ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНОГО ГУАНИНА ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ПОЛИ(ADP-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ Российский патент 2022 года по МПК A61K31/522 A61P43/00 A61P35/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицинской химии, биохимии, фармакологии, медицины и касается применения производного гуанина в качестве ингибитора поли(ADP-рибозо)полимеразы (ПАРП) человека - ядерного белка, активация которого при патологии приводит к гибели соматических клеток с нормальным фенотипом, а также к увеличению выживаемости опухолевых клеток в злокачественных новообразованиях.

Уровень техники

Белок ПАРП активируется в клетке под воздействием различных стрессовых факторов и осуществляет синтез поли(ADP-рибозы) из молекул NAD⁺[Alemasova E.E., Lavrik O.I. (2019) Nucleic Acids Res., 47, 3811-3827. Нилов Д.К. и соавт.(2020) Биохимия, 85, 116-125], что может приводить к истощению запаса NAD⁺и запуску механизмов клеточной гибели. Кроме того, синтез поли(ADP-рибозы) непосредственно вовлечен в механизмы репарации ДНК в опухолевых клетках. Активация ПАРП и связанная с ней регуляция жизнедеятельности клеток играет важную роль в патологиях сердечно-сосудистой, нервной, иммунной, дыхательной систем, а также в онкологических заболеваниях. Ингибиторы ПАРП могут применяться для цитопротекторного воздействия на органы и ткани при патологических состояниях, сопровождаемых окислительным стрессом и воспалением: в случае заболеваний сердечно-сосудистой системы (инфаркты миокарда, кардиопатии различного генеза), нервной сислемы (травмы головного мозга, инфаркты, нейровоспалительные и нейродегенеративные патологии), дыхательной системы (астма, синдром острого легочного повреждения), опорно-двигательного аппарата (артрит), а также при острых инфекционных заболеваниях (сепсис) [Curtin N.J., Szabo C. (2013) Mol. Aspects. Med., 34, 1217-1256; Henning R.J. и соавт.(2018) Cardiovasc. Toxicol., 18, 493-506; Berger N.A. и соавт.(2018) Br. J. Pharmacol., 175, 192-222]. Также большой интерес представляет использование ингибиторов ПАРП для подавления пролиферации раковых клеток в терапии онкологических заболеваний, в том числе в комбинации с известными химиопрепаратами [Cepeda V. и соавт.(2006) Recent Pat. Anticancer Drug Discov., 1, 39-53; Martin S.A. и соавт.(2008) Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 80-86; Lord C.J. и соавт.(2015) Annu. Rev. Med., 66, 455-470].

Множество соединений способны ингибировать активность ПАРП in vitro и in vivo [Jagtap P., Szabo C. (2005) Nat. Rev. Drug Discov., 4, 421-440; Jain P.G., Patel B.D. (2019) Eur. J. Med. Chem., 165, 198-215]. Тем не менее, известные ингибиторы либо недостаточно активны и специфичны для терапевтического использования, либо не удовлетворяют фармакокинетическим и токсикологическим требованиям, предъявляемым к лекарственным препаратам.

Так, например, известны синтетические ингибиторы ПАРП - олапариб, рукапариб и нирапариб, недавно одобренные для лечения онкологических заболеваний [Frampton J.E. (2015) BioDrugs, 29, 143-150; Mittica G. и соавт.(2018) Recent Pat. Anticancer Drug Discov., 13, 392-410; Zimmer A.S. и соавт.(2018) Curr. Treat. Options Oncol., 19, 21]. Данные препараты обладают серьезными побочными эффектами (в отдельных случаях наблюдается миелодиспластический синдром/острый миелоидный лейкоз), что затрудняет их широкое применение [Ohmoto A., Yachida, S. (2017) Onco Targets Ther., 10, 5195-5208; Walsh C. (2018) Minerva Ginecol., 70, 150-170; Jain P.G., Patel B.D. (2019) Eur. J. Med. Chem., 165, 198-215].

Ближайшим к заявляемому средству для ингибирования ПАРП (прототипом), является 7-метилгуанин, относящийся к природным пуринам; его потенциальным преимуществом по сравнению с синтетическими ингибиторами является безопасность для организма [RU 2522915; Нилов Д.К. и соавт.(2016) Acta Naturae, 8, 120-128; Nilov D. и соавт.(2020) Int. J. Mol. Sci., 21, 2159]. Недостатком применения 7-метилгуанина является относительно невысокая ингибиторная активность, что затрудняет эффективное подавление ПАРП внутри клетки (IC₅₀>250 мкМ, см. фиг.1).

Техническая проблема, решаемая заявляемым изобретением, заключается в выявлении производного гуанина, способного эффективно подавлять ферментативную активность ПАРП на клеточном уровне.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является идентификация соединения (производного гуанина), которое способно ингибировать активность ПАРП, оказывать цитопротекторное действие на моделях in vitro (кардиомиоциты и нейроны с нормальным фенотипом), а также подавлять пролиферацию опухолевых клеток (на примере клеточных линий рака толстой кишки и лейкоза) в концентрации (300 мкМ.

Технический результат достигается применением в качестве средства для ингибирования ПАРП производного гуанина формулы (I):

или его фармацевтически приемлемых солей, например, гидрохлорид, гидробромид, сульфат, мезилат и др. соли.

Предлагаемое соединение I, 2-амино-8-гидрокси-7-метил-1H-пурин-6(7H)-он, представляет собой производное гуанина с метильной группой в положении 7 и гидроксильной группой в положении 8, которое можно получить описанным в литературе способом [Borowitz I.J. и соавт.(1965) Biochemistry, 4, 650-655]. Соединение I, как и ближайший аналог 7-метилгуанин, является метаболитом нуклеиновых кислот и в малых количествах обнаруживается в моче человека [Weissmann B., Gutman A.B. (1957) J. Biol. Chem. 1957, 229, 239-250; Litwack M.D., Weissmann B. (1966) Biochemistry, 5, 3007-3012]. Соединение I существенно превосходит 7-метилгуанин по эффективности ингибирования ПАРП в клетках, а его природное происхождение может обуславливать более благоприятный токсикологический профиль по сравнению с синтетическими ингибиторами при воздействии на организм человека.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующими чертежами.

На Фиг.1 представлены дозовые зависимости ингибирования ПАРП с помощью соединения I и референсного ингибитора 7-метилгуанина в клетках Н9 с2, измеренные по методике A.

На Фиг.2 представлены дозовые зависимости ингибирования ПАРП с помощью соединения I и референсного ингибитора 7-метилгуанина в клетках РС12, измеренные по методике A.

На Фиг.3 представлен цитотоксический эффект соединения I и референсного ингибитора 7-метилгуанина на клетки рака толстой кишки (Caco-2) и лейкоза (THP-1), измеренный по методике Г.

Осуществление изобретения

Ниже представлено более подробное описание заявляемого изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться различным изменениям и модификациям, понятным специалисту на основе прочтения данного описания. Такие изменения не ограничивают объем притязаний.

Все используемые реагенты, за исключением соединения I, являются коммерчески доступными. Образец соединения I был получен с использованием описанных в литературе методик [Borowitz I.J. и соавт (1965) Biochemistry, 4, 650-655; Fishcher E. (1895) Eur. J. Inorg. Chem., 28, 2480-2495], структуру и чистоту соединения подтвердили методами ЯМР, масс-спектрометрии, хроматографии и элементного анализа. Все манипуляции с живыми клетками осуществляли при температуре 37°С, остальные процедуры осуществляли при комнатной температуре (в диапазоне от 18 до 25°C).

Для исследования ингибиторной, цитопротекторной и антипролиферативной активности соединения I использовали следующие методики:

Методика А. Исследование ингибиторной активности. Использовали линии адгезивных клеток - кардиомиоциты крысы Н9 с2 и нейроны крысы PC12. Клетки Н9 с2 культивировали в среде DMEM, содержащей эмбриональную сыворотку крови теленка (10%), L-глутамин и антибиотики, при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Клетки РС12 культивировали в среде DMEM, содержащей эмбриональную сыворотку крови теленка (5%) и сыворотку крови лошади (5%), L-глутамин и антибиотики, при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Для анализа активности ПАРП клетки Н9 с2 или PC12 высевали в пластиковые 24-луночные планшеты, инкубировали в среде с тестируемым ингибитором в течение 1 ч, после чего вносили H₂O₂ (1 мМ) и через 10 мин фиксировали метанолом. Иммунофлуоресцентное окрашивание поли(ADP-рибозы) с использованием моноклональных антител 10-Н и вторичных антител (конъюгированных с Alexa-488), а также окрашивание ядер Хекстом 33258 проводили согласно стандартным протоколам. Интенсивность флуоресценции анализировали с помощью ридера CLARIOstar Plus (BMG Labtech). Для флуоресцентной микроскопии клеток в выборочных лунках использовали LSM 900 (Carl Zeiss).

Методика Б. Исследование влияния ингибитора на дифференцировку и жизнеспособность клеток. Для стимуляции дифференцировки Н9 с2 в сердечные миоциты, клетки культивировали при пониженной концентрации сыворотки (1%) в присутствии ретиноевой кислоты. Для анализа плотности клеточных культур применяли микроскоп LionHeart FX (Biotek), для флуоресцентного анализа неповрежденных клеток и клеток с признаками апоптоза и некроза использовали LSM 900. Анализ уровней маркерных белков дифференцировки (сердечного и скелетно-мышечного тропонина Т) проводили с использованием первичных антител, коньюгированных с Alexa-555, и последующего микрофлуоресцентного анализа на конфокальном микроскопе LSM 900.

Методика В. Исследование цитопротекторного действия. Использовали кардиомиоциты крысы Н9 с2, которые высевали в 24-луночные планшеты, инкубировали течение 1 ч в среде, содержащей тестируемый ингибитор в концентрации 300 мкМ, после чего вносили H₂O₂ (1 мМ) и оставляли на 1 ч. Затем клетки промывали средой без H₂O₂ и инкубировали в среде, используемой для культивирования, еще в течение 24 ч. Число живых и мертвых клеток в культуре на единицу площади поверхности оценивали прижизненно с использованием микроскопа LionHeart FX (Biotek). Для этого клетки предварительно окрашивали флуоресцентными красителями Кальцеином AM, Этидиум гомодимером-III и Хекстом 33258.

Методика Г. Исследование антипролиферативной активности в отношении опухолевых клеток. Тестирование проводили на линиях клеток рака толстой кишки (Caco-2) и лейкоза (THP-1) с использованием резазурина. Клетки высевали в 96-луночный планшет и инкубировали в культуральной среде при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение 24 ч. Для клеток Caco-2 использовали среду DMEM, для клеток THP-1 - среду RPMI-1640. Затем вносили ингибитор, через 72 ч добавляли резазурин в концентрации 0,2 мг/мл. После 3 ч инкубации с резазурином среду отбирали и оценивали флуоресценцию (560 нм/590 нм) на Fluoroskan FL (Thermo Fisher), интенсивность которой соответствовала выживаемости клеток. Для тестирования комбинации с цисплатином или доксорубицином цитостатический препарат добавляли через 3 ч после обработки ингибитором и спустя 72 ч клетки обрабатывали резазурином.

Пример 1. Эффективность ингибирования ПАРП соединением I в клетках была определена на культуре Н9 с2 (клеточная модель кардиомиоцитов) по методике А, см. фиг. 1. Значение IC₅₀ составило 55 мкМ, что значительно превосходит показатели ближайшего аналога 7-метилгуанина (IC₅₀=270 мкМ). Данный пример свидетельствует о способности предложенного ингибитора эффективно подавлять активность ПАРП в клетках.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в качестве тестируемого объекта использовали линию РС12 (клеточная модель нейронов), см. фиг. 2. Значение IC₅₀ для соединения I составило 60 мкМ. В концентрации 300 мкМ соединение I полностью подавляло активность ПАРП, тогда как его ближайший аналог 7-метилгуанин - лишь частично. Данный пример свидетельствует о способности предложенного ингибитора эффективно подавлять активность ПАРП в клетках нейронального типа.

Пример 3. Анализ уровней маркерных белков по методике Б показал, что соединение I в концентрации 300 мкМ не влияет на дифференцировку клеток Н9 с2 в присутствии ретиноевой кислоты. Инкубация клеток с соединением I не приводила к снижению плотности клеточной культуры и накоплению в культуре мертвых клеток. Данный пример свидетельствует об отсутствии цитотоксических побочных эффектов у предложенного ингибитора.

Пример 4. Исследование цитопротекторного действия соединения I по методике В (моделирование сильного окислительного стресса), показало увеличение выживаемости клеток Н9 с2 более чем в 4 раза при добавлении ингибитора, см. Таблицу 1. Также продемонстрировано усиление действия по сравнению с референсным ингибитором 7-метилгуанином. Данный пример свидетельствует о способности предложенного ингибитора защищать клетки в стрессовых условиях.

Таблица 1. Влияние соединения I, а также референсного ингибитора 7-метилгуанина на выживаемость клеток Н9 с2 в условиях сильного окислительного стресса.

% выживших клеток Контроль 100±3,3 H₂O₂ (окислительный стресс) 4,2±1,5 H₂O₂₊соединение I 18,2±2,7 H₂O₂₊7-метилгуанин 12,0±1,9

Пример 5. Результаты тестирования антипролиферативной активности соединения I в отношении опухолевых клеток человека (Caco-2 и THP-1), проведенного по методике Г, приведены на фиг.3. Данный пример свидетельствует о способности предложенного ингибитора снижать выживаемость опухолевых клеток.

Пример 6. Результаты исследования способности соединения I повышать чувствительность опухолевых клеток к химиопрепаратам цисплатин и доксорубицин, проведенного по методике Г, приведены в таблице 2. Данный пример свидетельствует о возможности использования предложенного ингибитора в комбинации с известными химиопрепаратами.

Таблица 2. Чувствительность клеток рака толстой кишки (Caco-2) и лейкоза (THP-1) к химиопрепаратам цисплатин, доксорубицин, а также их комбинациям с соединением I (300 мкМ) и референсным ингибитором 7-метилгуанином (300 мкМ). CC₅₀ - концентрация химиопрепарата, вызывающая гибель 50% клеток.

Клеточная линия CC₅₀, мкМ Цисплатин Цисплатин + соединение I Цисплатин + 7-метилгуанин Доксорубицин Доксорубицин+ соединение I Доксорубицин + 7-метилгуанин Caco-2 1,74±0,23 0,69±0,10 1,70±0,17 0,46±0,02 0,12±0,02 0,18±0,01 THP-1 3,87±0,36 1,66±0,16 2,05±0,25 2,28±0,37 0,74±0,34 1,03±0,17

Представленные примеры демонстрируют, что испытанное соединение I способно подавлять активность ПАРП в клетках в микромолярном диапазоне концентраций, обладает цитопротекторным действием на клетки с нормальным фенотипом, а также может быть использовано для подавления пролиферации опухолевых клеток. Сходные результаты были получены при применении соединения I в форме гидрохлорида, что подтверждает возможность его применения в виде фармацевтически приемлемой соли.

Изобретение относится к применению производного гуанина формулы (I) и его фармацевтически приемлемых солей в качестве ингибиторов поли(ADP-рибозо)полимеразы человека. Технический результат – эффективное ингибирование активности ПАРП, способное оказывать цитопротекторное действие и подавлять пролиферацию опухолевых клеток. 3 ил., 2 табл., 6 пр.

Применение производного гуанина формулы (I)

и его фармацевтически приемлемых солей в качестве ингибиторов поли(ADP-рибозо)полимеразы человека.