Реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А.

В сентябре 2021 ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) рекомендовала заменить A (H3N2) компонент в составе противогриппозных вакцин для Южного полушария на 2022 гг. эпидемический сезон на А/Дарвин/9/2021(H3N2)-подобные вирусы подклайда 3C.2a1b.2a2 [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2022 southern hemisphere influenza season. 24 September 2021. https://www.who.int/publications/m/item/recommended-composition-of-influenza-virus-vaccines-for-use-in-the-2022-southern-hemisphere-influenza-season].

Это было связано с появлением в циркуляции в странах Южного полушария значительной доли штаммов подтипа A (H3N2), относящихся к подклайду 3C.2a1b.2a2 и антигенно отличающихся от вирусов гриппа, относящихся к подклайду 3C.2a1b.2a1, рекомендованных ранее для производства A (H3N2) компонента вакцины для Северного полушария на 2021-2022 гг. В дальнейшем А/Дарвин/9/2021(H3N2)-подобные вирусы получили широкое распространение и в Северном полушарии, что привело к тому, что в феврале 2022 ВОЗ также приняла решение заменить A (H3N2) компонент в составе противогриппозных вакцин для Северного полушария на 2022-2023 гг. эпидемический сезон на А/Дарвин/9/2021 (H3N2)-подобные вирусы [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2022-2023 northern hemisphere influenza season. 25 February 2022. https://www.who.int/publications/m/item/recommended-composition-of-iniluenza-virus-vaccines-for-use-in-the-2022-2023-northern-hemisphere-influenza-season].

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа А/Дарвин/9/2021(H3N2), известный вакцинный штамм А/17/Гонконг/2019/2573 (H3N2) - прототип [Степанова Е.А., Баженова Е.А., Крутикова Е.В., Котомина Т.С., Ларионова Н.В., Исакова-Сивак И.Н., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Гонконг/2019/2573 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2783894 от 21.11.2022. - Опубл. БИ 2022. - №33] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может обеспечить защиту во время эпидемии, вызванной А/Дарвин/9/2021-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического штамма А/Дарвин/9/2021 (H3N2).

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Shcherbik S., Pearce N., Kiseleva, I., Larionova N., Rudenko, L., Xu, X., Wentworth, D.E., Bousse, T. Implementation of new approaches for generating conventional reassortants for live attenuated influenza vaccine based on Russian master donor viruses // J. Virol. Methods. - 2016. - Vol. 227, - P. 33-39; DOI: 10.1016/j.jviromet.2015.10.009].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа - разрешен для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С. 66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Дарвин/9/2021 (H3N2) с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии кроличьей гипериммунной антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и са-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) показало, что ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Дарвин/9/2021 (H3N2), поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) и родительского штамма А/Дарвин/9/2021(H3N2) с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Дарвин/9/2021(H3N2), и наоборот полностью совпадали (табл. 1).

Второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - проверен методом секвенирования соответствующего гена, который идентичен гену нейраминидазы вируса А/Дарвин/9/2021(H3N2).

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали метод пиросеквенирования ДНК копий генов, аналогичный описанному [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Разработка протокола пиросеквенирования для анализа происхождения генов реассортантов при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2018. - Т. 36, №2. - С. 98-103; DOI: 10.18821/0208-0613-2018-36-2-98-1031 с использованием комплекта высокоспецифичных олигонуклеотидов, разработанных в программе PSQ Assay Design для анализа генома современных штаммов подтипа H3N2 и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) принадлежат эпидемическому родительскому вирусу А/Дарвин/9/2021 (H3N2), гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) представлены в табл. 2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).

Полное секвенирование генома вакцинного штамма А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) показало генетическую стабильность сегментов генома, унаследованных вакцинным штаммом от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2). Кроме того, в генах, унаследованных от донора аттенуации, не появилось дополнительных мутаций в ходе получения вакцинного штамма.

Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, в РКЭ, с использованием метода сэнгеровского секвенирования. Для этого фрагмент гена, содержащего аттенуирующую мутацию, амплифицировали в реакции ПЦР и производили секвенирование участка с интересующей позицией с праймеров, позволяющих прочитать последовательность на интересующем участке. На фиг. 1 приведен пример результата секвенирования фрагмента гена РВ1, содержащего аттенуирующую мутацию в позиции 819 у донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Наличие аттенуирующей мутации G → Т очевидно следует из цвета пика на хроматограмме, полученной в результате анализа гена РВ1 вакцинного штамма А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) (фиг. 1).

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2), проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2), в развивающихся куриных эмбрионах обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Установлено, что вакцинный вирус А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) является температурочувствительным (ts-фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила ≤ 1.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (ca-фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 6.8 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.: 2010. 39 с], Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с], с Правилами надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств [Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 г. №81 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств»] и с Руководством по доклиническим исследованиям безопасности в целях проведения клинических исследований и регистрации лекарственных препаратов [Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.11.2019 г. №202 «Об утверждении Руководства по доклиническим исследованиям безопасности в целях проведения клинических исследований и регистрации лекарственных препаратов»].

Мышам вводили однократно внутрибрюшинно вакцинный вирус с титром 7.0 lg ЭИД₅₀/мл в 0.5 мл, что соответствовало одной дозе вакцинного препарата для человека. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 5) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм для живой гриппозной вакцины А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Дарвин/9/2021 (H3N2), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью, холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак® и Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с], вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) депонирован 15.11.2022 года в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2992 и имеет характеристики, представленные в образце паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 8.9 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:512 с 1.0% эритроцитами морской свинки.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Предложен реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2992. Вакцинный штамм А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) - реассортант получен путем скрещивания эпидемического вируса А/Дарвин/9/2021(H3N2) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Штамм А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2) позволяет получить живую гриппозную интраназальную вакцину для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей. 1 ил., 5 табл.

Реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Дарвин/2021/410 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2992, для получения живой гриппозной интраназальной гриппозной вакцины для взрослых и для детей.