СРЕДСТВО ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТА ПОЛИ(АДФ-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/52 A61P43/00 

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии, конкретно к средству для ингибирования фермента поли(АДФ-рибозо)полимеразы (ПАРП) человека.

ПАРП является эукариотическим ферментом регуляции репарации ДНК. После активации ПАРП в результате связывания с разрывом цепи ДНК происходит автомодификация и модификация других ядерных белков посредством присоединения АДФ-рибозы с дальнейшим наращиванием полимера, что в свою очередь служит сигналом для активации клеточных систем репарации. Представители семейства ПАРП, прежде всего изоформа ПАРП-1, являются перспективной терапевтической мишенью в онкологии, поскольку функционирование системы репарации обуславливает устойчивость раковых клеток к химио- и радиотерапии. Селективное воздействие, направленное на ингибирование ПАРП, может быть использовано в качестве сопровождающего лечения [Jagtap, P., and Szabo, С.Poly(ADP-ribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors. (2005) Nat. Rev. Drug Discov., 4, 421-440]. Помимо терапии онкозаболеваний, ингибиторы ПАРП могут применяться также при лечении патофизиологических состояний, вызванных некротической гибелью клеток, таких как инсульт, миокардиальная ишемия, диабет и его осложнения, шок, нейротравмы, артриты, колиты, аллергические энцефаломиелиты и другие формы воспаления [Virag, L., and Szabo, С.The therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. (2002) Pharmacol. Rev., 54, 375-429].

Множество соединений ингибируют активность ПАРП in vitro и in vivo в миллимолярном-микромолярном диапазоне [Banasik, M., and Ueda, К. Inhibitors and activators of ADP-ribosylation reactions. (1994) Mol. Cell. Biochem., 138, 185-197; Milam, K.M., and Cleaver, J.E. Inhibitors of poly(adenosine diphosphate-ribose) synthesis: effect on other metabolic processes. (1984) Science, 223, 589-591]. Тем не менее, известные ингибиторы либо недостаточно активны и специфичны для терапевтического использования, либо не изучены на предмет фармакокинетики, фармакодинамики и токсичности. Таким образом, на данный момент по-прежнему актуальна разработка широкого спектра активных соединений.

Ближайшим к заявляемому средству для ингибирования ПАРП, прототипом, является природное соединение, метаболит кофеина - 7-метилксантин [Geraets, L., Moonen, H.J., Wouters, E.F., Bast, A., and Hageman, G.J. Caffeine metabolites are inhibitors of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose)polymerase-l at physiological concentrations. (2006) Biochem. PharmacoL, 72, 902-910]. Недостаткам прототипа является невысокая ингибирующая активность в отношении ПАРП (IС₅₀ 172 мкМ в случае ПАРП-1).

Технической задачей изобретения является создание более эффективного ингибитора ПАРП на основе природных пуринов. Технический результат заключается в снижении значения IC₅₀ (концентрация ингибитора, при которой активность фермента снижена на 50%) при использовании созданного ингибитора по сравнению с прототипом.

Поставленная техническая задача решается тем, что в качестве средства для ингибирования ПАРП предлагается использовать производное пурина формулы (I), представляющее собой 7-метилгуанин (2 - амино - 7 - метил - 1H - пурин - 6(7H)-он).

Предлагаемое соединение получают описанным в литературе способом [Jones, J.W., and Robins, R.K. Purine Nucleosides. III. Methylation Studies of Certain Naturally Occurring Purine Nucleosides. (1963) J. Am. Chem. Soc., 85, 1963], заключающимся в метилировании гуанозина диметилсульфатом с последующим гидролизом N-гликозидной связи. Структура и чистота полученного соединения подтверждалась данными ЯМР-спектроскопии. Ниже приведены примеры реализации заявляемого технического решения.

Изобретение поясняется фиг.1, на которой представлен график зависимости скорости реакции поли(АДФ-рибозил)ирования от концентрации ингибитора, демонстрирующий ингибирующую активность 7-метилгуанина в отношении ПАРП по Примеру 1.

Пример 1. Исследование влияния 7-метилгуанина на активность ПАРП-1

Рекомбинантный белок ПАРП-1 человека (КФ 2.4.2.30) был получен описанным в литературе способом [Суханова М.В., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Поли(АДФ-рибоза)полимераза 1 ингибирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый ДНК полимеразой Р. (2004) Биохимия, 69, 686-698]. Реакцию поли(АДФ-рибозил)ирования проводили в следующих условиях: 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 20 мМ MgCl₂, 150 мМ NaCl, 7 мМ β-меркаптоэтанол, активированная ДНК (2 о.е.₂₈₀/мл, степень активации 25%), 0.6 мМ [³H]NAD⁺ (изотопное разбавление 1:500), температура 37°С. Реакцию запускали добавлением ПАРП-1 до конечной концентрации 200 нМ и останавливали через 60 с, нанося реакционную смесь на бумажные фильтры (Whatman-1), пропитанные 5%-ным раствором ТХУ. Фильтры отмывали 4 раза в 5%-ной ТХУ, затем в 90%-ном этаноле (для удаления ТХУ) и сушили на воздухе. Количество радиоактивной метки, включенной в кислотонерастворимый продукт, регистрировали на сцинтилляционном счетчике QuantaSmart. Определение количества радиоактивно-меченого продукта проводили на начальном участке зависимости скорости реакции от времени. Активность 7-метилгуанина как ингибитора ПАРП-1 оценивали в реакции автополи(АДФ-рибозил)ирования при концентрация NAD⁺, равной 0.6 мМ. Концентрацию ингибитора варьировали в пределах от 1 до 100 мкМ. Реакцию и детекцию продуктов проводили, как описано выше. На фиг.1 приведена типичная кривая зависимости скорости реакции автополи(АДФ-рибозил)ирования (в условных единицах, пропорциональных количеству распадов в радиоактивно-меченом продукте в минуту) от концентрации 7-метилгуанина. Значение IC₅₀ для 7 - метилгуанина составило 30 мкМ.

Пример 2. Исследование влияния 7-метилгуанина на активность ПАРП-2

Измерение ингибирующей активности 7-метилгуанина в отношении ПАРП-2 проводили, как описано в Примере 1. Концентрацию ингибитора варьировали в пределах от 1 до 100 мкМ. Значение IС₅₀ для 7-метилгуанина составило 50 мкМ.

Таким образом, 7-метилгуанин проявляет ингибирующую активность в отношении ПАРП-1 - самого важного с терапевтической точки зрения представителя семейства ПАРП. Значение IС₅₀ (концентрация ингибитора, при которой активность фермента снижена на 50%) в случае ПАРП-1 составляет 30 мкМ, что в 6 раз меньше, чем для прототипа. Кроме того, 7-метилгуанин ингибирует ПАРП-2 - наиболее близкую к ПАРП-1 изоформу. Необходимо отметить, что 7-метилгуанин является метаболитом нуклеиновых кислот и обнаруживается в биологических жидкостях человека [Chao, M.R., Wang, C.J., Yang, H.H., Chang, L.W., and Hu, C.W. Rapid and sensitive quantification of urinary N7-methylguanine by isotope-dilution liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry with on-line solid-phase extraction. (2005) Rapid Commun. Mass Spectrom., 19, 2427-2432], а, следовательно, не должен обладать токсическим эффектом. Предлагаемое соединение, 7-метилгуанин, может быть использовано для создания лекарственных препаратов, применимых в клинической медицине, поскольку является более эффективным ингибитором ПАРП, чем прототип, и, как естественный метаболит, не токсично для организма человека.

Предложено средство для ингибирования фермента поли(АДФ-рибозо)полимеразы (ПАРП) человека. Средство представляет собой 7-метилгуанин (2 - амино - 7 - метил - 1H - пурин - 6(7H)-он) - производное пурина формулы (I). Показано, что эффективность средства выше, чем у 7-метил-ксантина, при этом оно не токсично для организма человека. Средство может применяться при лечении состояний, вызванных некротической гибелью клеток: инсульта, ишемии миокарда, диабета и его осложнений, шока, нейротравмы, артрита, колита, аллергического энцефаломиелита и других форм воспаления. 1 ил., 2 пр.

Средство для ингибирования фермента поли(АДФ-рибозо)полимеразы человека, представляющее собой производное пурина формулы (I)