СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИФОСАТА, ЕГО МЕТАБОЛИТА И ГЛЮФОСИНАТА В ПРОДУКЦИИ ЖИВОТНОВОДСТВА Российский патент 2022 года по МПК G01N30/06 G01N30/72 G01N30/78 

Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа определения содержания глифосата, аминометилфосфоновой кислоты и глюфосината в биологических тканях животного происхождения и молоке. Сущность способа заключается в извлечении анализируемых соединений из объектов исследования растворами сульфосалициловой кислоты, с последующей очисткой экстрактов на обращеннофазном сорбенте, дериватизацией, жидкостно-жидкостной очисткой дериватов диэтиловым эфиром с удалением органического слоя и концентрированием. Финальную очистку дериватов проводят на сорбенте со слабыми катионнообменными свойствами, с последующим концентрированием досуха и перерастворением в необходимом количестве смеси деионизованной воды и метанола, подкисленной уксусной кислотой. Использование данного способа позволяет с высокой точностью определить содержание глифосата, аминометилфосфоновой кислоты и глюфосината в биологических тканях животного происхождения и молоке.

Глифосат и глюфосинат - представители гербицидов системного действия, применяемые в с/х для борьбы с сорной растительностью, преимущественно при выращивании Генетически модифицированных линий (ГМ-линии) с/х культур. Мировой рынок данных гербицидов огромен. Темпы их производства и применения продолжают наращиваться, благодаря высокой эффективности от их применения. Благодаря межсезонному применению данных гербицидов, возможна обработка не только ГМ-линий, но и классических с/х культур. Препараты на основе глифосата доступны для применения не только крупным агрохолдингам, но и мелким хозяйствам, а так же физическим лицам. В ходе процессов метаболизма, протекающих в тканях обработанных с/х культур, глифосат частично метаболизируется в аминометилфосфоновую кислоту (АМФК). Допускают, что с/х культуры способны накапливать глифосат и передавать его дальше по пищевой цепи, к человеку [1]. В уже собранных соевых бобах содержание глифосата и его основного метаболита - АМФК может составлять от 0,18 до 7,2 мг/кг. В тканях сельскохозяйственных животных, получавших корма ГМ-культур, таких как соя, зарегистрировано от 0,05 до 1,6 мг/кг глифосата. Считается, что высокие концентрации гербицида могут быть обнаружены в субпродуктах сельскохозяйственных животных (почках и печени) [2]. Глифосат отнесен к группе веществ «потенциально канцерогенных для человека» (группа 2А), Международным Агентством по изучению рака, поэтому, целесообразно проводить мониторинг и контроль данного и родственных ему соединений не только в растительном сырье, но и в продукции животноводства [3]. Структуры гербицидов приведены на фиг.1.

В СанПиН 1.2.3685-21 установлен временный максимально допустимый уровень (ВМДУ) для глифосата в импортируемой продукции на уровне: 5,0 мг/кг в субпродуктах млекопитающих; 0,05 мг/кг в молоке, яйцах, мясе птицы и мясе млекопитающих; 0,5 мг/кг в субпродуктах свиных и птицы. Для глюфосината ВМДУ - 0,05 мг/кг в яйцах, мясе млекопитающих, мясе птицы; 0,1 мг/кг в субпродуктах млекопитающих и птицы; 0,02 мг/кг в молоке. Для АМФК, ВМДУ не установлены. В ЕС глифосат контролируется на уровне 0,05 мг/кг в продукции животноводства, за исключением следующих объектов исследований: субпродукты птицы (почки) - 0,1 мг/кг; почки говяжьи - 2,0 мг/кг; печень говяжья - 0,2 мг/кг; почки свиные -0,5 мг/кг. Таким образом, установленные нормы указывают на необходимость контроля глифосата, глюфосината и АМФК.

Описаны способы определения глифосата, глюфосината и АМФК в различных объектах исследования. Так, опубликован подход по определению глифосата и АМФК в продукции животного происхождения методом ионной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием [4]. Авторы определяли гербициды на низком уровне в тканях рыб, говядине, меде. Данный способ нельзя назвать общедоступным т.к., оборудование, на котором проводится хроматографическое разделение и масс-спектрометрическое детектирование, не является рядовым и доступным к приобретению. Так же, в ходе процедуры подготовки образцов не уделяется внимание очистке экстракта от липидов и других компонентов матрицы, мешающих определению.

Описан способ определения остаточных количеств глифосата в животных и человеке [5]. Авторы не охватывают метаболит глифосата и глюфосинат, а анализ проводят скрининговым методом - имуноферментный анализ, а так же применяют газовую хроматографию с химической ионизацией.

Имеется подход, согласно которому, авторы определяли глифосат и его метаболит в молоке, после дериватизации методом ВЭЖХ-МС [6]. При этом дериватизацию анализируемых компонентов проводят без предварительной и последующей очисток на стационарных сорбентах.

Наиболее близкий по назначению, является способ определения глифосата в печени после дериватизации, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектированием (МС/МС) - прототип [7].

Экстракцию глифосата проводят из навески 5 г образца 40 см³ смеси метанол/вода (20/80) в течение 15 минут на шейкере. Экстракт отделяют от осадка центрифугированием и аликвоту 20 см³ переносят в новую емкость для удаления белков 5 см³ дихлорметана, в присутствии 0,02 см³ уксусной кислоты. Емкость с экстрактом встряхивают и слои разделяют центрифугированием. Аликвоту супернатанта (10 см³) переносят в новую емкость с 2.5 см³ дихлорметана для повторной жидкостно-жидкостной экстракции. Вновь полученный супернатант очищают методом твердофазной очистки (ТФО) на сорбенте со слабыми анионо-обменными свойствами (Strata X-AW 33u Polymeric Weak Anion cartridges 500 mg, 6 ml). Очищенный элюат концентрируют досуха в токе азота при нагревании, перерастворяют в деионизованной воде и проводят дериватизацию 9-флуоренилметоксикарбонил хлоридом в среде боратного буфера при комнатной температуре в течение 45 минут. После чего дериватизацию прерывают вводом 2 см³ дихлорметана и центрифугируют полученный раствор. Аликвоту супернатанта используют для анализа методом ВЭЖХ-МС/МС.

1. Недостаток способа-прототипа состоит в том, что извлечение глифосата из объекта исследования проводят метанольным раствором, при его низкой растворимости в таковом [8] и в условиях коэкстракции липидов объекта исследования, а очистка, выполняемая на сорбенте со слабыми анионо-обменными свойствами, приводит к потерям глифосата до момента дериватизации.

2. Недостатком способа-прототипа является применяемый протокол проведения дериватизации: при комнатной температуре в течение 45 минут, который приводит к неполному переводу определяемых соединений в дериваты.

3. Недостатком способа-прототипа является отсутствие очистки полученных дериватов от компонентов боратного буфера и компонентов матрицы после процедуры дериватизации.

4. Недостатком способа-прототипа является отсутствие возможности проведения анализа метаболита глифосата - АМФК и глюфосината.

Настоящее изобретение направлено на устранение недостатков прототипа, а именно на замену вида экстрагента и типа сорбента стадии ТФО, улучшение протокола проведения дериватизации, введение второй стадии ТФО после процедуры дериватизации, предусмотрение возможности анализа АМФК и глюфосината.

Патентуемый способ количественного определения глифосата, его метаболита и глюфосината в продукции животноводства включает: извлечение анализируемых соединений из образца деионизованной водой, подкисленной сульфосалициловой кислотой; стадию ТФО на обращеннофазном сорбенте; дериватизацию и жидкостно-жидкостную экстракцию с последующим концентрированием неорганической части полученной смеси; стадию ТФО на обращеннофазном сорбенте со слабыми катионо-обменными свойствами с последующим концентрированием элюата и нормализацией до 1 см³, перед анализом методом ВЭЖХ-МС/МС.

Способ отличается от прототипа следующими признаками. В качестве экстрагента для глифосата, АМФК и глюфосината, применяют 1% сульфосалициловую кислоту, а процедуру ТФО, предшествующей дериватизации, проводят на картридже с обращеннофазным сорбентом марки Oasis HLB Waters (60 мг, 3 см³), пропусканием 1 см³ экстракта сквозь слой сорбента в пробирку для дериватизации. Дериватизацию проводят при 50°С в течение 20-45 мин, а удаление остатка дериватизирующего агента проводят его переводом в диэтиловый эфир с последующим центрифугированием, удалением и концентрированием неорганической части полученной смеси. Проводят ТФО на обращеннофазном сорбенте со слабыми катионо-обменными свойствами Oasis WCX Waters (60 мг, 3 см³) с дополнительной промывкой 1.5 см³ 5% муравьиной кислоты с 20-30% метанола, с последующим концентрированием элюата и нормализацией до 1 см³ перед анализом методом ВЭЖХ-МС/МС.

Технический результат изобретения - возможность одновременного количественного определения глифосата, АМФК и глюфосината, повышение относительной интенсивности сигнала средства измерения за счет увеличения полноты дериватизации и снижения шумов от применения дополнительного этапа ТФО.

Патентуемый способ позволяет значительно, увеличить извлечение определяемых соединений из объектов исследования относительно прототипа, увеличить аналитический отклик сигнала детектора по глифосату, анализировать совместно с ним метаболит и родственное соединение - глюфосинат, а также получать дериваты, дополнительно очищенные от примесей буфера, из образцов молока, мышечной ткани и тканей субпродуктов.

Рекомендуемые режимы выполнения заявленного способа подобраны в результате экспериментов, проведенных заявителем: исследована зависимость полноты извлечения определяемых соединений и относительной интенсивности сигнала на детекторе масс-спектрометра от типа экстрагента и типа сорбента, применяемого на стадии ТФО; исследована полнота дериватизации в разных условиях ее проведения; исследована зависимость относительной интенсивности сигнала на детекторе масс-спектрометра от применения второй стадии ТФО, введенной после дериватизации.

Перед проведением экспериментов, в гомогенаты мышечной ткани, тканей субпродуктов и молока, вводили эквивалентное количество глифосата, глюфосината и АМФК. Процедура подготовки образцов к анализу, при оценке зависимости полноты извлечения определяемых соединений и относительной интенсивности сигнала на детекторе масс-спектрометра от типа экстрагента и типа сорбента, применяемого на стадии ТФО, соответствовала прототипу. Варьировался тип экстрагента и тип сорбента стадии ТФО. За эталон принимали холостой образец, прошедший процедуру пробоподготовки согласно прототипу с введением в него определяемых компонентов перед дериватизацией, в эквивалентных количествах.

Было установлено, что в результате смены экстрагента и типа сорбента, применяемого на стадии ТФО, увеличивается полнота извлечение компонентов: на 25% из образцов молока, на 19,4% из образцов субпродуктов, на 20% из образцов мышечной ткани. В среднем, на 21%. Зависимость степени извлечения от типа экстрагента и типа сорбента отображена графически на фиг. 2 и табл. 1.

Согласно полученным данным можно заключить, что оптимальным экстрагентом является 1% сульфосалициловая кислота при применении сорбента Oasis HLB Waters (60 мг, 3 см³) на стадии ТФО. Что соответствует опыту №5 (Табл. 1).

Было установлено, что при проведении дериватизации в режиме, отличном от указанного в прототипе, полнота перевода определяемых соединений в дериваты возрастает до 20%. Зависимость полноты дериватизации от температуры проведения реакции и ее длительности отображена графически в табл. 2 и на фиг. 3.

При проведении экспериментов, варьировали, температуру проведения дериватизации и время проведения реакции. Эксперименты проводили на экстрактах гомогенатов мышечной ткани в которые вводили эквивалентное количество глифосата, АМФК, глюфосината перед стадией дериватизации. Схема эксперимента была следующей:

К экстрактам, полученным на стадии ТФО, добавляли растворы стандартов, добавляли боратный буфер и раствор 9-флуоренилметоксикарбонил хлорида, перемешивали и оставляли при разной температуре и времени для проведения дериватизации. Дериватизацию прерывали введением дихлорметана, центрифугировали полученные растворы и использовали аликвоту супернатанта для анализа методом ВЭЖХ-МС/МС.

Согласно полученным данным, можно заключить, что оптимальным протоколом дериватизации, является ее проведение в течение 20-45 минут при температуре 50°С, что соответствует опытам №5-7 (Табл. 2).

Было установлено, что при применении дополнительной стадии ТФО после дериватизации определяемых компонентов, относительная интенсивность сигнала на детекторе масс-спектрометра, увеличивается, в среднем на 22-24%. Зависимость применения дополнительной стадии ТФО от увеличения относительной интенсивность сигнала определяемых соединений отображена графически в табл.3 и на фиг. 4.

При проведении экспериментов, варьировали тип картриджа ТФО и вид дополнительной промывки сорбента с нанесенным на него дериватами. Эксперименты проводили на экстрактах гомогенатов мышечной ткани в которые вводили эквивалентное количество глифосата, АМФК, глюфосината перед стадией дериватизации. Схема эксперимента была следующей:

К экстрактам, прошедшим первую стадию ТФО, добавляли растворы стандартов, боратный буфер и раствор 9-флуоренилметоксикарбонил хлорида, перемешивали и проводили дериватизацию при 50°С в течение 30 минут. После чего, к дериватам добавляли диэтиловый эфир, встряхивали и удаляли органический слой разделением смеси центрифугированием. Остаток неорганической части концентрировали в токе азота до 1 см³, закисляли соляной кислотой и доводили до 3 см³ деионизованной водой, центрифугировали. Целиком наносили разбавленный дериват на слой сорбента и позволяли протечь в слив. Сорбент, с удержавшимися на нем дериватами промывали 1.5 см³ промывочной смеси (в соответсвии с табл. 3), сушили продавливанием, а дериваты элюировали органическим растворителем в приемный флакон. Получившиеся элюаты концентрировали в токе азота досуха и перерастворяли в 1 см³ подвижной фазы для хроматографа, центрифугировали и использовали для анализа методом ВЭЖХ-МС/МС. За эталон принимали эксперимент к которому не применяли дополнительную стадию ТФО, и дериватизацию которого прерывали согласно прототипу: введением дихлорметана, с последующим центрифугированием и анализом аликвоты супернатанта методом ВЭЖХ-МС/МС.

Согласно полученным данным, можно заключить, что оптимальным протоколом проведения второй стадии ТФО является применение картриджей с сорбентом Oasis WCX Waters (60 мг, 3 см³), при условии дополнительной промывки 1.5 см³ 5% муравьиной кислоты с 20-30% метанола, что соответствует опытам №3-4 (Табл. 3). Введение дополнительной очистки позволяет добиться значительного увеличения сигнала детектора масс-спектрометра. На Фиг. 5 изображена разница относительных интенсивностей сигналов детектора масс-спектрометра между глифосатом, не прошедшим ТФО на слабом катионообменном сорбенте - «А» и глифосатом, прошедшим такую очистку, согласно опыту 4 в табл. 3 - «Б».

Было установлено, что при применении новых протоколов экстракции, ТФО, дериватизации и введению дополнительного этапа ТФО на слабом катионообменном сорбенте, с последующим концентрированием в токе азота, значительно повышается аналитический отклик при определении глифосата, а так же появляется возможность анализировать метаболит глифосата и родственное им соединение - глюфосинат. Пример масс-хроматограмм глифосата, АМФК и глюфосината, извлеченных из образцов молока патентуемым способом приведен на фиг. 6; из мышечных тканей на фиг. 7; из субпродуктов на фиг. 8. Градуировочная характеристика с указанным коэффициентом корреляции, построенная по 5 уровням добавок каждого определяемого соединения в мышечную ткань, и прошедших процедуру экстракции и очистки в соответствии с патентуемым способом, представлена на фиг. 9.

Литература.

1. Arregui М.С., Lenardon A., Sanchez D., Maitre ML, Scotta R., Enrique S. (2003). Monitoring glyphosate residues in transgenic glyphosate-resistant soybean. Pest. Manag. Sci., 60, 163 - 166. https://doi.org/10.1002/ps.775

2. Bai S.H., Ogbourne S.M. (2016). Glyphosate: environmental contamination, toxicity and potential risks to human health via food contamination. Environ. Sci. Pollut. Res., 23, 18988 - 19001. https://doi.org/l0.1007/s 11356-016-7425-3

3. Guyton K.Z., Loomis D., Grosse Y., El-Ghissassi F., Benbrahim-Tallaa L., Guha N., et al. (2015). Carcinogenicity of Tetrachlorvinphos, Parathion, Malathion, Diazinon, and Glyphosate. The Lancet Oncology, 16, 490 - 491. https://doi.org/l 0.1016/S1470-2045(15)70134-8

4. Luca Maria Chiesa, Maria Nobile, Sara Panseri & Francesco Arioli (2019) Detection of glyphosate and its metabolites in food of animal origin based on ion-chromatography-high resolution mass spectrometry (IC-HRMS), Food Additives & Contaminants: Part A, 36:4,592-600, DOI: 10.1080/19440049.2019.1583380

5. Monika Krtiger, Philipp Schledorn, Wieland Schrodl, Hans-Wolfgang Hoppe, Walburga Lutz, Awad A. Shehata. Detection of Glyphosate Residues in Animals and Humans 2014 Journal of Environmental and Analytical Toxicology Volume: 4, Issue: 2, pp 1-5. DOI: 10.4172/2161-0525.1000210

6. Stefan Ehling and Todime M. Reddy. Analysis of Glyphosate and Aminomethylphosphonic Acid in Nutritional Ingredients and Milk by Derivatization with Fluorenylmethyloxycarbonyl Chloride and Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Journal of Agricultural and Food Chemistry 2015 63 (48), 10562-10568. DOI: 10.1021/acs.jafc.5b04453

7. Philippe Szternfeld, Svetlana V. Malysheva, Vincent Hanot, Laure Joly. A Robust Transferable Method for the Determination of Glyphosate Residue in Liver After Derivatization by Ultra-high Pressure Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Food Analytical Methods. 2016. 9. 5. pp 1173-1179. DOI 10.1007/s12161-015-0293-5

8. https://www.fao.org/fileadmin/templates/agphome/documents/Pests_Pesticides/S pecs/Glvphosate_2016_02_10.pdf

Изобретение относится к области аналитической химии. Раскрыт способ количественного определения глифосата, аминометилфосфоновой кислоты (АМФК) и глюфосината в продукции животноводства, включающий извлечение анализируемых соединений из образца деионизованной водой, подкисленной сульфосалициловой кислотой, с последующей стадией ТФО на обращенно-фазном сорбенте и дериватизацию с жидкостно-жидкостной экстракцией диэтиловым эфиром с последующим концентрированием неорганической части полученной смеси и дополнительной стадией ТФО на обращенно-фазном сорбенте со слабыми катионо-обменными свойствами с последующим концентрированием элюата и его нормализацией до 1 см³ перед анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. При этом в качестве экстрагента применяют 1% сульфосалициловую кислоту, а процедуру твердофазной очистки (ТФО), предшествующей дериватизации, проводят на картридже с обращенно-фазным сорбентом марки Oasis HLB Waters 60 мг, 3 см³, дериватизацию проводят при 50°С в течение 20-45 мин, а удаление остатка дериватизирующего агента проводят его переводом в диэтиловый эфир с последующим концентрированием неорганической части полученной смеси и дополнительной ТФО на обращенно-фазном сорбенте со слабыми катионо-обменными свойствами Oasis WCX Waters 60 мг, 3 см³ с дополнительной промывкой 1,5 см³ 5% муравьиной кислоты с 20-30% метанола, и последующим концентрированием элюата с его нормализацией до 1 см³ перед анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. Изобретение обеспечивает возможность одновременного количественного определения глифосата, АМФК и глюфосината, повышение относительной интенсивности сигнала средства измерения за счет увеличения полноты дериватизации и снижения шумов от применения дополнительного этапа ТФО. 3 табл., 9 ил.

Способ количественного определения глифосата, аминометилфосфоновой кислоты и глюфосината в продукции животноводства, включающий извлечение анализируемых соединений из образца деионизованной водой, подкисленной сульфосалициловой кислотой, с последующей стадией ТФО на обращенно-фазном сорбенте и дериватизацию с жидкостно-жидкостной экстракцией диэтиловым эфиром с последующим концентрированием неорганической части полученной смеси и дополнительной стадией ТФО на обращенно-фазном сорбенте со слабыми катионо-обменными свойствами с последующим концентрированием элюата и его нормализацией до 1 см³ перед анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией, отличающийся тем, что в качестве экстрагента применяют 1% сульфосалициловую кислоту, а процедуру твердофазной очистки (ТФО), предшествующей дериватизации, проводят на картридже с обращенно-фазным сорбентом марки Oasis HLB Waters 60 мг, 3 см³, дериватизацию проводят при 50°С в течение 20-45 мин, а удаление остатка дериватизирующего агента проводят его переводом в диэтиловый эфир с последующим концентрированием неорганической части полученной смеси и дополнительной ТФО на обращенно-фазном сорбенте со слабыми катионо-обменными свойствами Oasis WCX Waters 60 мг, 3 см³ с дополнительной промывкой 1,5 см³ 5% муравьиной кислоты с 20-30% метанола, и последующим концентрированием элюата с его нормализацией до 1 см³ перед анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.