Реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А.

Впервые в сентябре 2021 Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала заменить A (H3N2) компонент в составе противогриппозных вакцин на эпидемический сезон 2022 г. для Южного полушария на А/Дарвин/9/2021(H3N2)-подобные вирусы подклайда 3C.2alb.2a2 [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2022 southern hemisphere influenza season. 24 September 2021 https://www.who.int/publications/m/item/recommended-composition-of-influenza-virus-vaccines-for-use-in-the-2022-southem-hemisphere-influenza-season].

Позднее А/Дарвин/9/2021(Н3№)-подобные вирусы получили широкое распространение и в Северном полушарии. В результате чего, в феврале 2022 года ВОЗ приняла решение на эпидемический сезон 2022-2023 гг. для Северного полушария также заменить A (H3N2) компонент в составе противогриппозных вакцин на А/Дарвин/9/2021 (Н3Н2)-подобные вирусы [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2022-2023 northern hemisphere influenza season. 25 February 2022. https://www.who.int/publications/m/item/recommended-composition-of-influenza-virus-vaccines-for-use-in-the-2022-2023-northem-hemisphere-influenza-season]. В дальнейшем А/Дарвин/9/2021(НЗ№)-подобные вирусы сохранили свое доминирование в циркуляции, в связи с чем ВОЗ не стала изменять A (H3N2) компонент в составе противогриппозных вакцин на эпидемический сезон 2023 г. для Южного полушария [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2023 southern hemisphere influenza season. 23 September 2022. https://www.who.int/publications/mZitem/recommended-composition-of-infhienza-virus-vaccines-for-use-in-the-2023-southem-hemisphere-influenza-season] и на эпидемический сезон 2023-2024 гг.для Северного полушария [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2023-202 northern hemisphere influenza season. 24 February 2023. https://www.who.int/publications/m/item/recommended- composition-of-influenza-virus-vaccines-for-use-in-the-2023-2024-northem-hemisphere-influenza-season].

Выбранный для подготовки гриппозных вакцин штамм А/Мичиган/173/2020 (H3N2) является антигенно родственным рекомендованному ВОЗ вирусу гриппа А/Дарвин/9/2021 (H3N2).

В результате появления в циркуляции А/Дарвин/9/2021(H3N2)-подобных вирусов гриппа, известный вакцинный штамм А/17/Гонконг/2019/2573 (H3N2) - прототип [Степанова Е.А., Баженова Е.А., Крутикова Е.В., Котомина Т.С., Ларионова Н.В., Исакова-Сивак И.Н., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Гонконг/2019/2573 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2783894 от 21.11.2022. - Опубл. БИ 2022. - №33] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может обеспечить защиту во время эпидемии, вызванной А/Дарвин/9/2021 (H3N2) - подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического штамма А/Мичиган/173/2020 (H3N2) (А/Дарвин/9/2021 (Н3Н2)-подобного).

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Shcherbik S., Pearce N., Kiseleva, L, Larionova N., Rudenko, L., Xu, X., Wentworth, D.E., Bousse, T. Implementation of new approaches for generating conventional reassortants for live attenuated influenza vaccine based on Russian master donor viruses // J. Virol. Methods. - 2016. - Vol. 227, - P. 33-39; DOI: 10.1016/j.j viromet.2015.10.009].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа - разрешен для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С.66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, РА, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма.

Вакцинный штамм А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Мичиган/173/2020 (H3N2) (А/Дарвин/9/2021 (Н3К2)-подобного) с донором аттенуации

А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии кроличьей гипериммунной антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и са-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) показало, что ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок НА вакцинного штамма в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Мичиган/173/2020 (H3N2) (А/Дарвин/9/2021 (H3N2)-подобного), поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) и родительского штамма А/Мичиган/173/2020 (H3N2) (А/Дарвин/9/2021 (H3N2)-подобного) с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Мичиган/173/2020 (H3N2) (А/Дарвин/9/2021 (H3N2)-подобного), и наоборот полностью совпадали (табл.1). Принадлежность НА в составе генома вакцинного штамма также подтверждена методом секвенирования. Кроме того, перекрестная постановка РТГА с вирусами А/Дарвин/9/2021 (H3N2), А/Мичиган/173/2020 (H3N2) и А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) в качестве антигенов с соответствующими гипериммунными крысиными сыворотками подтвердила близкое антигенное родство этих вирусов (табл. 1).

Второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма NA проверен методом секвенирования и идентичен вирусу А/Мичиган/173/2020 (H3N2) (А/Дарвин/9/2021 (H3N2) - подобного).

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали метод пиросеквенирования ДНК копий генов, аналогичный описанному [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Разработка протокола пиросеквенирования для анализа происхождения генов реассортантов при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2018. - Т. 36, №2. - С. 98-103; DOI: 10.18821/0208-0613-2018-36-2-98-103] с использованием комплекта высокоспецифичных олигонуклеотидов, разработанных в программе PSQ Assay Design для анализа генома современных штаммов подтипа H3N2 и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки НА и NA, принадлежат эпидемическому родительскому вирусу А/Мичиган/173/2020 (H3N2) (А/Дарвин/9/2021 (H3N2)-подобного), гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, РА, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) представлены в табл.2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и продемонстрировали, что вакцинный штамм А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).

Полное секвенирование генома вакцинного штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) показало генетическую стабильность сегментов генома, унаследованных вакцинным штаммом от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют в генах, кодирующих внутренние белки реассортантного штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2). Кроме того, в генах, унаследованных от донора аттенуации, не появилось дополнительных мутаций в ходе получения вакцинного штамма.

Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования в РКЭ вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, с использованием метода сэнгеровского секвенирования. Для этого фрагмент гена, содержащего аттенуирующую мутацию, амплифицировали в реакции ПЦР и производили секвенирование участка с интересующей позицией с праймеров, позволяющих прочитать последовательность на интересующем участке. На фиг.1 приведен пример результата секвенирования фрагмента гена РА, содержащего аттенуирующую мутацию в позиции 1045 у донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Наличие аттенуирующей мутации G (Т очевидно следует из цвета пика на хроматограмме, полученной в результате анализа гена РА вакцинного штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) (фиг. 1).

В таблице 3 приведены результаты секвенирования всех фрагментов генов вакцинного штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2), содержащих аттенуирующие мутации, соответствующие донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), до и после пятикратного пассирования в РКЭ. Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) и не утрачиваются в процессе пассирования.

Все вышесказанное свидетельствует о генетической стабильности аттенуирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2).

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) в РКЭ обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) является температурочувствительным (As-фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила ≤1.2 logio ЭИД50/МЛ, и холодоадаптированным (са-фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 6.8 logio ЭИД50/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.:2010. 39 с. ], Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с], с Правилами надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств [Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 г. №81 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств»] и с Руководством по доклиническим исследованиям безопасности в целях проведения клинических исследований и регистрации лекарственных препаратов [Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.11.2019 г. №202 «Об утверждении Руководства по доклиническим исследованиям безопасности в целях проведения клинических исследований и регистрации лекарственных препаратов»].

Мышам вводили однократно внутрибрюшинно вакцинный вирус с титром 7.0 1g ЭИД50/мл в 0.5 мл, что соответствовало одной дозе вакцинного препарата для человека. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела). показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл.5) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный Штамм для живой гриппозной вакцины А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Мичиган/173/2020 (H3N2) (А/Дарвин/9/2021(H3N2)-подобного), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью, холодоадаптированностыо и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцийный штамм А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак(и Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с.], вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) депонирован 15.11.2022 года в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2994 и имеет характеристики, представленные в образце паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 7.5 logio ЭИД50/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:256 с 1.0% эритроцитами морской свинки.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

ПАСПОРТ ВАКЦИННОГО ШТАММА

1 Название штамма: А/17/Мичиган/2020/484

2 ИЭМ идентификационный №: Mich7483

3 Серия: №1

4 Сероподтип: H3N2, подклайд 3С.2a1b.2а.2

5 Метод п6 одготовки: классическая реассортация в куриных эмбрионах

6 Родительские вирусы

6.1 Эпидемический вирус: А/Мичиган/173/2020 (H3N2) (А/Дарвин/9/2021(Н31Ч2)-подобный), подклайд 3С.2a1b.2а.2; получен из Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA, CDC ID 3001586456, E4/E1spf

6.2 Донор аттенуации: А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), E37/E3spf/E1spf

7 Число пассажей в процессе реассортации: Е7 (совместное заражение, два селективных пассажа, три клонирования и одно накопление)

8 Состав генома: Гены РВ2, РВ1, РА, NP, М и NS от донора аттенуации, НА и NA - от эпидемического вируса (формула генома 6:2)

9 Характеристика штамма до лиофильной сушки

9.1 Оптимальные условия репродукции: 32°С, 48 часов

9.2 Гемагглютинирующая активность: 1:256 с 1.0% эритроцитами морской свинки

9.3 Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 7.8 logic ЭИД50/МЛ

9.4 ts маркер (температурочувствительность репродукции; инфекционная активность при температуре 40°С): ≤1.2 1g ЭИД50/МЛ (As-фенотип)

9.5 са маркер (холодоустойчивость репродукции; инфекционная активность при температуре 26°С): 4.8 1g ЭИД50/мл (са-фенотип)

10 Характеристика штамма после лиофильной сушки

10.1 Дата лиофилизации: 29.06.2022 г.

10.2 Объем материала в ампуле: 0.5 мл

10.3 Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 7.2 1g ЭИД50/мл

10.4 Гемагглютинирующая активность: 1:256 с 1.0% эритроцитами морской свинки

11 Антигенная специфичность

11.1 Гемагглютинин: идентичен эпидемическому вирусу А/Мичиган/173/2020 (H3N2) (А/Дарвин/9/2021(H3N2)-подобный) по данным секвенирования и РТГА

11.2 Нейраминидаза: идентична эпидемическому вирусу А/Мичиган/173/2020 (H3N2) (А/Дарвин/9/2021(Н3Х2)-подобный) по данным секвенирования

12 Токсикологическое исследование in vivo (острая токсичность): не токсичен после внутрибрюшинного введения мышам

13 Контроль стерильности: стерилен.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Предложен реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2994. Вакцинный штамм А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) - реассортант получен путем скрещивания эпидемического вируса А/Мичиган/173/2020 (H3N2) (А/Дарвин/9/2021(H3N2)-подобный) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Штамм А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2) позволяет получение живой гриппозной интраназальной вакцины для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей. 1 ил., 5 табл.

Реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Мичиган/2020/484 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2994, для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.