Способ экстракции флавоноидов из растительного сырья Российский патент 2022 года по МПК A61K36/53 A61K36/533 A61K36/38 B01D11/02 

Описание патента на изобретение RU2782459C1

Изобретение относится к фармакологии и медицине и может быть использовано для экстракции флавоноидов из растительного сырья с использованием глубоких эвтектических растворителей, которые биодеградируемы, безопасны, стабильны, их производство доступно и легко осуществимо, а эффективность экстракции сопоставима с известными органическими растворителями.

Известен способ экстракции флавоноидов из растительного сырья [А.Ж. Абилхан и др. Экстракция флавоноидов из лабазника вязолистного в условиях микроволнового излучения. XX Международная научно-практическая конференция имени профессора Л.П. Кулева. Теоретические и прикладные аспекты фармации и биотехнологии], согласно которому в качестве растительного сырья используют лабазник вязолистный, который предварительно измельчают и пропускают через сито с диаметром отверстий 0,5 мм, а в качестве экстрагента для извлечения флавоноидов используют водно-спиртовые смеси различной концентрации.

Недостатком способа является относительно низкая безопасность, вызванная применением экстрагента в виде водно-спиртовой смеси.

Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ холодной водной экстракции флавоноидов из лекарственного растительного сырья [RU 2453322, C1, A61K 36/00, 20.06.2012], заключающийся в том, что, экстракцию проводят при напряжении электрического поля 5 В и частотой 105 Гц при перемешивании в течение 30-60 мин.

Недостатком способа является относительно низкая эффективность экстракции и относительно высокая сложность, вызванная необходимостью формирования электрического поля.

Известны также способы получения глубоких эвтектических растворителей, обладающих высокой безопасностью применения, например, [Облучинская Е.Д. и др. Глубокие природные эвтектические растворители как альтернативные экстрагенты для извлечения флоротанинов бурых водорослей. Химико-фармацевтический журнал. Том 53, №3, 2019], заключающегося в том, что используют смесь природных компонентов L-молочной кислоты, бетаина, холина хлорида, яблочной кислоты, глюкозы и глицерина, которые смешивают в определенных молярных соотношениях и нагревают до температуры 50°С при постоянном перемешивании до образования прозрачной жидкости в виде конечного продукта.

Задачей, которая решается в изобретении, направлена на разработку способов эффективной экстракции флавоноидов из растительного сырья с использованием глубоких эвтектических растворителей, получаемых из растительного сырья и обладающих безопасностью применения.

Требуемый технический результат заключается в повышении эффективности экстракции флавоноидов из растительного сырья и расширении арсенала технических средств для экстракции флавоноидов из растительного сырья, обеспечивающих безопасность применения конечного продукта.

Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что смешивают исходные природные компоненты из сбора растительной композиции, состоящего из травы пустырника сердечного, травы зверобоя продырявленного, травы мелиссы лекарственной и травы тимьяна ползучего в соотношении 4:2,5:2,5:1, которые измельчают до размера частиц 2-3 мм, добавляют 40% раствор эвтектического растворителя, полученного на основе бетаина гидрохлорида и пропиленгликоля в мольном соотношении 1:3, и после смешивания нагревают до 60°С на водяной бане с постоянным помешиванием до образования однородной прозрачной жидкости в виде конечного продукта.

На чертеже представлены:

на фиг. 1 - содержание флавоноидов (мг/г) в экстрактах из растительного сбора на основе 50% (m/m) водных растворов DESs;

на фиг. 2 - выход флавоноидов из растительного материала в зависимости от концентрации DES;

на фиг. 3 - содержание флавоноидов (мг/г) в экстрактах из растительного сбора на основе 40% водного раствора DES-20, полученных при различных температурах.

Для оценки эффективности предложенного глубокого эвтектического растворителя для экстракции флавоноидов из растительного сырья в сопоставлении их экстракции с известными растворителями были проведены соответствующие исследования.

Материалы и методы.

Экстракцию флавоноидов проводили из сбора растительной композиции, состоящей из травы пустырника сердечного (пустырника обыкновенного) (Leonurus cardiaca L.), травы зверобоя продырявленного {Hypericumperforatum L.), травы мелиссы лекарственной {Melissa officinalis L.) и травы тимьяна ползучего (чабреца) (Thymus serpyllum L.) в соотношении 4: 2,5: 2,5: 1, измельченных до размера частиц 2-3 мм. Лекарственные растения были доставлены из Северо-Кавказского филиала Ботанического сада Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР). Данный сбор обладает седативными свойствами благодаря содержанию флавоноидов, основным из которых является рутин, что было доказано валидированными методами.

Холина битартрат (Mw=253,25) и бетаина гидрохлорид (Mw=153,61) получены из Suzhou Vitajoy Biotech Co., Китай, яблочная кислота (Mw=134,1) доставлена из Anhui Sealong Biotechnology, Китай, молочная кислота (Mw=90,08), лимонная кислота (Mw=192,1), щавелевая кислота (Mw=90,04), глюкоза (Mw=180,16), пропиленгликоль (Mw=76,09), глицерин (Mw=92,09) и порошок рутина (>94.0%) предоставлены компанией Sigma Aldrich, Китай, люминия хлорид получен от PanReac AppliChem, спирт этиловый 96% - от ООО «Константа-Фарм М», кислота уксусная ледяная - от компании «АльфаХим».

Для изготовления различных комбинаций глубоких эвтектических растворителей был использован тепловой метод. Компоненты смешивали в определенных мольных соотношениях в стеклянной конической колбе, закрывали пробкой и нагревали при 60°С на водяной бане до образования однородной прозрачной жидкости (60-90 мин), устойчивой и стабильной при комнатной температуре.

В данном эксперименте нами получен 21 глубокий эвтектический растворитель. Их описание и состав приведены в таблице 1. Изготовленные DESs представляют собой вязкие прозрачные жидкости.

Около 2 г (точная навеска) исследуемого сырья помещали в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 30 мл полученного глубокого эвтектического растворителя, колбу закрывали пробкой. Затем колбу нагревали при температуре 60°С в течение 1 ч, содержимое перемешивали с помощью магнитной мешалки. Колбу охлаждали до комнатной температуры, содержимое колбы фильтровали через бумажный складчатый фильтр (синяя лента) для дальнейшего анализа.

Все экстракты на основе DESs были получены в одинаковых условиях: соотношение сырье: экстрагент - 1:15 г/мл, время экстракции - 1 ч., температура экстракции - 60°С. Для первоначального скрининга экспериментальных образцов DESs, представленных в таблице 1, изготовлены их 50% (m/m) водные растворы. Усовершенствование процесса экстрагирования осуществлялось после выбора оптимального DES по параметрам содержания воды в растворе DES (30, 40, 50, 60 и 70%) и температуры экстракции (50, 60, 70, 80°С).

Для оценки суммарного содержания флавоноидов в полученных извлечениях был использован метод дифференциальной спектрофотометрии, основанный на реакции комплексообразования флавоноидов с ионами трехвалентных металлов - Al, Zr, Ga и др., и обладающий большей селективностью по сравнению с прямым спектрофотометрическим методом.

В результате реакции комплексообразования с алюминия хлоридом происходит батохромный сдвиг полосы поглощения флавоноидов с 330-350 нм до 390-410 нм, что позволяет количественно обнаружить искомые действующие вещества по оптической плотности растворов в этой области спектра.

При добавлении 5% раствора хлорида алюминия в 70% этиловом спирте к раствору изучаемого извлечения в его спектре наблюдается максимум поглощения, который совпадает с максимумом поглощения раствора рутина с хлоридом алюминия. Это определило выбор длины волны 410±2 нм как характеристической для количественного определения содержания флавоноидов в полученных с помощью глубоких эвтектических растворителей экстрактах.

Измерения проводились на спектрофотометре Shimadzu UV-1800.

Все эксперименты проводились в трех повторностях. Статистическую обработку осуществляли с использованием программного пакета STATISTICA 8.0 (StatSoft). Статистически значимыми признавались различия при р<0.05.

Для оценки эффективности DESs для извлечения флавоноидов был протестирован 21 глубокий эвтектический растворитель на предмет эффективности экстракции флавоноидов из растительного сбора на основе травы пустырника, травы зверобоя, травы мелиссы и травы чабреца. Эффективность процесса извлечения БАВ изучена в сравнении с экстрактами, полученными на основе 70% спирта этилового, 96% спирта этилового и воды как наиболее часто применяемых экстрагентов для флавоноидов. Вязкость изготовленных DESs снижена их разбавлением 50% воды (m/m). В качестве акцептора протона выступали холина битартрат или бетаина гидрохлорид, в качестве донора - органические кислоты, спирты и сахара.

Данные по извлечению флавоноидов из сбора растительной композиции приведены на фиг. 1 и отображены в таблице 2.

Как видно из графика фиг. 1, способность DES к извлечению флавоноидов зависит от состава конкретного экстрагента. Для DESs, основу которых составлял холина битартрат как акцептор протона, извлекающая способность оказалась в целом ниже, чем для DESs на основе бетаина гидрохлорида. Возможно, это обусловлено особенностью возникновения водородных связей между компонентами DES. Хлорид-анион - более сильный акцептор протонов, чем ион битартрата, Доказано, что флавоноиды конкурируют с донорами протонов в составе DES за образование водородных связей. Чем больше образуется водородных связей в структуре DES, тем большее количество флавоноидов может взаимодействовать с компонентами растворителя и извлекаться из растительного материала. Кроме того, больший размер аниона битартрата по сравнению с хлорид-ионом может способствовать возникновению стерических препятствий к образованию водородных связей.

Важное значение играет и тип донора протонов. Целевые экстрагируемые соединения - флавоноиды, обладающие слабыми кислотными свойствами за счет свободных фенольных гидроксильных групп и поэтому хорошо растворимые в растворах щелочей. DESs, базирующиеся на органических кислотах как донорах протона, имеют более кислую среду и поэтому хуже извлекают флавоноиды, чем DESs, включающие спирты в качестве доноров протонов. Этот эффект доказывает тот факт, что именно DESs на основе полиолов и гликолей (ПЭГ-400, глицерина, пропиленгликоля) обладают наилучшей экстрагирующей способностью. Кроме того, по-видимому, образуемые органическими кислотами водородные связи более устойчивы, и экстрагируемым флавоноидам труднее заместить их в составе растворителя, т.е. энтальпия сольватации полиолов в составе DESs более экзотермична и выгодна для извлечения целевых соединений их растительного материала.

Таким образом, оптимальным экстрагентом для извлечения флавоноидов из растительной композиции является DES-20 на основе бетаина гидрохлорида и пропиленгликоля в мольном соотношении 1:3. С помощью данного экстрагента удалось извлечь 9,48±0,02 мг/г сухого сырья флавоноидов в пересчете на рутин, что составляет 97,7% от количественного содержания флавоноидов в водно-этанольном (70%) экстракте, взятом в качестве стандарта.

Исследован и эффект содержания воды в составе DES на его экстрагирующую способность. Получены DESs на основе бетаина гидрохлорида - пропиленгликоля в мольном соотношении 1:3 (DES-20), содержащие 30,40, 50, 60 и 70% воды (m/m), которые использовали в качестве экстрагентов флавоноидов из растительного сбора. Экстракция осуществлялась при температуре 60°С в течение 1 ч при соотношении сырье: экстрагент 1:15 г/мл.

Выход флавоноидов из растительного материала в зависимости от концентрации DES графически представлен на фиг. 2.

Как следует из анализа графика, с разбавлением DES экстрагирующая способность растворителя сначала увеличивается, что может быть вызвано повышением полярности растворителя, а также уменьшением его вязкости. Это облегчает процесс диффузии согласно уравнению Стокса-Эйнштейна:

где D - коэффициент диффузии, k - постоянная Больцмана, Т -абсолютная температура, η - вязкость среды, R - гидродинамический радиус молекулы.

Однако, после определенного значения дальнейшее увеличение содержания воды приводит к уменьшению выхода флавоноидов из растительного сырья, что можно объяснить разрывом существующих водородных связей и нарушением надмолекулярной структуры DES.

Таким образом, было установлено, что оптимальное содержание воды в DES на основе бетаина гидрохлорида и пропиленгликоля (мольное соотношение 1:3) составляет 60%.

Влияние температуры на процесс экстракции флавоноидов

Чтобы определить оптимальную температуру экстракции, была осуществлена экстракция флавоноидов из сбора растительной композиции при температурах 50, 60, 70 и 80°С. Эффект, оказываемый температурой на извлечение БАВ, представлен на фиг. 3.

Повышение температуры экстракции, с одной стороны, ведет к увеличению скорости диффузии, но, с другой стороны, приводит к разрушению флавоноидов как термолабильных соединений.

Экстракцию флавоноидов из растительного сбора проводили с помощью 40% раствора DES-20 на основе бетаина гидрохлорида - пропиленгликоля (мольное соотношение 1:3) при температурах 50, 60, 70 и 80°С в течение 1 ч. На основании полученных экспериментальных данных было установлено, что оптимальная температура, позволяющая извлечь из сырья и сохранить наибольшее количество флавоноидов, составляет 60°С.

Альтернативную экстракцию флавоноидов проводили из сбора растительной композиции, состоящей из травы пустырника сердечного (пустырника обыкновенного) (Leonurus cardiaca L.), травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.), травы мелиссы лекарственной (Melissa officinalis L.) и травы тимьяна ползучего (чабреца) (Thymus serpyllum L.) в соотношении 4: 2,5: 2,5: 1, измельченных до размера частиц 2-3 мм.

Результаты исследований показали, что наилучшим экстрагентом для флавоноидов из сбора растительной композиции, состоящей из травы пустырника, травы зверобоя, травы мелиссы и травы чабреца, оказался DES на основе бетаина гидрохлорида и пропиленгликоля в мольном соотношении 1:3. Оптимизация условий процесса, а именно экстракция 40% раствором DES-20 при температуре 60°С, позволила добиться увеличения выхода флавоноидов из растительного сырья: количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин составило 10,09 мг/г сухого сырья, что превышает выход флавоноидов при классическом методе экстракции 70% этиловым спиртом (9,7 мг/г сухого сырья). Таким образом, можно прийти к заключению, что предложенный экологичный и безопасный способ экстракции БАВ из растительного материала перспективен и может являться достойной альтернативой классическим методам экстракции органическими растворителями.

Предложенный способ обеспечивает повышение эффективности экстракции флавоноидов из растительного сырья и расширении арсенала технических средств для экстракции флавоноидов из растительного сырья, обеспечивающих безопасность применения конечного продукта.

Похожие патенты RU2782459C1

название год авторы номер документа
Способ экстракции полифенольных соединений из змееголовника молдавского 2021
  • Джавахян Марина Аркадьевна
  • Павельева Олеся Константиновна
  • Бурова Алла Евгеньевна
  • Прожогина Юлия Эдуардовна
  • Павельев Станислав Алексеевич
  • Адамов Григорий Васильевич
RU2794516C1
Способ получения водно-спиртового экстракта лекарственных растений, обладающего седативным и гипотензивным действием 2018
  • Джавахян Марина Аркадьевна
  • Токарева Мария Григорьевна
  • Куляк Олеся Юрьевна
  • Панина Марина Ивановна
  • Сайбель Ольга Леонидовна
  • Мизина Прасковья Георгиевна
  • Сидельников Николай Иванович
RU2683643C1
СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО (Hypericum perforatum L.) 2014
  • Милевкая Виктория Васильевна
  • Статкус Михаил Александрович
  • Темердашев Зауаль Ахлоович
RU2568912C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МНОГОКОМПОНЕНТНОЙ НАСТОЙКИ 2021
  • Шмыгарева Анна Анатольевна
  • Куркин Владимир Александрович
  • Саньков Анатолий Николаевич
  • Рыбалко Майя Викторовна
  • Рязанова Татьяна Константиновна
RU2789301C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО СЕДАТИВНЫМ, ГИПОТЕНЗИВНЫМ И АНТИОКСИДАНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ 2022
  • Мирович Вера Михайловна
  • Соколова Яна Вадимовна
  • Цыренжапов Арсен Владимирович
  • Оленников Даниил Николаевич
RU2792361C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОПИТКИ ГИГИЕНИЧЕСКОГО ТАМПОНА, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИТОТАМПОНА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2020
  • Нестерова Надежда Викторовна
  • Ильина Юлия Романовна
  • Самылина Ирина Александровна
  • Бирюкова Наталья Викторовна
  • Сулейманова Фидан Ширин Кызы
RU2740284C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАСЛЯНЫХ ЭКСТРАКТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ 2008
  • Шиков Александр Николаевич
  • Пожарицкая Ольга Николаевна
  • Макаров Валерий Геннадьевич
RU2373266C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ, ОБЛАДАЮЩЕЙ РАДИОЗАЩИТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ 1999
  • Архипова М.Н.
RU2152794C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАРОДОНТА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 1997
  • Куркин В.А.
  • Бурова Е.М.
  • Ежков В.Н.
  • Авдеева Е.В.
  • Куркина А.В.
RU2147223C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИДЕПРЕССАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2006
  • Куркин Владимир Александрович
  • Правдивцева Ольга Евгеньевна
  • Дубищев Алексей Владимирович
  • Кадацкая Дина Викторовна
RU2327481C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 782 459 C1

Реферат патента 2022 года Способ экстракции флавоноидов из растительного сырья

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу экстракции флавоноидов из растительного сырья. Предложен способ экстракции флавоноидов из растительного сырья, заключающийся в том, что смешивают исходные природные компоненты из сбора растительной композиции, состоящего из травы пустырника сердечного, травы зверобоя продырявленного, травы мелиссы лекарственной и травы тимьяна ползучего в соотношении 4:2,5:2,5:1, которые измельчают до размера частиц 2-3 мм, добавляют 40% водный раствор эвтектического растворителя, полученного на основе бетаина гидрохлорида и пропиленгликоля в мольном соотношении 1:3, при соотношении сырье:экстрагент 1:15 и после смешивания нагревают до 60°С на водяной бане с постоянным помешиванием до образования однородной прозрачной жидкости в виде конечного продукта. Вышеописанный способ позволяет повысить эффективность экстракции флавоноидов из растительного сырья и расширить арсенал технических средств для экстракции, обеспечивающих безопасность применения конечного продукта. 3 ил., 2 табл.

Формула изобретения RU 2 782 459 C1

Способ экстракции флавоноидов из растительного сырья, заключающийся в том, что смешивают исходные природные компоненты из сбора растительной композиции, состоящего из травы пустырника сердечного, травы зверобоя продырявленного, травы мелиссы лекарственной и травы тимьяна ползучего в соотношении 4:2,5:2,5:1, которые измельчают до размера частиц 2-3 мм, добавляют 40% водный раствор эвтектического растворителя, полученного на основе бетаина гидрохлорида и пропиленгликоля в мольном соотношении 1:3, при соотношении сырье:экстрагент 1:15 и после смешивания нагревают до 60°С на водяной бане с постоянным помешиванием до образования однородной прозрачной жидкости в виде конечного продукта.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2022 года RU2782459C1

Способ получения водно-спиртового экстракта лекарственных растений, обладающего седативным и гипотензивным действием 2018
  • Джавахян Марина Аркадьевна
  • Токарева Мария Григорьевна
  • Куляк Олеся Юрьевна
  • Панина Марина Ивановна
  • Сайбель Ольга Леонидовна
  • Мизина Прасковья Георгиевна
  • Сидельников Николай Иванович
RU2683643C1
СПОСОБ ХОЛОДНОЙ ВОДНОЙ ЭКСТРАКЦИИ ФЛАВОНОИДОВ ИЗ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ 2010
  • Федоровский Николай Николаевич
  • Марахова Анна Игоревна
  • Сорокина Алла Анатольевна
RU2453322C1
СОСТАВ, ОБЛАДАЮЩИЙ СЕДАТИВНЫМ ДЕЙСТВИЕМ 1998
  • Трутаев Игорь Викторович
  • Федорин Геннадий Федорович
RU2138280C1

RU 2 782 459 C1

Авторы

Джавахян Марина Аркадьевна

Татаринцева Алена Юрьевна

Дул Вячеслав Николаевич

Даргаева Тамара Дарижаповна

Семкина Ольга Александровна

Борисенко Елена Валерьевна

Сидельников Николай Иванович

Прожогина Юлия Эдуардовна

Даты

2022-10-27Публикация

2021-09-03Подача