Способ получения настойки листьев дуба черешчатого, обладающей антимикробной активностью Российский патент 2022 года по МПК A61K36/49 A61K127/00 B01D11/02 A61P31/04 A61P31/10 

Данное изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности, к производству лекарственных средств на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) и касается получения настойки из листьев дуба черешчатого (Quercus robur L.), обладающей антимикробной активностью в отношении патогенных клинических штаммов микроорганизмов, таких как Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans (Фиг. 1).

На сегодняшний день поиск новых противомикробных лекарственных средств остается по-прежнему актуальной проблемой. Растительные препараты имеют ряд преимуществ по сравнению с синтетическими, поскольку обладают широким спектром биологической активности за счет содержащихся в них биологически активных соединений (БАС), в том числе флавоноидов, которые обладают антимикробными, противовоспалительными, антиоксидантными свойствами [3, 4]. Кроме того, растительные препараты не вызывают резистентности у микроорганизмов и безопасны в применении.

В настоящее время в мировой медицинской практике применяется отвар коры дуба черешчатого в качестве вяжущего и противовоспалительного лекарственного средства [3, 4]. Отвар коры дуба имеет ряд недостатков, которые заключаются в малом сроке хранения препарата, низком содержании флавоноидов (0,02%), низком выходе веществ из сырья (27,12%) и отсутствием данных о наличие антимикробной активности на ряд клинических штаммов, например, таких как Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans.

Прототипом данного способа стал способ получения настойки из листьев тополя черного, обладающей антимикробным действием в отношении штаммов Burkholderia, заключающийся в том, что настаивают листья тополя черного 70% этиловым спиртом в соотношении «сырье - экстрагент» 1:8 в условиях дробной экстракции - дважды при комнатной температуре в течение 24 часов с последующим извлечением при нагревании на кипящей водяной бане и объединением трех извлечений; в итоге получают готовый объединенный продукт - настойку листьев тополя черного на 70% этиловом спирте, в которой содержание суммы флавоноидов (целевые вещества), определенное с использованием спектрофотометрического метода, составляет 0,51%, выход целевых веществ в настойке составляет 90,0% [1, 2].

Недостатком данного прототипа является невозможность его применения для листьев дуба черешчатого, также не описана антимикробная активность в отношении штаммов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans. Поэтому целью данного изобретения является усовершенствование способа получения настойки из листьев дуба черешчатого по упрощенной методике ее получения (метод дробной перколяции), обладающей антимикробной активностью на более широкий спектр патогенных клинических штаммов [6].

Технический результат заключается в получении настойки из листьев дуба черешчатого, обладающей антимикробной активностью с более высоким содержанием суммы действующих веществ по сравнению с аналогом – отваром коры дуба, при использовании оптимальной технологии ее получения (метод дробной перколяции).

Технический результат достигается путем осуществления способа, который заключается в проведении экстрагирования измельченных листьев Quercus robur L. 70% спиртом этиловым в соотношении «сырье - экстрагент» – 1:5 методом дробной перколяции, при этом содержание суммы действующих веществ, определенное с использованием спектрофотометрического метода, составляет 0,27%, выход действующих веществ составляет 83,7%.

Данный способ позволяет получить новое антимикробное средство в виде настойки листьев дуба на 70% спирте этиловом, обладающей антимикробной активностью на более широкий спектр патогенных клинических штаммов.

Предлагаемые параметры технологии являются оптимальными и позволяют максимально извлекать сумму действующих веществ из листьев Quercus robur L., обеспечивая максимальный антимикробный эффект в отношении следующих штаммов микроорганизмов: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans (Фиг. 1).

На Фиг. 1 представлены результаты тестирования настойки листьев дуба черешчатого на 70% спирте этиловом на наличие антимикробной активности.

Настойку получают следующим образом.

Первый день. Используется метод дробной перколяции. В установку из трех перколяторов помещают сырье измельченных листьев дуба черешчатого, проходящих сквозь сито диаметром 5 мм, по 1 части в каждый из перколяторов. В установку перколяторов заливают необходимое для намачивания сырья 70% спирт этиловый (данный объем берется исходя из экспериментально установленного коэффициента водопоглощения для листьев, который при учете влажности (7,3%) равен 1,5 мл/г), закрывают пробкой установку и оставляют для настаивания в течение 24 часов при комнатной температуре.

Второй день. Через установку перколируют необходимый объем 70% спирта этилового, рассчитанный из соотношения «сырье – экстрагент» - 1:5, контролируя необходимый объем экстрагента над сырьем (зеркало), при скорости перколяции 1 капля в три секунды. Полученный готовый продукт – настойку, фильтруют через ватно-марлевый тампон и затем помещают во флакон темного стекла и укупоривают пробкой из полимерных материалов.

Предлагаемый способ поясняется следующим примером.

Пример 1

Первый день. Используется три перколятора на 250 мл. В каждый перколятор помещают по 70,0 г измельченных листьев дуба черешчатого, проходящих сквозь сито диаметром 5 мм. В установку из трех перколяторов заливают 1,5 объема от сырья – 315 мл 70% этилового спирта, закрывают установку пробкой и оставляют для настаивания в течение 24 часов при комнатной температуре.

Второй день. Через перколяторы проливают необходимый объем 70% спирта этилового – 1050 мл, данный объем рассчитывается из соотношения «сырье – экстрагент» – 1:5, контролируя необходимый объем экстрагента над сырьем (зеркало), при скорости перколяции 1 капля в три секунды. Полученный готовый продукт – настойку, фильтруют через ватно-марлевый тампон и затем помещают во флакон темного стекла и укупоривают пробкой из полимерных материалов.

Выбор концентрации этилового спирта продиктован литературными данными и подтвержден экспериментально, 70% этиловый спирт, используемый в качестве экстрагента, приводит к максимальному извлечению из сырья суммы флавоноидов (целевых веществ) [4].

Настойку листьев дуба черешчатого, полученную методом дробной перколяции, исследовали на противомикробную активность.

Наличие противомикробной активности определяли на клинических штаммах микроорганизмов: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans. Определение минимальной ингибирующей концентрации проводили методом двойных серийных разведений в мясо-пептонном бульоне (пробирочный, макрометод) в соответствии с методиками, описанными в МУK 4.2.1890-04 [3].

В качестве тестовых культур были использованы штаммы Американской коллекции типовых культур (АТСС): Staphylococcus aureus (АТСС 29213), Escherichia coli (АТСС 25922), Pseudomonas aeruginosa (АТСС 27853), а также Candida albicans (клинический штамм).

Тестирование проводилось в объеме 1 мл (0,5 мл инокулюма микроорганизмов и 0,5 мл соответствующего разведения исследуемого образца) с конечной концентрацией исследуемого микроорганизма примерно 5×10⁵ КОЕ/мл. В качестве питательной среды использовался питательный бульон Мюллера-Хинтона (Bio-Rad, США). Инкубацию проводили при температуре 35°С в течение 24 часов. Параллельно проводился опыт для постановки «отрицательного» контроля (Фиг. 2). Оценку результатов проводили визуально по наличию/отсутствию роста микроорганизмов в пробирках с соответствующими разведениями исследуемых образцов. При этом проводили визуальную оценку задержки роста, через 24 часа отсутствие роста оценивали как антимикробный эффект, а появление видимого роста – как отсутствие противомикробной активности [5].

Полученные результаты исследования позволили сделать вывод об имеющейся выраженной антимикробной активности настойки листьев Quercus robur L. Отсутствие роста микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa наблюдалось при разведении в 8 раза, Staphylococcus aureus – при разведении в 16 раза; Escherichia coli – при разведении в 32 раз; Candida albicans – при разведении в 64 раз, При дальнейшем разведении рост культуры возобновляется (Фиг. 1).

Таким образом, предлагаемый способ получения настойки из листьев Quercus robur L. методом перколяции разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:

1. Настойка листьев дуба черешчатого, полученная на 70% этиловом спирте в соотношении «сырье-экстрагент» – 1:5, позволяет повысить выход суммы действующих веществ (флавоноидов) из листьев дуба черешчатого с 27,12% до 83,7%, так как является оптимальным экстрагентом для выделения суммы флавоноидов из лекарственного растительного сырья.

2. Полученная настойка листьев дуба черешчатого обладает активностью в отношении штаммов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, в отличие от настойки на основе листьев тополя черного, что позволяет рекомендовать настойку листьев дуба черешчатого в качестве препарата с широким спектром антимикробной активностью.

3. Обсуждаемое средство позволяет эффективно решить вопрос комплексного использования растения, так как листья дуба черешчатого составляют значительную часть фито-массы растения, а ареал обитания Quercus robur L. значительно шире по отношению к другим видам внутри таксономической группы, что значительно упрощает задачу поиска сырьевой базы для получения лекарственного средства [2].

Настойка листьев дуба черешчатого может применяться в химико-фармацевтической промышленности для производства лекарственных препаратов активных в отношении некоторых клинических штаммов, таких как Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Государственная фармакопея Российской Федерации / МЗ РФ. XIV изд. Т. I-IV. М., 2018. [Электронный ресурс] URL: http:// http://femb.ru/femb/pharmacopea.php (дата обращения: 05.10.2020).

2. Губанов И.А., Киселёва К.В., Новиков В.С., Тихомиров В.Н., Иллюстрированный определитель растений Средней России. Т.-2: Покрытосеменные (двудольные: раздельнолепестные). М.: Т-во научных изданий КМК, Ин-т технологических исследований. – 2003. – С. 34.

3. Кароматов И.Д., Махмудова Г.Ф.К. Дуб обыкновенный - применение в лечебной практике // Биология и интегративная медицина. - 2016. - № 3. - С. 41-47.

4. Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов) / В.А. Куркин. – 4-е, перераб. и доп. – Самара: ООО «Офорт», ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2019. – С. 966-969.

5. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания. МУК 4.2.1890-04 // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2004. - Т.6, № 4. – С. 306-359.

6. Патент РФ № 2695661 «Способ получения настойки из листьев тополя черного, обладающей активностью в отношении штаммов Burkholderia» (заявка № 2019112565, от 24.04.2019 г., решение о выдаче патента 25.07.2019 г.).

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения настойки листьев дуба черешчатого. Способ получения настойки листьев дуба черешчатого, обладающей антимикробной активностью, путем экстракции лекарственного растительного сырья водным спиртом, в котором настаивают листья дуба черешчатого 70% спиртом этиловым в соотношении «сырье-эктрагент» 1:5 методом дробной перколяции при комнатной температуре в течение 24 часов с получением готового продукта настойки листьев дуба черешчатого на 70% этиловом спирте с выраженной антимикробной активностью в отношении патогенных клинических штаммов микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans, которая в дальнейшем может использоваться в качестве антимикробного препарата. Вышеописанный способ характеризуется оптимальной технологией и позволяет получить настойку с антимикробной активностью с высоким содержанием суммы действующих веществ, которая обладает выраженной антимикробной активностью в отношении патогенных клинических штаммов микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans. 1 ил., 1 пр.

Способ получения настойки листьев дуба черешчатого, обладающей антимикробной активностью, путем экстракции лекарственного растительного сырья водным спиртом, отличающийся тем, что настаивают листья дуба черешчатого 70% спиртом этиловым в соотношении «сырье-эктрагент» 1:5 методом дробной перколяции при комнатной температуре в течение 24 часов с получением готового продукта настойки листьев дуба черешчатого на 70% этиловом спирте с выраженной антимикробной активностью в отношении патогенных клинических штаммов микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans, которая в дальнейшем может использоваться в качестве антимикробного препарата.