Реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2).

В феврале 2021 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала на эпидемический сезон 2021-2022 гг. для Северного полушария заменить A (H3N2) компонент в составе противогриппозных вакцин на А/Камбоджа/е0826360/2020 (H3N2)-подобный вирус, относящийся подклайду 3C.2a1b.2a [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2021-2022 northern hemisphere influenza season. 26 February 2021. https://www.who.int/publications/m/item/recommended-composition-of-influenza-virus-vaccines-for-use-in-the-2021-2022-northern-hemisphere-influenza-season]. Это было связано с широким распространением с конца августа 2020 года в странах Северного полушария А/Камбоджа/е0826360/2020 (H3N2)-подобных вирусов (подклайд 3C.2a1b.2a), которые антигенно отличались от A/Hong Kong/2671 /2019-подобных вирусов, относящихся подклайду 3C.2a1b.1b, рекомендованных для производства компонента A (H3N2) противогриппозных вакцин на эпидемический сезон 2020-2021 гг. для Северного полушария и эпидемический сезон 2021 г. для Южного полушария.

В результате появления в циркуляции А/Камбоджа/е0826360/2020 (H3N2)-подобных вирусов гриппа, к которым относится А/Тасмания/503/2020, известный вакцинный штамм А/17/Гонконг/2019/2573 (H3N2) - прототип [Степанова Е.А., Баженова Е.А., Крутикова Е.В., Котомина Т.С., Ларионова Н.В., Исакова-Сивак И.Н., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Гонконг/2019/2573 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2783894 от 21.11.2022. - Опубл. БИ 2022. - №33] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может обеспечить необходимую иммунную защиту во время эпидемии, вызванной А/Камбоджа/е0826360/2020 (H3N2)-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического штамма А/Тасмания/503/2020 (H3N2) (А/Камбоджа/е0826360/2020 (H3N2)-подобный).

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Shcherbik S., Pearce N., Kiseleva, I., Larionova N., Rudenko, L., Xu, X., Wentworth, D.E., Bousse, T. Implementation of new approaches for generating conventional reassortants for live attenuated influenza vaccine based on Russian master donor viruses // J. Virol. Methods. - 2016. - Vol. 227, - P. 33-39; doi:10.1016/j.jviromet.2015.10.009].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемаггаютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации. Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа - разрешен для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С. 66-83].

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Тасмания/503/2020 (H3N2) с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии кроличьей антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) показало, что ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемаггаютинин (НА) - в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Тасмания/503/2020 (H3N2), поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) и родительского штамма А/Тасмания/503/2020 (H3N2) с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Тасмания/503/2020 (H3N2), и наоборот полностью совпадали (табл. 1). Принадлежность НА в составе вакцинного штамма эпидемическому вирусу А/Тасмания/503/2020 (H3N2) также была подтверждена методом секвенирования. Второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - проверен методом секвенирования гена, который также идентичен вирусу А/Тасмания/503/2020 (H3N2).

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали метод пиросеквенирования ДНК копий генов, аналогичный описанному [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Разработка протокола пиросеквенирования для анализа происхождения генов реассортантов при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2018. - Т. 36, №2. - С. 98-103; DOI: 10.18821/0208-0613-2018-36-2-98-1031 с использованием комплекта высокоспецифичных олигонуклеотидов, разработанных в программе PSQ Assay Design для анализа генома современных штаммов подтипа H3N2 и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки НА и NA принадлежат эпидемическому родительскому вирусу А/Тасмания/503/2020 (H3N2), гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) представлены в табл. 2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).

Полное секвенирование генома вакцинного штамма А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) показало генетическую стабильность сегментов генома, унаследованных вакцинным штаммом от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют в генах, кодирующих внутренние белки реассортантного штамма А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2). Кроме того, в генах, унаследованных от донора аттенуации, не появилось дополнительных мутаций в ходе получения вакцинного штамма.

Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) изучали путем сравнения сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования в РКЭ вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, с использованием метода пиросеквенирования. Для данного анализа были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие данных мутаций с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24. Праймеры разработаны с использованием компьютерной программы PSQ Assay Design.

На фиг 1 приведен пример пирограммы, полученной для фрагмента гена РВ2, содержащего аттенуирующую мутацию в позиции 1459 у донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). В результате пиросеквенирования вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2) - эпидемического предшественника донора аттенуации, не обладающего аттенуирующей мутацией, отсутствует пик во второй позиции (А) (фиг. 1, А). Наличие аттенуирующей мутации G-1459-Т, приводящую к замене Val-478-Leu, характеризуется наличием пика в позиции, следующей непосредственно за субстратным пиком S (А) и снижением высоты пика в следующей за ней позиции (С), что можно увидеть на пирограмме, полученной для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (фиг. 1, Б), а также на пирограмме, полученной для гена РВ2 вакцинного штамма А/17/Тасмания/2021/151 (H3N2) (фиг. 1, В). Полученные данные пиросеквенирования подтвердили наличие всех кодирующих нуклеотидных замен, охарактеризованных для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственных за его аттенуацию, во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Тасмания/2021/151 (H3N2) до и после его пятикратного пассирования (табл. 3). Это свидетельствует о генетической стабильности аттенуирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Тасмания/2021/151 (H3N2).

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2), проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) в развивающихся куриных эмбрионах обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts-фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила ≤ 1.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (ca-фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 6.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.: 2010, 39 с], Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с.], с Правилами надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств [Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 г. №81 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств»] и с Руководством по доклиническим исследованиям безопасности в целях проведения клинических исследований и. регистрации лекарственных препаратов [Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.11.2019 г. №202 «Об утверждении Руководства по доклиническим исследованиям безопасности в целях проведения клинических исследований и регистрации лекарственных препаратов»].

Мышам вводили однократно внутрибрюшинно вакцинный вирус с титром 7.0 lg ЭИД₅₀/мл в 0.5 мл, что соответствовало одной дозе вакцинного препарата для человека. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 5) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Тасмания/503/2020 (H3N2), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью, холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак® и Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с], вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) депонирован 15.11.2022 года в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2993 и имеет характеристики, представленные в образце паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 8.5 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:128 с 1.0% эритроцитами морской свинки.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Предложен реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, под №2993. Вакцинный штамм А/17/Тасмания/2021/151 (H3N2) - реассортант получен путем скрещивания эпидемического вируса А/Тасмания/503/2020 (H3N2) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Штамм характеризуется температурочувствительностью, холодоадаптированностью и безвредностью, может быть использован для получения живой интраназальной гриппозной вакцины для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей. 1 ил., 5 табл.

Реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Тасмания/2020/151 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, под №2993, для получения живой интраназальной гриппозной вакцины для взрослых и для детей.