Раствор для аспирационно-пункционного лечения эндометриомы яичника и способ его получения Российский патент 2022 года по МПК A61K33/00 A61K33/40 A61P15/08 

Назначение и область применения

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и найдет применение при лечении эндометриоидных кист яичников.

Технический уровень

Наиболее часто применяемым методом лечения эндометриомы яичника является хирургическое вмешательство с энуклеацией кисты. Применяемые хирургичесие методы, как правило, приводят к потере овариального резерва и дают частоту годовых рецидивов не более 10 % [Noma, https://doi.org/10.1016/S0020-7292(00)00307-6].

Альтернативным методом лечения является аспирационно-пункционный метод с применением склерозирующих растворов [Noma, https://doi.org/10.1016/S0020-7292(00)00307-6; Aboulghar, https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.humrep.a137279; Aboulghar, https://link.springer.com/article/10.1007/BF01204365; Artaє, https://doi.org/10.1080/01443615.2017.1399991; Chang, https://doi.org/10.1016/S0020-7292(97)00122-7; Cohen, https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2017.05.015; FENGJUAN, CN103565853A; Fisch, https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2004.01.031; Garcнa-Tejedor, https://doi.org/10.1016/j.ejogrb.2015.02.004; Kafali, https://doi.org/10.1016/S0020-7292(02)00401-0; Lee, https://doi.org/10.5468/ogs.2014.57.4.297; Li, DOI: 10.3233/CH-211134; Shawki, https://doi.org/10.1016/j.mefs.2011.02.002; Vercellini, PMID: 1387905 ; YANG, CN102240264A; Гребенкин, RU 2337642; Каримов, Вестник экстренной медицины, 2011, №2, с 12; Орлов, RU 2221506; Таирова, https://www.sechenov.ru/upload/iblock/9c2/Tairova.pdf]. Основным достоинством метода является лучшее сохранение овариального резерва по сравнению с лапароскопическими методиками, что подтверждается более высокой частотой наступления беременности в течении 6 мес. 52,2 % против 38,4% [Noma, https://doi.org/10.1016/S0020-7292(00)00307-6].

Для выполнения склеротерапии используют следующие растворы:

Этанол 70-95%. Этанол в качестве слерозирующего агента с момента его первого применения принято считать стандартном, с которым сравниваются все другие склерозанты [Albanese, DOI: 10.1055/s-0030-1267848]. Механизм действия этанола сочетает цитотоксические повреждения, вызванные денатурацией и экстракцией поверхностных белков, гипертонической дегидратацией клеток, коагуляцией и тромбозом сосудов. Сочетание перечисленных факторов приводит к фибриноидному некрозу. Известно, что эффект действия этанола зависит от концентрации, скорости введения, времени действия [Albanese, DOI: 10.1055/s-0030-1267848]. Так, при изменении времени действия 70% этанола с 1,5 мин до 5 мин частота рецидивов эндометриоза яичника в течение 1 года снизилась с 36%,6 до 12,5% [Таирова, https://www.sechenov.ru/upload/iblock/9c2/Tairova.pdf]. В исследовании [Noma, https://doi.org/10.1016/S0020-7292(00)00307-6] с использованием 95 % этанола показано что частота 6-месячных рецидивов существенно зависит от тяжести заболевания, изменяясь с 7,5% при одной кисте до 33,3% при наличии 2-х и более кист. Показано, что 6 месячная частота рецидивов может быть менее 10% при экспозиции более 10 мин. Типичная годовая частота рецидивов при использовании 95% этанола и времени экспозиции более 10 мин устанавливается на уровне 10-13% в ряде исследований [Cohen, https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2017.05.015].

Ранее изучалась возможность склеротерапии комбинированными растворами на основе этанола, так, например, 5% раствор йода в этаноле в течение 6 месяцев дал 1,8% рецидивов [Каримов, Вестник экстренной медицины, 2011, №2, с 12] против 9% [Noma, https://doi.org/10.1016/S0020-7292(00)00307-6] при использовании чистого этанола. Использование спиртового раствора 36% Ваготила (поликрезулен) в соотношении 20:1 давала частоту рецидивов 9% [Орлов, RU 2221506], что сопоставимо с обычной спиртовой склеротерапией. Значительный процент годовых рецидивов - 38,1%- при последовательной аспирации 70% этанола и эритромицина в течение 5 мин [Kafali, https://doi.org/10.1016/S0020-7292(02)00401-0] обусловлен, очевидно, недостаточным временем воздействия склерозирующим раствором. Авторы отмечают, что наиболее вероятные рецидивы имели место при большой толщине стенки эндометриоидной капсулы 4 мм и наличии кровотечения при аспирации, которое снижало концентрацию этанола.

Применение антибиотиков, например, тетрациклина дает от 33% [Aboulghar, https://link.springer.com/article/10.1007/BF01204365] до 46% [Chang, https://doi.org/10.1016/S0020-7292(97)00122-7] рецидивов в течение 12 месяцев и не обладает лучшим показателем, чем этанол, что сопоставимо с выводами работы [Albanese, DOI: 10.1055/s-0030-1267848] по различным иным областям применения, а частота наступления беременности 57% [Fisch, https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2004.01.031] сопоставима с этаноловой склеротерапией. Использование метотрексата [Shawki, https://doi.org/10.1016/j.mefs.2011.02.002] для аспирации давало сопоставимый с тетрациклином процент рецидивов 33,5%. Частота беременности не оценивалась.

5-минутная инстилляция 5% р-ра трихлоруксусной кислоты в экспериментах на лабораторных животных - крысах [Artaє, https://doi.org/10.1080/01443615.2017.1399991] - приводила к значимому уменьшению размеров кист при сохранении овариального резерва.

Имеющиеся данные по использованию 1% р-ра полидоканола в экспериментальном и одиночном клиническом исследовании [Li, DOI: 10.3233/CH-211134; YANG, CN102240264A] показали хороший гемостатический и склерозирующий эффект и уменьшение объема кисты до 50%. Полидоканол - склерозирующее средство, не одобренное FDA, но используется в Европе для лечения варикоцеле и варикоза. Однако полидоканол обладает значительным побочным эффектом - некроз мягких тканей из-за экстравазации.

Применение масляной эмульсии brucea javanica [FENGJUAN, CN 103565853 A] показало, что она способна ингибировать экспрессию сосудисто-эндотелиального фактора роста VEGF и циклооксигеназы-2 COX-2 в ткани эндометрия, регулировать экспрессию каспазы-3 и способствовать апоптозу эктопических клеток эндометрия. Эта эмульсия обладает по сравнению с этанолом небольшими токсическими и побочными эффектами, однако данных по частоте рецидивов и сохранности овариального резерва не представлено в литературе.

Наиболее близким по составу раствора для аспирационно-пункционного лечения эндометриомы яичника является 3% раствор перекиси водорода [Гребенкин, RU 2337642]. При ограниченном (N=19) исследовании в 6-месячном наблюдении не показано рецидивов. Верхняя оценка частоты рецидива в этом случае может соответствовать уровню 100%/19>5%, что сопоставимо с лучшими параметрами склеротерапии этанолом. Необходимо отметить, что 3% раствор перекиси водорода обладает антисептическими и гемостатическими свойствами.

К недостаткам указанного раствора следует отнести высокую концентрацию перекиси водорода 3%, приводящей к значительной каталазной реакции с цельной кровью с выделением кислорода и, соответственно, затрудняющей процедуру аспирации. 3% перекись водорода не рекомендована для орошения полостей.

Для устранения указанного недостатка мы предлагаем в известном растворе для склеротерапии, снизить концентрацию перекиси водорода (до 1-5 мкмоль/л), снизить ph раствора до значений 1-1,5 , и насытить раствор активными формами кислорода (супероксиданион), азота - (пероксинитрит). Наличие перечисленных дополнительных свойств раствора, обеспечит склерозирующее действие раствора при отсутствии каталазной реакции.

Технический результат достигается тем, что слабый раствор перекиси водорода получается известным способом обработки воды плазмой неравновесного разряда в атмосферном воздухе. Применение газоразрядной плазмы позволяет дополнительно с перекисью водорода насытить раствор иными обладающими биологической активностью частицами. Совокупный состав свежеприготовленно раствора представлен активными формами кислорода (супероксиданион/гидропероксильный радикал) в концентрации 0,1-0,5 мкмоль/л и азота (пероксинитрит) в концентрации 1-5 мкмоль/л, азотной кислотой в концентрации 1-5 ммоль/л и перекисью водорода в концентрации 1-5 мкмоль/л [Пискарев, eLIBRARY ID: 26086265]. Из-за сниженного pH указанные растворы получили название «плазменная кислота» [Shainsky, https://doi.org/10.1002/ppap.201100084; Shainsky, https://www.ispc-conference.org/ispcproc/ispc20/701.pdf; Shainsky, https://doi.org/10.1109/PLASMA.2011.5992900; Robinson, DOI: 10.1615/PlasmaMed.2014011596; Ling, https://doi.org/10.1088/1009-0630/16/3/09; Wang, https://doi.org/10.1080/00222348.2020.1800921; Quyen, https://doi.org/10.1088/1742-6596/860/1/012031; Robinson, https://www.proquest.com/openview/9eba0e54334c65975c866b492d345f41/1; Ying, DOI: dx.doi.org/10.15407/fm23.03.496; Lukes, https://doi.org/10.1002/9783527649525.ch8].

Наиболее близким способом получения активированного водного раствора, является способ [Пискарев, RU 2622387], в котором искровой импульсный разряд формировался подачей постоянного высокого напряжения 11 кВ через балластное сопротивление R=14 МОм на накопительную емкость величиной 3,3 нФ. При зарядке емкости до напряжения 6 кВ происходил искровой пробой рязрядного промежутка длиной 3 мм над поверхностью воды на расстоянии 20 мм. Оценка частоты импульсов для указанного способа дает 20 Гц, а энергия одного импульса 0,05 Дж. После обработки серией разрядов объема воды 40 мл происходило снижение pH раствора до значения 3. Получение более низкого pH и соответственно более концентрированного раствора в патенте не описано. Недостатком данного способа является малая длина искрового разряда, ограничивающая эффективность плазмохимических реакций энергией разрядного импульса и реакционным объемом. Ограниченная растворимость продуктов плазмохимической реакций через поверхность воды, из-за невысокого их парциального давления и высокой (комнатной температуры) воды - закон Генри - Дальтона и константа Генри.

Для устранения указанных недостатков предлагаем в известном способе генерирования химически активных частиц в жидкости с использованием электрического разряда [Пискарев, RU 2622387] повысить концентрацию активных частиц с соответствующим этому процессу снижением pH раствора до 1-1,5.

Технический результат достигается повышением парциального давления продуктов плазмохимической реакции над поверхностью воды за счет увеличения длины разрядного промежутка, напряжения и энергии разрядного импульса, увеличением растворимости продуктов плазмохимических реакций за счет снижения температуры воды.

Конкретная реализация заявляемого способа демонстрируется следующим примером Фиг. 1. Вода (1) - (бидисциллят, вода для инъекций) в объеме 10-20 мл размещается в цилиндрической емкости (2) объемом не менее 50 мл из инертного диэлектрического материала (стекло, кварцевое стекло, керамика). Диаметр емкости не менее 25 мм. Емкость закрывается негерметичной крышкой из диэлектрика (3). Над поверхностью воды на расстоянии 10-20 мм располагаются электроды (4) с межэлектродным промежутком 15-20 мм. Электроды подключаются к генератору высоковольтных наносекундных импульсов (ГИН) (5) с выходным напряжением 30-40 кВ, и частотой следования до 20 Гц и энергией импульса до 0,5 Дж. Для обеспечения чистоты раствора электроды должны быть выполнены из тугоплавкого металла с максимальной устойчивостью к выгоранию - вольфрам, железо-никелевый сплав и т.п. Для повышения растворимости продуктов плазмохимических реакций раствор охлаждается через дно и стенки сосуда до 3-5°С холодильником (6). В процессе обработки воды искровым разрядом происходит постепенное снижение ее pH. При достижении pH=1-1,5 целевая концентрация перекиси водорода будет получена. Контроль итоговой концентрации перекиси водорода в растворе может быть проведен с использованием метода иодометрии или электрохимическим методом. Контроль снижения pH можно осуществлять предварительным построением калибровочной зависимости (pH - число импульсов разряда).

Таким образом, в заявляемом способе генерирования химически активных частиц в жидкости с использованием электрического разряда достигается более низкое значение pH раствора по сравнению с прототипом.

Эффективность раствора для склеротерапии полученным способом генерирования химически активных частиц в жидкости с использованием электрического разряда доказана в ряде экспериментов.

Для сравнения свойств растворов для склеротерапии мы использовали образцы ткани стенки эндометриодной кисты яичника, полученные в ходе лапароскопической операции энуклеации кисты яичника (N=25) с соблюдением этических норм проведения такого рода исследований и с информированным согласием пациентов. Образцы ткани нарезались прямоугольными кусочками 1×1 см и весом 0,1-0,5 г., помещались в холодный (4°С) физиологический раствор для транспортировки в лабораторию. В лаборатории производилась инкубация полученных образцов при комнатной температуре в течение 1 часа в различных средах объемом 1 мл. Контрольная группа ткани - (К) инкубировалась в физиологическом растворе, вторая группа инкубировалась в 95% этаноле - (С), третья группа инкубировалась в свежеприготовленной описанным методом плазменной кислоте (П) со значением pH=1,5. Две дополнительные группы использовали последовательную, по 30 минут, инкубацию в спирте и плазменной кислоте (СП) и плазменной кислоте, а затем - в спирте (ПС). После инкубации образцы фиксировались в 10% растворе формалина в фосфатном буфере. Из фиксированных образцов были получены гистологические срезы. Оценка апоптоза в тканях эндометриоидной кисты осуществлялась методом TUNEL с последующей визуализацией методом флуоресцентной микроскопии. Гистологический анализ состояния ткани стенки эндометриодной кисты яичника после обработки различными склерозирующими растворами осуществлялся при окраске тканей гематоксилин-эозином с последующей визуализацией методом световой микроскопии.

Дополнительная часть образцов (N=10) после инкубации подвергалась 1-часовой экстракции раствором мочевины с концентрацией 1 моль/л и объемом 1 мл. Концентрация общего белка в экстракте определялась методом Бредфорда.

При оценке уровня апоптоза методом TUNEL при действии плазменной кислоты на стенку эндометриодной капсулы Фиг. 2 в клетках стенки эндометриоидной капсулы обращает на себя внимание проапоптотическое действие всех без исключения вариантов применения растворов (спирт, плазменная кислота и их комбинация), при этом максимальный проапоптотический эффект достигался при последовательной инкубации ткани в растворах «спирт + плазменная кислота» (вне зависимости от последовательности их применения).

Таким образом, плазменная кислота обладает выраженным проапоптотическим действием, усиливающимся при сочетанном применении этанола. Наличие выраженного апоптотического действия склерозирующего раствора для обработки эндометриомы яичника считается фактором его эффективности [FENGJUAN, CN 103565853 A].

Гемостатический и склерозирующий сосуды эффекты плазменной кислоты оценивался по способности фиксировать в капиллярах эритроциты и гемоглобин, переводя последний в метгемоглобин. В исследовании гистологически оценивалось скопление гранул внеклеточного гемосидерина в обработанных образцах. Была принята следующая ранговая шкала (Таблица 1)

Таблица 1. Ранговая шкала гистологического признака (скопление гранул внеклеточного гемосидерина) Гистологический признак Ранг Нет, единичные 0 Очаговые 1 Диффузные 2 Умеренные 3 Большое 4

Непараметрический анализ рангов выявил закономерности, показанные на диаграмме (Фиг. 3). Значимость оценивалась по критерию Манна-Уитни. Мы установили, что все виды обработки ткани приводят к увеличению скопления гранул гемосидерина в стенке эндометриоидной капсулы, что может быть обусловлено гемолизом эритроцитов, присутствующих в пристеночной области кисты, а также образованием метгемоглобина и его денатурацией. Примечательно, что применение плазменной кислоты по сравнению с обработкой спиртом было более эффективным по гемостатическому и склерозирующему капилляры эффектам.

Склерозирующий эффект от применения растворов оценивался также по способности раствора фиксировать белок в ткани стенки эндометриодной капсулы. В наших экспериментах концентрация белка в экстракте от различных образцов варьировалась в пределах 5-80 мкг/мл. Для учета размера образца мы рассчитывали удельную по массе образца концентрацию белка, которая варьировалась в пределах 50-300 мкг/(мл*г). Для учета индивидуальных характеристик стенки эндометриодной капсулы мы нормировали полученную удельную по массе концентрацию белка на значение в контрольной группе. На диаграмме (Фиг. 4) показана нормированная удельная концентрация белка в экстракте ткани стенки эндометриоидной кисты яичника после обработки различными склерозирующими растворами. Как видно из представленной диаграммы, все склерозирующие растворы способны фиксировать белок в ткани стенки кисты эндометриомы яичника. Сравнение плазменной кислоты и этанола свидетельствует о более выраженной способности плазменной кислоты фиксировать белок в ткани стенки эндометриодной капсулы, что делает последнюю более эффективным склерозантом.

В целом, с учетом описанных эффектов, применение плазменной кислоты для склеротерапии эндометриомы яичника, является патогенетически оправданным.

Таким образом, заявляемый раствор для склеротерапии эндометриодных кист яичника, по сравнению с прототипом, обладает положительным признаком - снижение концентрации перекиси водорода, и более эффективен нежели традиционный этанол по способности индуцировать апоптоз, гемостатическому действию и способности склерозировать кровеносные капилляры, а также способности фиксировать белок в ткани стенки эндометриоидной кисты и является эффективным склерозирующим раствором для склеротерапии эндометриомы яичника.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к гинекологии, и предназначена для лечения эндометриоидных кист яичников. Раствор для аспирационно-пункционного лечения эндометриомы яичника получают путем обработки стерильной воды для инъекций плазмой искрового разряда с помощью генератора высоковольтных наносекундных импульсов с выходным напряжением 30-40 кВ, частотой следования до 20 Гц и энергией импульса до 0,5 Дж. Раствор содержит перекись водорода, азотную кислоту, активные формы кислорода и азота. рН раствора составляет 1-1,5. Также представлен способ получения указанного раствора, включающий обработку стерильной воды для инъекций плазмой искрового разряда с помощью генератора высоковольтных наносекундных импульсов с выходным напряжением 30-40 кВ, частотой следования до 20 Гц и энергией импульса до 0,5 Дж, при этом воду обрабатывают до достижения раствором рН 1-1,5 в закрытом негерметичном сосуде из инертного диэлектрического материала. Использование группы изобретений позволяет повысить эффективность лечения эндометриомы яичника. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

1. Раствор для аспирационно-пункционного лечения эндометриомы яичника, полученный путем обработки стерильной воды для инъекций плазмой искрового разряда с помощью генератора высоковольтных наносекундных импульсов с выходным напряжением 30-40 кВ, частотой следования до 20 Гц и энергией импульса до 0,5 Дж, при этом раствор содержит перекись водорода, азотную кислоту, активные формы кислорода и азота, а также рН раствора составляет 1-1,5.

2. Способ получения раствора по п. 1 путем обработки стерильной воды для инъекций плазмой искрового разряда с помощью генератора высоковольтных наносекундных импульсов с выходным напряжением 30-40 кВ, частотой следования до 20 Гц и энергией импульса до 0,5 Дж, при этом воду обрабатывают до достижения раствором рН 1-1,5 в закрытом негерметичном сосуде из инертного диэлектрического материала.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что температура воды для получения раствора составляет 3-5°С.