N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-амин, обладающий цитотоксическим действием Российский патент 2024 года по МПК C07D403/14 A61K31/53 A61P35/00 

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-амину, который является производным 1,3,5-триазина и обладает цитотоксическим действием. Указанное свойство определяет возможность использования соединения в медицине и, в частности, в онкологии.

В настоящее время в онкологической практике используются препараты, относящиеся по механизму действия к десяти группам:

1. Алкилирующие противоопухолевые препараты.

1.1. Аналоги азотистого иприта: циклофосфамид, хлорамбуцил, мелфалан, хлорметин, фосфамид, трофосфамид, преднимустин, бендамустин.

1.2. Алкилсульфонаты: бусульфан, треосульфан, манно- сульфан.

1.3. Этилденимины: тиотепа, триазихон, карбохон.

1.4. Производные нитрозомочевины: кармустин, ломустин, семустин, стрептозоцин, фотемустин, нимустин, ранимустин.

1.5. Эпоксиды: этоглюцид.

1.6. Триазины: прокарбазин, темозоломид, дакарбазин.

1.7. Комплексные соединения платины: карбоплатин, оксалиплатин, цисплатин.

2. Антиметаболиты.

2.1. Аналоги фолиевой кислоты: метотрексат, ралтитрексид, пеметрексед, пралатрексат.

2.2. Аналоги пурина: меркаптопурин, тиогуанин, кладрибин, флударабин, клофарабин.

2.3. Аналоги пиримидина: цитарабин, фторурацил, тега- фур, кармофур, гемцитабин, капецитабин, азацитидин, децитабин.

3. Алкалоиды растительного происхождения.

3.1. Алкалоиды борвинка и его аналоги: винбластин, винкристин, виндезин, винорельбин, винфлуинин.

3.2. Производные подофиллотоксина (ингибиторы топоизомеразы): этопозид, тенипозид.

3.3. Производные колхицина: демеколцин.

3.4. Таксоиды: паклитаксел, доцетаксел, кабазитаксел.

3.5. Другие препараты естественного происхождения: трабектедин.

4. Противоопухололевые антибиотики.

4.1. Актиномицины: актиномицин.

4.2. Антрациклины: доксорубицин, даунорубицин, эпиру- бицин, алкарубицин, зорубицин, идарубицин, митоксантрон, пирарубицин, валрубицин.

4.3. Прочие антибиотики: блеомицин, пликамицин, мито- мицин, ксабепилон.

5. Другие противоопухолевые препараты.

5.1. Моноклональные антитела: эдреколомаб, ритуксимаб, трастузумаб, алемтузумаб, гембузумаб, цетуксимаб, бева- цизумаб, панитумумаб, катумаксомаб, офатумумаб, ипилимумаб, брентуксимаб, пертузумаб, трастузумаб, обинутузумаб, ниволумаб, пембролизумаб, блинатумомаб, рамуцирумаб, нецитумумаб.

5.2. Препараты фотодинамической и радиационной терапии: метиламинолевулинат, аминолевулиновая кислота, темопрофин, эфапроксирал.

5.3. Ингибиторы протеинкиназы, тирозинкиназы: имати- ниб, гефитиниб, элротиниб, сунитиниб, сорафениб, дазатиниб, лапатиниб, нилотиниб, темсиролимус, эверолимус, пазопаниб, вандетаниб, афатиниб, бозутиниб, вемурафе- ниб, кризотиниб, акситиниб, руксолитиниб, радафорулимус, регарофениб, маситиниб, дабрафениб, понатиниб, траметиниб, ленватиниб, нинтеданиб, цедираниб, палбо- циклиб, тивозаниб, кобиметиниб.

6. Гормоны и их производные.

6.1. Эстрогены: диэтилстилбэстрол, полиэстрадиола фосфат, этинилэстрадиол, фосфэстрол.

6.2. Прогестагены: мегестрол, медроксипрогестерон.

6.3. Аналоги рилизинг гормона: бусерелин, лейпрорелин, гозерелин, трипторелин.

7. Антагонисты гормонов и их аналоги.

7.1. Антиэстрогены:тамоксифен, торемифен, фулвестрант.

7.2. Антиандрогены: флутамид, нилутамид, бикалутамид, энзалутамид.

7.3. Прочие антагонисты гормонов и подобные пре параты:аминоглутетимид, форместан, анэстрозол, летрозол, ворозол, экземестан, абареликс, дегареликс, абиратерон.

8. Иммуностимуляторы.

8.1. Колиниестимулирующие факторы: Филграстим, Мол- грамостим, Сарграмостим, Ленограстим, Анцестим, Пегфилграстим, Липегфилграстим.

8.2. Интерфероны: Интерферон альфа, Интерферон бета, Интерферон гамма, пегинтерферон альфа.

8.3. Интерлейкины: алдеслейкин, опревлейкин.

8.4. Прочие иммуностимуляторы: вакцина для лечения рака мочевого пузыря БЦЖ, лентинан, рохинимекс, пидотимод, тимопентин, иммуноцианин, тазонермин, мифамуртид, гла- тирамера ацетат, плериксафор, криданимод.

9. Иммунодепрессанты.

9.1. Селективные иммунодепрессанты: мирономаб, мико- феноловая кислота, сиролимус, лефлуномид, алефацепт, эверолимус, гусперимус, эфализумаб, абетимус, натализумаб, абатацепт, экулизумаб, белимумаб, финголимод, белатацепт, тофацитиниб, терифлуномид, апремиласт, бегеломаб.

9.2. Ингибиторы фактора некроза опухолей альфа: этанероцепт, инфликсимаб, афелимомаб, адалимумаб, цертолизумаб пегол, голимумаб.

9.3. Ингибиторы интерлейкина: даклизумаб, базиликси- маб, анакинра, рилонацепт, устекинумаб, меполизумаб, тоцилизумаб, канакимумаб, бродалумаб.

9.4. Ингибиторы кальциневрина: циклоспорин, такролимус.

9.5. Прочие иммунодепрессанты: азатиоприн, талидомид, метотрексат, леналидомид, помалидомид, преднизолон.

10. Радиотерапетические противоопухолевые препараты.

10.1 Препараты для паллиативного лечения костных метастазов: стронций-89 хлорид, самария - 153 лексидронам, рения-186 этидроновая кислота.

10.2 Прочие лечебные радиофармацевтические препараты: йод-131, иттрий-90, радия хлорид - 223.

Азотсодержащие гетероциклические соединения являются перспективными объектами медицинской химии. Цитостатики на их основе могут взаимодействовать с различными биологическими мишенями опухолевых клеток (ДНК, ферменты, компоненты мембран) (Sharma V., Gupta M., Kumar P., Sharma A. A Comprehensive Review on Fused Heterocyclic as DNA Intercalators: Promising Anticancer Agents // Current Pharmaceutical Design. - 2021. - Vol. 27. - P. 15-42. DOI: 10.2174/1381612826666201118113311; Hosseinzadeh Z., Ramazani A., Razzaghi-Asl N. Anti-cancer Nitrogen-Containing Heterocyclic Compounds // Current Organic Chemistry. - 2018. - Vol. 22. - P. 2256-2279. DOI: 10.2174/1385272822666181008142138; Singh M., Sharma P., Singh P.K., Singh T.G., Saini B. Medicinal Potential of Heterocyclic Compounds from Diverse Natural Sources for the Management of Cancer // Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. - 2020. - Vol. 20 - P. 942-957. DOI: 10.2174/1389557520666200212104742; Peerzada M.N., Hame E., Bai R., et al. Deciphering the key heterocyclic scaffolds in targeting microtubules, kinases and carbonic anhydrases for cancer drug development // Pharmacology & Therapeutics. - 2021. - Vol. 225. - P. 107860. DOI: 10.1016/j.pharmthera.2021.107860; Kharb R. Updates on Receptors Targeted by Heterocyclic Scaffolds: New Horizon in Anticancer Drug Development // Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. - 2021. - Vol. 21, - № 11. - P. 1338-1349. DOI: 10.2174/1871520620666200619181102; Martins P., Jesus J., Santos S., Raposo L.R., Roma C. Heterocyclic Anticancer Compounds: Recent Advances and the Paradigm Shift towards the Use of Nanomedicine’s Tool Box // Molecules. - 2015. - Vol. 20, - № 9. - P. 16852-16891. DOI: 10.3390/molecules200916852).

В ряду полиазотистых гетероциклов замещенные 1,3,5-триазины имеют большой потенциал для получения высокоэффективных противоопухолевых средств, действующих по различным механизмам (Cascioferro S., Parrino B., Spanò V., Carbone A., Montalbano A., Barraja P., Diana P., Cirrincione G.1,3,5-Triazines: A promising scaffold for anticancer drugs development // European Journal of Medicinal Chemistry. - 2017. - Vol. 142. - P. 523-549. DOI: 10.1016/j.ejmech.2017.09.035). Модификация структуры 1,3,5-триазина посредством введения новых заместителей позволяет получать соединения со значительной ингибирующей активностью в отношении таких процессов, как пролиферация клеток. В некоторых случаях производные 1,3,5-триазина вызывают апоптоз клеток. Известны производные 1,3,5-триазина, ингибирующие действие ферментов (топоизомераз, киназ, дигидрофолат-редуктаз), играющих ключевую роль в регуляции пролиферации клеток (Maliszewski D., Drozdowska D. Recent Advances in the Biological Activity of s-Triazine Core Compounds // Pharmaceuticals. - 2022. - Vol. 15. - P. 221. DOI: 10.3390/ph15020221).

Некоторые 2,4,6-замещенные 1,3,5-триазины проявляют цитотоксический эффект, действуя на молекулы ДНК опухолевых клеток как алкилирующие агенты. Например, N²,N²,N⁴,N⁴,N⁶,N⁶-гексаметил-1,3,5-триазин-2,4,6-триамин (альтретамин, гексален) в 1990 г. был одобрен FDA для лечения рефрактерного рака яичников (Dai Q., Sun Q., Ouyang X., Liu J., Jin L., Liu A., He B., Fan T., Jiang Y. Antitumor Activity of s-Triazine Derivatives: A Systematic Review // Molecules. - 2023. - Vol. 28. - P. 4278. DOI:10.3390/molecules28114278). Выраженное цитотоксическое действие отмечено для 2,4,6-замещенных 1,3,5-триазинов, содержащих в качестве заместителей азиридиновые циклы. Данные соединения относятся к классу этилениминов и действуют как алкилирующие агенты. В 1950-х гг. 2,4,6-три(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин (третамин, триэтиленмеламин, ТЕМ) использовался для адъювантной химиотерапии (Wong J. R., Morton L. M., Tucker M. A., Abramson D. H., Seddon J. M., Sampson J. N., Kleinerman R. A. Risk of Subsequent Malignant Neoplasms in Long-Term Hereditary Retinoblastoma Survivors After Chemotherapy and Radiotherapy // Journal of Clinical Oncology. - 2014. - Vol. 32, № 29. - P. 3284-3290. DOI: 10.1200/JCO.2013.54.7844).

В 1996 г. в России был получен [5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил]метанол, проявляющий противоопухолевое действие in vivo и in vitro в отношении глиобластомы (Bespalov V. G., Kireeva G. S., Belyaeva O. A., Senchik K. Y., Stukov A. N., Maydin M. A., Semenov A. L., Gafton G. I., Guseynov K. D., Belyaev A. M. Experimental Study of Antitumour Activity and Effects on Leukocyte Count of Intraperitoneal Administration and Hyperthermic Intraperitoneal Chemoperfusion (HIPEC) with Dioxadet in a Rat Model of Ovarian Cancer // Journal of Chemotherapy. - 2016. - Vol. 28, № 3. P. 203-209. DOI: 10.1179/1973947815Y.0000000040; Voeikov R., Abakumova T., Grinenko N., Melnikov P., Bespalov V., Stukov A., Chekhonin V., Klyachko N., Nukolova N. Dioxadet-loaded nanogels as a potential formulation for glioblastoma treatment // Journal of Pharmaceutical Investigation. - 2017. - Vol. 47, - № 1. - P. 75-83). Это вещество было применено для лечения нескольких десятков больных в период до 2000 г., когда не требовалось разрешение регулятора на проведение пилотных клинических исследований. Однако ввиду отсутствия систематических данных по доклиническим исследованиям и последующим многоцентровым испытаниям, данное соединение так и не было зарегистрировано в качестве лекарственного препарата, и в настоящее время используется только для экспериментов (M.L. Gershanovich, V.A. Filov, D.G. Kotova, A.N. Stukov, I.N. Sokolov, B.A. Ivin, Multicenter clinical trial of the antitumor drug Dioxadet (phase II) // Vopr. Onkol. - 1998. - Vol. 44. - P. 216-220). (патент RU 2065734 С1, опубл. 20 августа 1996 г., A.E. Borisov, M.L. Gershanovich, V.P. Zemlianoĭ, S.L. Nepomniashchaia, A.N. Stukov, V.A. Filov, The use of dioxadet in chemoembolization of the hepatic artery in primary and metastatic cancer of the liver // Vopr. Onkol. - 1998. - Vol. 44. - P. 714-717; A.M. Granov, A.I. Gorelov, M.L. Gershanovich, M.I. Karelin, A. V Vorob’ev, V.A. Filov, A.N. Stukov, Results of endovascular interventions (embolization and chemoembolization) in the treatment of operable and extensive kidney cancer // Vopr. Onkol. 1998. - Vol. 44. - P. 711-714). Стоит отметить, что полученные ранее экспериментальные и клинические данные по [5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил]метанолу свидетельствуют о его выраженной токсичности, связанной с миелосупрессией. В связи с этим, актуальной проблемой является получение соединений с достаточно высокой противоопухолевой активностью, но с менее выраженными токсическими эффектами. Кроме того, в настоящее время приоритетным направлением является разработка методов адресной доставки цитостатиков к биологическим мишеням опухолевых клеток.

В 2023 г. нами был описан метил 6-((4-(азиридин-1ил)-6-хлоро-1,3,5-триазин-2-ил)амино)гексаноат, который проявил цитотоксическое действие в отношении клеточных линий аденокарциномы альвеолярного базального эпителия человека А549 и карциномы поджелудочной железы PANC-1, значительно более выраженное по сравнению с референсными соединениями [5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил]метанолом и цисплатином. Для метил 6-((4-(азиридин-1ил)-6-хлоро-1,3,5-триазин-2-ил)амино)гексаноата, [5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил]метанола и цисплатина величина IC₅₀ составила 12.4 мкМ, 13.9 мкМ и 19.0 мкМ соответственно для клеточной линии A549; величина IC₅₀ составила 3.1 мкМ, 4.1 мкМ и 14.6 мкМ соответственно для клеточной линии PANC-1 (Патент № 2791798, зарегистрирован 13.03.2023, заявка 2022135121 от 29.12.2022 Метил 6-[(4-(азиридин-1-ил)-6-хлоро-1,3,5-триазин-2-ил)амино]гексаноат, обладающий цитотоксическим действием Авторы: Молчанов О.Е., Семенов К.Н., Шаройко В.В., Попова Е.А., Протас А.В., Миколайчук О.В., Попова А.А., Майстренко Д.Н.).

В результате проведенного исследования острой токсичности на крысах-самках породы Вистар было установлено, что метил 6-[(4-(азиридин-1-ил)-6-хлоро-1,3,5-триазин-2-ил)амино]гексаноат, превосходит препараты сравнения ([5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил]метанол и цисплатин-тэва) по показателям максимально переносимой дозы (МПД), и ЛД₅₀ (средняя доза вещества, вызывающая гибель животных испытуемой группы). Кроме того, в структуре 6-[(4-(азиридин-1-ил)-6-хлоро-1,3,5-триазин-2-ил)амино]гексаноата есть фрагмент метилового эфира 6-аминогексановой кислоты, который после гидролиза до карбоксильной группы может быть использован для ковалентной связи с молекулами адресной доставки к компонентам опухоли (антитела, альтернативные каркасные белки).

Таким образом, одной из актуальных задач медицинской химии является молекулярный дизайн и синтез алкилирующих агентов на основе 1,3,5-триазинов с азиридиновыми циклами в качестве заместителей, проявляющих высокую противоопухолевую активность, но меньшую токсичность в сравнении с известными противоопухолевыми лекарственными препаратами. Эффективная стратегия успешной лекарственной терапии основана на создании соединений с высокой селективностью в отношении опухолевых клеток по сравнению с нормальными клетками. В связи с этим, новые высокоэффективные вещества должны содержать в молекуле важное структурное звено, позволяющее осуществлять связь цитостатика с молекулами адресной доставки.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание нового малотоксичного химического соединения, обладающего выраженным цитотоксическим действием, которое может быть использовано в качестве активного компонента при создании противоопухолевых лекарственных препаратов.

Этот результат достигается тем, что создано новое химическое соединение, а именно, N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-амином формулы (I), обладающее выраженным цитотоксическим действием по отношению к опухолевым клеточным линиям человека.

Нами было создано новое малотоксичное химическое соединение, обладающее выраженным цитотоксическим действием по отношению к опухолевым клеточным линиям человека, которое может быть использовано в качестве активного компонента при создании противоопухолевых лекарственных препаратов - N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-амин (I).

Заявленное изобретение - N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-амин формулы (I) является производным шестичленного азотсодержащего гетероцикла - 1,3,5-триазина. Соединение (I) содержит в качестве заместителей группу 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этан-1-амина - во втором положении гетерокольца, азиридиновые циклы - в четвертом и шестом положении гетероцикла. Цитотоксическое действие соединения обусловлено наличием в молекуле вещества (I) двух азиридиновых циклов и относится к алкилирующим агентам класса этилениминов. Структурное звено 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этан-1-амина в соединении (I) было введено в молекулу 1,3,5-триазина в качестве линкерной группы. Данный линкер, содержащий этокси-группы, был выбран для повышения гидрофильности целевого соединения, что способствует лучшей растворимости цитостатика в водных средах и снижению вероятности захвата его макрофагами. Линкер также содержит азидную группу, которая может быть использована для связывания с функционализированным моноклональным антителом посредством клик-реакции с алкиновым фрагментом, предварительно введенным в моноклональное антитело. Кроме того, небольшой размер линкера не будет способствовать накоплению конъюгата в печени.

Синтез заявленного соединения (I) проводился по стандартным методикам, ранее описанным в литературе. В качестве прекурсора для получения соединения (I) использовался 2,4,6-трихлоро-1,3,5-триазин. В 2-, 4- и 6-положения 1,3,5-триазинового цикла можно вводить разнообразные заместители посредством реакций нуклеофильного замещения атомов хлора 2,4,6-трихлоро-1,3,5-триазина. Введение заместителей в 1,3,5-триазиновый цикл можно осуществлять последовательно, варьируя температурный режим реакции (Blotny G. Recent applications of 2,4,6-trichloro-1,3,5-triazine and its derivatives in organic synthesis // Tetrahedron. - 2006. - Vol. 62, № 41. - P. 9507-9522. DOI: 10.1016/j.tet.2006.07.039). Введение азиридиновых циклов в 1,3,5-триазиновое кольцо можно проводить, действуя азиридином на хлорзамещенные 1,3,5-триазины (patent 2,653,934 patented 29 Sept. 1953 (US); patent 2,520,619 patented 29 Aug. 1950 (US)).

Способ получения N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-амина (I) заключается во взаимодействии 2,4,6-трихлоро-1,3,5-триазина с 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этан-1-амином в смеси хлороформ-метанол в соотношении 9:1 с получением промежуточного продукта N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-дихлоро-1,3,5-триазин-2-амина формулы (II). Соединение (II) после выделения и очистки методом колоночной хроматографии вводили в реакцию с азиридином в гетерофазной системе хлороформ-вода для получения заявленного N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-амина (I). Очистку соединения (I) осуществляли методом колоночной хроматографии.

Синтез проводится в соответствии со схемой:

Приводим варианты синтеза предлагаемого соединения и пример исследования цитотоксичности и острой токсичности.

Методика синтеза N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-дихлоро-1,3,5-триазин-2-амина (II). К раствору 2 г (10.8 ммоль) 2,4,6-трихлоро-1,3,5-триазина в смеси хлороформ-метанол (90 мл СHCl₃, 10 мл MeOH) добавляли триэтиламин 1.1 г (10.8 ммоль). К полученному раствору при охлаждении до 0°С по каплям добавляли раствор 1.9 г (10.8 ммоль) 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этан-1-амина и 1.1 г (10.8 ммоль) триэтиламина в 10 мл хлороформа. Реакционную смесь выдерживали при 0-5 °С в течение 2 ч, поддерживая рН 8 добавлением триэтиламина. По окончании времени выдержки реакционную смесь упаривали при пониженном давлении. Продукт выделяли экстракцией в системе хлороформ-вода (5 раз по 50 мл). Органический слой отделяли и сушили над безводным хлоридом кальция. После упаривания хлороформа при пониженном давлении очистку продукта осуществляли методом колоночной хроматографии на силикагеле, используя хлороформ в качестве элюента.

Выход 3.0 г (86%). Вязкая жидкость желтоватого цвета. Спектр ЯМР ¹H (400 MHz, CDCl₃), δ: 6.74 (с, 1H, NH), 3.69 - 3.62 (м, 10H, 5CH₂), 3.48 - 3.38 (м, 2H, CH₂-N₃).Спектр ЯМР ¹³C (101 MHz, CDCl₃), δ: 170.8 (C_{триазин}), 169.9 (C_{триазин}), 165.8 (C_{триазин}), 70.6 (СН₂), 70.4 (СН₂), 70.1 (СН₂), 68.9 (СН₂), 50.6 (-CH₂-N₃), 41.3 (-NH-CH₂). Масс-спектр (ESI⁺), m/z: 322.0588. [M+H]⁺, [C₉H₁₃Cl₂N₇O₂]⁺. Вычислено [M+H]⁺: 322.0508. ИК (см⁻¹): 2868, 2100, 1548, 1490, 1409, 1114, 977, 815.

Синтез N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-амина (I). К раствору 1.5 г (37.3 ммоль) гидроксида натрия и 8.34 г (79.2 ммоль) карбоната натрия в 80 мл воды добавляли 7.65 г (37.3 ммоль) бромэтанамина гидробромида. Реакционную массу перемешивали при 47°С в течение 2 ч. Полученный раствор азиридина добавляли к раствору 3 г (9.32 ммоль) N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-дихлоро-1,3,5-триазин-2-амина (II) в хлороформе (50 мл) и перемешивали при 25°С в течение 16 ч. По окончании времени выдержки отделяли органический слой и упаривали при пониженном давлении. Продукт очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле, элюент - хлороформ-метанол (98:2).

Выход 1.59 г (51%). Бесцветная вязкая жидкость. Спектр ЯМР ¹H (400 MHz, CDCl₃), δ: 5.78 (с, 1H, NH), 3.66 (д, J = 5.2 Hz, 2H, CH₂), 3.62 (д, J = 2.6 Hz, 8H, 4СH₂), 3.43 - 3.37 (м, 2H, CH₂-N₃), 2.31 (д, J = 5.6 Hz, 8H, 4CH₂). Спектр ЯМР ¹³C (101 MHz, CDCl₃), δ: 176.6 (C_{триазин}), 176.1 (C_{триазин}), 167.0 (C_{триазин}), 70.6 (СН₂), 70.4 (СН₂), 70.1 (СН₂), 69.8 (СН₂), 50.6 (СН₂), 40.6 (СН₂), 27.0 (СН₂), 26.8 (СН₂). Масс-спектр (ESI⁺), m/z: 336.1816 [M+H]⁺, [C₁₃H₂₂N₉O₂]⁺. Вычислено [M+H]⁺: 336.1891. ИК (см⁻¹): 2916, 2100, 1647, 1531, 1398, 1110, 829.

Изучение цитотоксичности N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-амина (I) и референсных соединений [5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил]метанола и цисплатина проводили с помощью МТТ-теста (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) на клетках линии HeLa и T98G - согласно методике, опубликованной в работе (Mosmann, Tim. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays (англ.) // Journal of Immunological Methods. - 1983. - Vol. 65, no. 1-2. - P. 55-63.). Клетки культивировали в CO₂-инкубаторе при +37 °С в увлажнённой атмосфере, содержащей воздух и 5% CO₂ в питательной среде DMEM-F12, содержащей 10% термически инактивированной фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина, 50 Ед⋅мл⁻¹ пенициллина и 50 мкг⋅мл⁻¹ стрептомицина.

Для проведения эксперимента клетки высеивали в 96-луночный планшет и инкубировали в течение ночи в CO₂-инкубаторе для прикрепления клеток к поверхности лунок (в каждую лунку вносили 5000 клеток в 200 мкл среды DMEM-F12). Подсчёт числа клеток проводился на анализаторе жизнеспособности клеток Luna II (LogosBio, Южная Корея). После чего в лунки добавляли среду DMEM, содержащую тестируемые соединения. Инкубация клеток в планшетах продолжалась 48 ч в CO₂-инкубаторе при +37°С. По окончании инкубационного периода питательную среду DMEM-F12 удаляли путём инвертирования планшета. Далее в лунки вносили 100 мкл среды DMEM-F12 и 20 мкл МТТ-реагента (5 мг⋅мл^-1) и планшеты с клетками инкубировали в течение 1 ч в CO₂-инкубаторе при +37°С. После удаления надосадочной жидкости кристаллы формазана растворяли в течение 15 мин при перемешивании в 200 мкл/лунку ДМСО и измеряли оптическую плотность на планшетном фотометре Allsheng AMR-100 (Allsheng Instruments Co., Ltd, Китай) при длине волны 540 нм и 690 нм. В результате взаимодействия МТТ с НАД(Ф)Н-зависимыми клеточными оксидоредуктазами образуется окрашенный продукт - формазан, с максимумом поглощения при длине волны 540 нм, содержание которого пропорционально количеству жизнеспособных клеток. Для коррекции фона из значений оптической плотности при 540 нм вычитали значения оптической плотности при 690 нм для соответствующих лунок. Данные нормировали в процентах по отношению к клеткам, инкубированным без тестируемых соединений.

Соединение (I) и [5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил]метанол вызывают выраженное дозозависимое снижение выживаемости клеток линий HeLa и T98G, но подавление роста значительно более выражено у синтезированного нами соединения (I).

Таким образом, N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-амин (I) проявляет цитотоксическое действие в отношении клеточных линий HeLa и T98G, более выраженное по сравнению с референсным ([5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил]метанолом для клеточной линии T98G. Для соединения (I) и [5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил]метанола величина IC₅₀ составила 20.0 мкМ и 11.8 мкМ для клеточной линии HeLa; величина IC₅₀ составила 2.0 и 44.9 мкМ для клеточной линии T98G. Также соединение (I) проявляет значительно более выраженную цитотоксическую активность по сравнению с цисплатином для клеточной линии T98G и сопоставимую цитотоксическую активность для клеточной линии HeLa (таблица 1).

Таблица 1 - Значения IC₅₀ (мкМ) для соединения (I), [5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил]метанола и цисплатина

Вещество Наименование клеточной линии HeLa T98G Соединение (I) 20.0 2.0 ([5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил]метанол 11.8 44.9 Цисплатин 12.88¹ 34.8²

¹Drug: Cisplatin - Cancerrxgene - Genomics of Drug Sensitivity in Cancer, (n.d.). https://www.cancerrxgene.org/compound/Cisplatin/1005/by-tissue?

² M. Beer, N. Kuppalu, M. Stefanini, H. Becker, I. Schulz, S. Manoli, J. Schuette, C. Schmees, A. Casazza, M. Stelzle, A. Arcangeli, A novel microfluidic 3D platform for culturing pancreatic ductal adenocarcinoma cells: comparison with in vitro cultures and in vivo xenografts // Sci. Rep. - 2017. - Vol. 7. - P. 1-12.

Оценка острой токсичности проводилась на крысах-самках породы Вистар с массой тела 200 - 250 грамм, полученных из питомника «Рапполово». Для исследования использовались: исследуемое соединение (I), которое вводилось внутрвенно в виде раствора с интервалом дозы 0,5 мг/кг; коммерческий препарат Цисплатин-Тева с концентрацией 0,5 мг в 1 мл во флаконах по 20 мл, также используемый с интервалом дозы 0,5 мг/кг внутривенно.

В результате проведенного исследования мы выяснили, что синтезированное соединение (I), превосходит препарат сравнения по показателям максимально переносимой дозы ((МПД), максимальная доза, не приводящая к гибели животного по причинам, не связанным с канцерогенностью) и ЛД₅₀ (доза вещества, вызывающая гибель 50% животных испытуемой группы (Таблица 2)).

Таблица 2 - Значения МПД, и ЛД₅₀ для Соединения (I) и Цисплатина - Тева

Исследуемое вещество МПД ЛД₅₀ Cоединение (I) 7 мг/кг 18 мг/кг Цисплатин-Тэва 4 мг/кг 15 мг/кг

Таким образом, полученное соединение при сравнении с референтным соединением обладает улучшенными цитотоксическими свойствами, что показано в ММТ-тесте, а также обладает меньшей системной токсичностью. Кроме того, у этого соединения есть функциональные группы, позволяющие ковалентно связывать его с молекулами адресной доставки к компонентам опухоли (антитела, альтернативные каркасные белки) и создавать современные препараты для лечения онкологических заболеваний.

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-амину, который является производным 1,3,5-триазина и обладает цитотоксическим действием. Технический результат: получено новое соединение, обладающее выраженным цитотоксическим действием, которое может быть использовано в качестве активного компонента при создании противоопухолевых лекарственных препаратов. 2 табл.

N-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-амин формулы (I),

обладающее выраженным цитотоксическим действием по отношению к опухолевым клеткам человека.