114 г/л. Затем разбавленный раствор концентрировали до 202,4 г/л в рабочих условиях, описанных в таблице 2, эксперимента 2 В. Стадия концентрирования была остановлена при пропускной способности подачи 15 LMH из-за ограничений насоса.

Таблица 1 показывает, что концентрации как гистидина, так и трегалозы во всех концентрированных образцах находились в пределах 10% от конечного целевого показателя, 20 мМ гистидина и 84 г/л трегалозы.

Данная информация обеспечивает приемлемый рабочий диапазон концентрации диафильтрации от 75 до 114 г/л, в пределах которого конечные концентрации эксципиентов соответствуют характеристикам концентрации.

* Фактическое время не регистрировали или не могло быть восстановлено, оно основано на вычислении обрабатываемого потока и объема.

Дополнительный эксперимент проводили для оценки изменений концентрации гистидина и трегалозы в зависимости от концентрации белка в конце стадии концентрирования 2. Исходный материал концентрировали до 105,9 г/л и диафильтровали с использованием 35 мМ гистидиновым буфером с рН 5,29 с использованием 200 см2 мембраны Sartocon® Е-канал. Поток диафильтрации составлял 12 LMH при пропускной способности подачи 300 LMH и 22 фунт/кв. дюйм ТМР. Диафильтрованный материал затем метили 4х раствором эксципиента трегалозы. Раствор добавки добавляли непосредственно в резервуар и перемешивали в течение 15 минут, затем материал концентрировали до 172, 188 и 209 г/л конечной концентрации (смотрите таблицу 3). Как показано в Таблица 4, концентрация гистидина снижалась по мере увеличения концентрации белка, но все значения находились в пределах 10% от целевой концентрации 20 мМ гистидина, 84 г/л трегалозы..

* Фактическое время не регистрировали или не могло быть восстановлено, оно основано на вычислении обрабатываемого потока и объема.

Способ был масштабирован до 500 л полупромышленного масштаба (партия 12P126J603-MV-B): смотрите таблицу 5 касательно подробностей процесса. 517 г очищенного материала Capto Adhere® концентрировали до 107 г/л с использованием 0,5 м2 мембраны Millipore® V-screen, и затем диафильтровали с использованием 35 мМ гистидинового буфера с рН 5,29, пропускной способностью подачи 1000 LMH и давлением подачи 40 фунтов на квадратный дюйм. Ретентат затем разбавляли 4х трегалозным раствором (30 мМ гистидина, 400 г/л трегалозы, рН 5,22), который добавляли непосредственно в резервуар, принимая во внимание объем удерживания системы. Разбавленный материал затем концентрировали до 202 г/л, и концентрированный продукт удаляли из системы. Модуль промывали буфером с 20 мМ гистидина, 84 г/л трегалозы, рН 5,50, и промывные добавляли в концентрированный материал. Измеренная концентрация конечного объединенного раствора составляла 160 г/л с общим выходом 97,1%.

В таблице 6 приведены результаты по концентрации эксципиента и качества продукта для эксперимента, который показывает, что конечные уровни объединенного пула находились в пределах 10% от указанных выше целевых концентраций, без какого-либо значительного влияния на качество продукта, измеренное с помощью SEC, по сравнению с прошлыми конечными значениями UF.

Оценка процесса диафильтрации

Плотность и вязкость белка при различных концентрациях

Фиг. 1 демонстрирует график зависимости вязкости бокоцизумаба по отношению к концентрации продукта в (i) 20 мМ гистидине, рН 5,5 и (ii) 20 мМ гистидине, 84 г/л трегалозы, рН 5,5. График показывает, что при приблизительно 175 г/л вязкость достигает значения 30 сП, что считается отсечкой для целесообразной обработки UFDF в больших масштабах.

Измеренными были плотности бокоцизумаба в растворах (i) 20 мМ гистидина, рН 5,5 и (ii) 20 мМ гистидина, 84 г/л трегалозы, рН 5,5, и показаны на Фиг. 2 и Фиг. 3. Данные показывают, что плотность в буфере гистидина немного меньше по сравнению с буфером гистидин/трегалоза, что и было ожидаемым.

На основании приведенных выше экспериментов было обнаружено, что целевые концентрации в лекарственной субстанции могут быть достигнуты в производственном масштабе с использованием DF буфера, содержащего гистидин без трегалозы.

Результаты экспериментов показали не только то, что способ согласно изобретению в результате приводил к приемлемому выходу, конечным концентрациям белка и эксципиента, но также, что он требовал более низкую концентрацию белка до добавления эксципиент, по сравнению с общепринятыми способами (158 г/л по сравнению с 188 г/л). Такую более низкую концентрацию белка легче достичь на регулярной основе по мере масштабирования процесса. Кроме того, способ согласно изобретению, является предпочтительным по сравнению с общепринятыми способами из-за лучшего профиля стоимости товаров, достигнутого путем удаления трегалозы из буфера для диафильтрации.

Обнаружено, что процесс UFDF, использующий мембрану Millipore® C-screen, в качестве альтернативы мембране Millipore® V-screen, систематически в результате приводил к концентрации большей, чем 175 г/л, что было достаточным для того, чтобы позволить добавление промывочного пула (промывание), при этом все еще оставаясь выше 158 г/л, что необходимо до 20х добавки эксципиента. Для того, чтобы гарантировать, что процесс будет работать с трегалозной добавкой, процесс, использующий мембрану C-Screen, оценивали, как в лабораторном, так и в полупромышленном масштабе.

Процесс оценивали в лабораторном масштабе с использованием кассет Millipore® PLCTK C-Screen, используя условия прохлждения ультрафильтрации (UF), указанные в таблице 7.

Для оборудования TFF (фильтрования тангенциальным потоком) процесс в лабораторном масштабе проводили с использованием диапазона пропускной способности подачи 30-300 LMH при достижимом пределе давления приблизительно 50-55 фунтов на квадратный дюйм в качестве эксплуатационных пределов. Верхняя граница пропускной способности подачи 300 LMH, при которой будет происходить большая часть процесса, оказывает принципиальное влияние на время процесса, когда уменьшенный поток подачи в результате приводит к более низкому потоку процесса, что увеличивает время технологического насоса. Более низкая пропускная способность подачи 30 LMH является критической для конечной концентрации, которая достигается за счет увеличения вязкости, увеличивающей падение давления через каналы ретентата, поэтому более низкие пропускные способности позволяют накачивать более вязкие растворы.

В лабораторном масштабе процесс протекал в присутствии приблизительно 84 г/л трегалозы, и конечная концентрация 177 г/л была достигнута в конечном пуле ретентат с пропускной способностью подачи 30 LMH и давлении подачи 50 фунтов на квадратный дюйм. Промывные фракции с прогонов в лабораторном масштабе измеряли по-отдельности для определения выхода как показано в таблице 8.

*Более низкой размер загрузки используется в лабораторных масштабах из-за ограничений материала и времени цикла процесса и представляет собой наихудший вариант параметра получения выхода.

Профиль потока процесса в лабораторном масштабе можно увидеть на фигуре 4, где вертикальная линия указывает начальную точку для снижения пропускной способности подачи для того, чтобы поддерживать давление подачи ниже ~50 фунтов на квадратный дюйм с открытым ретентатом (ноль фунтов на квадратный дюйм), причем уменьшение потока процесса возникает из-за уменьшения поперечной пропускной способности. Фигура 5 показывает перепад давления в канале технологической подачи и пропускной способности подачи во время конечного концентрирования. В системе лабораторного масштаба, поток регулируется вручную за счет снижения скорости подаваемого насоса, когда давление подачи приближается к ~50 фунтам на квадратный дюйм.

Ппартии подтверждающие полупромышленный масштаб

Процесс UFDF с мембраной C-screen проводили в масштабе 500 л для того, чтобы подтвердить, что конечные целевые концентрации могут быть достигнуты. Процесс представлен в таблице 9, и данных способа для 3 партий, выполненных на экспериментальной установке, показаны в таблице 10.

Результаты показывают, что процесс достиг высокого уровня восстановления и что концентрации соответствуют промежуточным и конечным целям. Кроме того, для партии 13P120J604 были измерены концентрации эксципиентов при 21,2 мМ гистидина, 85,4 г/л трегалозы и 0,051 г/л ЭДТА, которые находятся в пределах целевых показателей ±15%.

30

А.3 Выводы

Описанные выше эксперименты смогли продемонстрировать выход 92-99% на стадию, при этом достигая планируемый показатель лекарственной субстанции.

Пример демонстрирует, что способ UFDF в соответствии с изобретением является приемлемым для получения высококонцентрированной (150 г/л) лекарственной субстанции бокоцизумаба с рН и всеми концентрациями эксципиентов в приемлемых диапазонах. То же самое может быть достигнуто с другими белками с такими же преимуществами, особенно с белками, имеющими особенно высокую вязкость.

В - Пример 2

В иллюстративном примере 2, представляющий интерес белок представляет собой антитело C1GM, моноклональное антитело антагониста IL-7R, которое специфически связывается с IL-7R. Способ был разработан для достижения целевой концентрации продукта 120 г/л в лекарственной субстанции, причем лекарственная субстанция включает следующие эксципиенты при рН 7,0:

- гистидин в концентрации 20 мМ,

- аргинин в концентрации 100 мМ,

- сахароза в концентрации 50 г/л,

- PS80 (Полисорбат 80) в концентрации 0,02 г/л, и

- ЭДТА в концентрации 0,5 г/л.

Считается приемлемым, что указанные выше требования достигаются с допуском ±10 г/л для концентрации белка, ±15% для концентрации эксципиентов и ±0,5 для значения рН.

С точки зрения выхода, то для достижения извлечения продукта больше, чем на 85% требуется процесс.

Исходный материал, использованный для экспериментов, описанных ниже, представлял собой полностью очищенный раствор, который был обработан с использованием мембранной хроматографии MabSelect® и Q.

Устройство для ультрафильтрации/диафильтрации

Все эксперименты проводились с использованием системы поперечного потока GE Crossflow (резервуар 300 мл) или насосной системой Quattroflow™, снабженной Pellicon 3® (30 кДа, C-screen, 88 см2) регенерируемыми целлюлозными мембранами. Трансмембранное давление (ТМР) удерживали на приблизительно 14-22 фунтов на кв. дюйм с Р_подачи<55 фунтов на кв. дюйм. Если не указано иное, все промывания генерировались с использованием рециркуляционного буфера для промывки в течение>15 минут, затем концентрирование до минимального рабочего объема системы.

Аналитические анализы

Электронную (УФ-видимую) спектрофотометрию для концентрации белка проводили с использованием Thermo Scientific H/anodrop 2000С™, или Solo VPE™ от С Technologies Inc. Коэффициент экстинкции при 280 нм, как определено экспериментально по ARD, составляет 1,51 мл*мг^-1*см^-1.

Эксперименты

Эксперимент 1

Исходный материал формировали с 5% 2 М NaCl и регулировали до рН 7,0, используя 2 М основание трис, концентрировали до 50 г/л, диафильтровали с 22 мМ гистидина, 110 мМ аргинин рН 7,0, дополненный 5Х сахарозным буфером (22 мМ гистидина, 110 мМ аргинин, 275 г/л сахароза рН 7,0), и концентрировали до 146,9 г/л при пропускной способности подачи ~34 LMH, как детально описано в таблице 11. рН концентрированного раствора составляло 7,00. Система UF была промыта сильным напором струи в однопроходном режиме (без рециркуляции) с раствором диафильтрации, что в результате привело к концентрации 33 г/л. Общий выход составил приблизительно 88%.

Таблицы 12-14 показывают результаты анализа эксципиент, CGE и SEC. Концентрации гистидина, аргинина и сахарозы в конечном концентрированном материале находились в пределах ±10% желаемого значения. Не существовало никакой новой агрегации, сформированной в процессе UF, никакого изменения уровня фрагментации.

Эксперимент 2

Эксперимент повторяли, как детально описано в таблице 15, с той лишь разницей, что был рассчитан объем добавления. Общий объем в системе UF перед добавлением рассчитывали исходя из общего баланса материала (общая загрузка, деленная на концентрацию диафильтрата) по сравнению с добавлением объема в резервуаре плюс объем удерживания системы. После 5Х сахарозного добавления, белок концентрировали до 183,6 г/л при пропускной способности подачи ~34 LMH и Р_подачи<50 фунтов на квадратный дюйм.

Таблица 16 показывает, что концентрации эксципиента, гистидина, аргинина и концентрации сахарозы в конечном материале находились в пределах ±10% от желаемого целевого значения. Разница в том, как рассчитывалась величина добавки, не оказала какого-либо существенного влияния на концентрации конечного эксципиента.

Эксперимент 3

Эксперимент повторяли третий раз после конечной формуляции, и результаты подробно описаны в таблице. После диафильтрации, рассчитывали дополнительный объем 5Х раствора добавки, как описано в эксперименте 2. Белок концентрировали до 190 г/л при пропускной способности подачи ~34 LMH и Р_подачи<50 фунтов на квадратный дюйм. Систему UF промывали 20 мМ гистидина, 100 мМ аргинина, 50 г/л сахарозы, рН 7,0 в режиме однократного прохождения. Концентрация белка в объединенном ретентате и пуле промывания составляла 151 г/л, что в результате приводило к общему выходу приблизительно 84%.

Таблица 18 приводит концентрации эксципиентов, показывая, что концентрации гистидина, аргинина и сахарозы находились все в пределах ±10% от желаемого значения. Таблица 19 и Таблица 20 показывают, что никакой дополнительной агрегации или фрагментации не происходило во время процесса UFDF.

Процесс, выполненный в эксперименте 3 выше, в результате приводит к приемлемым значениям концентрации для всех эксципиентов и представляющего интерес белка, и, по-видимому, не оказывает никакого влияния ни на образование агрегата, ни на фрагментацию. Этот процесс будет масштабирован до полупромышленного масштаба, чтобы гарантировать, что он будет работать, как ожидалось.

Процесс UFDF полупромышленного масштаба

Процесс UF, разработанный выше (эксперимент 3), был протестирован на экспериментальной установке с использованием регенерируемой целлюлозной мембраны Millipore® C-screen, и с использованием материала, очищенного из биореактора объемом 500 л.

Во время работы устройства, подробно описанного в Таблице 21, 86 л исходного материала при концентрации исходного продукта 2,92 г/л разбавляли 5% 2 М NaCl, затем концентрировали до 44,6 г/л. Материал затем диафильтровали с 22 мМ гистидина, 110 мМ аргинина, рН 7,0 при пропускной способности подачи приблизительно 150 LMH и Р_подачи<40 фунтов на квадратный дюйм. После 8 TOV диафильтрации, ретентат разбавляли 22 мМ гистидина, 110 мМ аргинина, 275 г/л сахароза рН 7,0, и рециркулировали в течение 10 минут, затем концентрировали до 191,4 г/л. Процесс концентрирования останавливали при скорости потока фильтрата 30 LMH и Р_подачи<50 фунтов на квадратный дюйм. Модуль затем промывали 20 мМ гистидина, 100 мМ гистидина, 50 г/л сахарозы, рН 7,0 в режиме однократного прохождения. Общий выход составил приблизительно 87%. Весь процесс UF занял приблизительно 5 часов до завершения.

Пул UF с концентрацией 135,4 г/л получали путем смешивания пула ретентата, пула промывания и дополнительного буфера для промывки. Пул фильтровали через Millipore® 05/0,2 мкм Opticap Express SHC при пропускной способности 59 л/м2. 20Х ЭДТА и PS80 эксципиентный буфер добавляли в UF пул для получения лекарственной субстанции с конечной концентрацией 129,4 г/л.

Концентрации эксципиентов подсуммированы в таблице 22, которая

показывает, что концентрации гистидина, аргинина и сахарозы в конечном пуле находились в пределах ±15% от целевых значений. Целевой диапазон во время разработки процесса в лабораторном масштабе был установлен на ±10% от целевых значений для всех концентраций эксципиента, но приемлемый диапазон при больших масштабах был установлен на ±15% для того, чтобы обеспечить интервалы во время масштабирования.

В таблице 23 и в таблице 24 приведены результаты качества продукта, полученные в результате прогона, которые показывают, что никакого увеличения агрегации или фрагментации не обнаружено.

Выводы

В заключение, описанные выше эксперименты демонстрируют успешную разработку процесса UFDF для лекарственной субстанции >120 мг/мл для анти-IL-7R антитела, представляющего интерес. Процесс UFDF включает начальное концентрирование, диафильтрацию, добавление сахарозы перед конечным концентрированием, затем добавление остальных эксципиентов. рН и все концентрации эксципиента концентрацияв в разработанном процессе находятся в допустимых диапазонах.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PFIZER INC.

Glynn, Judy K

Chen, Brian X

LaCasse, Daniel P

<120> Method Of Preparing A Therapeutic Protein Formulation And

Antibody Formulation Produced By Such A Method

<130> PC72213A

<150> 61/222,067

<151> 2015-09-22

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Ser Pro Phe Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Pro Leu Tyr Ala Ser Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Ser Leu Trp Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 3

Ser Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 4

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 5

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His

1 5 10

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 6

Glu Ile Ser Pro Phe Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 7

Ile Ser Pro Phe Gly Gly Arg

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 8

Glu Arg Pro Leu Tyr Ala Ser Asp Leu

1 5

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 9

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 10

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 11

Gln Gln Arg Tyr Ser Leu Trp Arg Thr

1 5

<210> 12

<211> 692

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln

690

<210> 13

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser

20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Val Gly Trp Asp Gly Phe Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Asp Tyr Met Gly Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 14

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val

35 40 45

Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65 70 75 80

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Phe

85 90 95

His His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 15

<211> 432

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser

20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Val Gly Trp Asp Gly Phe Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Asp Tyr Met Gly Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

210 215 220

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

225 230 235 240

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

245 250 255

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

260 265 270

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

275 280 285

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

290 295 300

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

305 310 315 320

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

370 375 380

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

385 390 395 400

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

405 410 415

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

420 425 430

<210> 16

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 16

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val

35 40 45

Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65 70 75 80

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Phe

85 90 95

His His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 17

Asp Ser Val Met His

1 5

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 18

Leu Val Gly Trp Asp Gly Phe Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 19

Gln Gly Asp Tyr Met Gly Asn Asn

1 5

<210> 20

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 20

Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Tyr Val Gln

1 5 10

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 21

Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 22

Gln Ser Tyr Asp Phe His His Leu Val

1 5

<---

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к способу получения белкового препарата, который содержит эксципиенты и, по меньшей мере, один терапевтический белок, где способ включает последовательные стадии: (a) обеспечение раствора, включающего указанный белок; (b) концентрирование белка в растворе с использованием первой стадии ультрафильтрации; (c) диафильтрование полученного раствора с буфером для диафильтрации, который включает, по меньшей мере, один первый эксципиент, посредством которого получают ретентат, включающий белок и первый эксципиент, при этом первый эксципиент представляет собой аминокислоту; (d) добавление второго эксципиента к ретентату, полученному на стадии диафильтрации, при этом второй эксципиент представляет собой сахар; (e) следующее концентрирование белка в ретентате на второй стадии ультрафильтрации в ультрафильтрационном оборудовании; и (f) добавление, по меньшей мере, одного конечного эксципиента, посредством которого получают белковый препарат с требуемой концентрацией белка и который включает указанный первый и конечный эксципиенты, при этом конечный эксципиент выбран из поверхностно-активного вещества или хелатирующего агента или какой-либо их комбинации; при этом аминокислота представляет собой гистидин; поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80; хелатирующий агент представляет собой ЭДТА. Изобретение обеспечивает возможность получить более высокие концентрации белков в конечном составе, не влияя на выход и стабильность белка. 27 з.п. ф-лы, 24 табл., 2 пр., 5 ил.

1. Способ получения белкового препарата, который содержит эксципиенты и, по меньшей мере, один терапевтический белок, причем способ включает последовательные стадии:

(a) обеспечение раствора, включающего указанный белок;

(b) концентрирование белка в растворе с использованием первой стадии ультрафильтрации;

(c) диафильтрование раствора, полученного таким образом с буфером для диафильтрации, который включает, по меньшей мере, один первый эксципиент, посредством которого получают ретентат, включающий белок и первый эксципиент, при этом первый эксципиент представляет собой аминокислоту;

(d) добавление второго эксципиента к ретентату, полученному на стадии диафильтрации, при этом второй эксципиент представляет собой сахар;

(e) следующее концентрирование белка в ретентате на второй стадии ультрафильтрации в ультрафильтрационном оборудовании; и

(f) добавление, по меньшей мере, одного конечного эксципиента, посредством которого получают белковый препарат с требуемой концентрацией белка и который включает указанный первый и конечный эксципиенты, при этом конечный эксципиент выбран из поверхностно-активного вещества или хелатирующего агента или какой-либо их комбинации, при этом

- аминокислота представляет собой гистидин;

- поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80;

- хелатирующий агент представляет собой ЭДТА.

2. Способ по п. 1, который дополнительно включает, после стадии (e) и перед стадией (f), промывание ультрафильтрационного оборудования буфером для промывки, в результате чего улучшается выделение белка.

3. Способ по п. 2, в котором буфер для промывки содержит первый и второй эксципиенты в таких концентрациях, что концентрации первого и второго эксципиентов в белковом препарате различаются не более чем на 5%.

4. Способ по какому-либо одному из пп. 1 - 3, в котором первый эксципиент в белковом препарате имеет концентрацию от 16 до 24 мM, предпочтительно от 17 до 23 мM, наиболее предпочтительно 20 мM.

5. Способ по какому-либо одному из пп. 1 - 4, в котором второй эксципиент представляет собой дисахарид.

6. Способ по какому-либо одному из пп. 1 - 5, в котором белковый препарат имеет концентрацию белка от 110 и 165 г/л.

7. Способ по какому-либо одному из пп. 1 - 6, в котором белок представляет собой антитело.

8. Способ по п. 7, в котором антитело представляет собой анти-IL-7R антитело.

9. Способ по п. 7, в котором антитело имеет VH участок, включающий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 13, и VL участок, включающий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 14.

10. Способ по п. 8 или 9, в котором белковый препарат имеет концентрацию белка от 110 до 130 г/л, предпочтительно 120 г/л.

11. Способ по какому-либо одному из пп. 8 - 10, в котором второй эксципиент в белковом препарате представляет собой сахарозу в концентрации от 42 до 58 г/л, предпочтительно 50 г/л.

12. Способ по какому-либо одному из пп. 8 - 11, в котором конечные эксципиенты включают полисорбат 80 который, в белковом препарате, имеет концентрацию от 0,017 до 0,023 г/л, предпочтительно 0,02 г/л.

13. Способ по какому-либо одному из пп. 8 - 12, в котором конечные эксципиенты включают ЭДТА, который, в белковом препарате, имеет концентрацию от 0,42 до 0,58 г/л, предпочтительно 0,5 г/л.

14. Способ по какому-либо одному из пп. 8 - 13, в котором конечные эксципиенты включают аргинин, который, в белковом препарате, имеет концентрацию от 85 до 115 мM, предпочтительно 100 мM.

15. Способ по какому-либо одному из пп. 8 - 14, в котором белковом препарате имеет pH от 6,5 до 7,5, предпочтительно 7,0.

16. Способ по какому-либо одному из пп. 8 - 15, в котором раствор, предусмотренный на стадии (a) имеет концентрацию белка от 2,6 до 3,4 г/л, предпочтительно 3 г/л.

17. Способ по какому-либо одному из пп. 8 - 16, в котором белок концентрируют до от 36 до 54 г/л, предпочтительно до от 40 до 50 г/л, и наиболее предпочтительно до 45 г/л, на первой стадии ультрафильтрации.

18. Способ по какому-либо одному из пп. 8 - 17, в котором белок концентрируют до от 170 до 210 г/л, предпочтительно до 190 г/л, на второй стадии ультрафильтрации.

19. Способ по какому-либо одному из пп. 8 - 18, в котором первый эксципиент в буфере для диафильтрации имеет концентрацию более высокую, чем концентрация первого эксципиента в белковом препарате, причем указанная концентрация первого эксципиента в буфере для диафильтрации составляет предпочтительно от 19 дл 25 мM, наиболее предпочтительно 22 мM.

20. Способ по какому-либо одному из пп. 8 - 19, в котором буфер для диафильтрации включает аргинин в концентрации от 95 до 125 мM, предпочтительно 110 мM.

21. Способ по какому-либо одному из пп. 8 - 20, в котором буфер для диафильтрации имеет pH от 6,5 до 7,5, предпочтительно 7,0.

22. Способ по какому-либо одному из пп. 8 - 21, в котором добавление второго эксципиента к ретентату, полученному на стадии диафильтрации достигается добавлением первого аддитивного раствора к ретентату, причем указанный первый аддитивный раствор включает второй эксципиент в концентрации от 230 до 320 г/л, предпочтительно 275 г/л.

23. Способ по п. 22, в котором первый аддитивный раствор содержит первый эксципиент в концентрации по существу равной концентрации первого эксципиента в буфере для диафильтрации и более высокой, чем концентрация первого эксципиента в белковом препарате, причем указанная концентрация первого эксципиента в первом аддитивном растворе составляет предпочтительно от 19 до 25 мM, наиболее предпочтительно 22 мM.

24. Способ по п. 22 или 23, в котором первый аддитивный раствор дополнительно содержит конечный эксципиент.

25. Способ по п. 24, в котором первый аддитивный раствор содержит 22 мM гистидина, 110 мM аргинина и 275 г/л сахарозы, при pH 7,0.

26. Способ по какому-либо одному из пп. 11 - 25, в котором добавление первого аддитивного раствора к ретентату осуществляется при коэффициенте разбавления 5, в результате чего один объем первого аддитивного раствора добавляют к 4 кратному такому же объему ретентата.

27. Способ по какому-либо одному из пп. 11 - 26, в котором добавление конечных эксципиентов включает стадию добавления второго аддитивного раствора к раствору, полученному со второй стадии ультрафильтрации, причем указанный второй аддитивный раствор включает ЭДТА и полисорбат 80.

28. Способ по п. 27, в котором добавление второго аддитивного раствора осуществляется при коэффициенте разбавления 20, в результате чего один объем второго аддитивного раствора добавляют к 19 кратному такому же объему раствора, полученного на второй стадии ультрафильтрации.