Способ получения тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов Российский патент 2022 года по МПК C07D311/82 

Предлагаемое изобретение относится к органической химии, к классу ксантеновых красителей и непосредственно касается группы алкилродаминов, применяемых в аналитической химии, биотехнологии флуоресцентной микроскопии для приготовления люминесцирующих сывороток и в медицине в качестве флуоресцентных метчиков белка для быстрой диагностики вирусных инфекций.

Известно, что в медицине для быстрой диагностики вирусных инфекций применяется иммунофлуоресцентное окрашивание, которое основано на взаимодействии антигена с антителами, мечеными флуорохромом, находящимся в клетках и тканях.

Аминородамины являются исходным сырьем для получения флуоресцентных метчиков белка, таких как тетраметилродаминизотилцианат (ТМРИТЦ), тетраэтилродаминизотиоцианат (РИТЦ), применяемых для получения люминесцирующих антител [Петров С.В., Райхлин Н.Т., Руководство по иммуногисстохимической диагностике опухолей человека, Казань, 2004, 456 с; Coons A.N., Creech N.I., Jonts R.N. Immunoljgical properties of antibody, containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp.Biol. Med., 1941-vol. 77, p.200-202].

К данному классу соединений относится и тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианат (РИТЦ), имеющий следующую структурную формулу:

Получение данного соединения обработкой тетраэтиламинородамина тиофосгеном в среде ацетона описано ранее (Скляр Ю.Е., Афанасьева А.В., Михайлов Г.И Методы получения химических реактивов и препаратов, вып.22, стр. 167. М., 1970 г.; Riggs, J.L., et al. "Isothiocyanate compounds as fluorescent labeling agents for immune serum." The American journal of pathology 34.6 (1958): 1081].

Процесс синтеза в цитированных выше методах получения химических реактивов и препаратов описан детально и включает следующие стадии: к нагретой до 40°С смеси 6,86 г (0,015 моль) тетраэтиламинородамина и 350 мл ацетона прибавляют раствор 7,55 г (0,067 моль) тиофосгена в 50 мл ацетона, реакционную массу перемешивают при 40°С 4 часа, растворитель отгоняют, к остатку приливают 50 мл хлороформа и вновь отгоняют растворитель. Операцию повторяют трижды, после чего остаток растворяют в 50 мл хлороформа и выливают его в 600 мл петролейного эфира, а выпавший осадок отфильтровывают и сушат. Получают 5-6 г тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианата, что составляет 62-70% от теоретического количества. Коэффициент экстинции измеренный в этиловом спирте, равняется 49400. Однако описанный метод имеет два существенных недостатка. Во-первых, получаемый данным способом тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианат содержит значительное количество примеси 2-(2-окси-4-диэтиламинобензоил)-4(5)-изотиоцианобензойной кислоты. Это препятствует применению конечного продукта в флуоресцентной микроскопии, поскольку данное соединение способно соединяться с аминогруппой белка, что приводит к некорректным результатам. И во-вторых, при осуществлении известного способа используется токсичный тиофосген, что отрицательно сказывается на возможность промышленного осуществления данного метода синтеза.

Для получения тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов технологичным способом, обеспечивающим высокий выход и необходимую чистоту конечного продукта, соответствующую требованиям, предъявляемым к реагентам для флуоресцентной микроскопии, и исключающим использование токсичных реагентов предлагается способ получения тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов взаимодействием тетраэтил-4(или 5)-аминородаминов с серосодержащим соединением и последующим выделением целевого продукта.

Сущность способа получения тетраэтил-4(или5)-родамин-изотиоцианатов взаимодействием тетраэтил-4(или 5)-аминородаминов с серосодержащим соединением и последующим выделением целевого продукта заключается в том, что в качестве серосодержащего соединения используется сероуглерод, а исходный тетраэтиламинородамин первоначально подвергается аммиачной обработке водным раствором аммиака, насыщенным газообразным аммиаком при мольном содержании аммиака, равном 0,040-0,050 моль на 0,040 моль тетраэтиламинородамина, проводимой при температуре 0-4°С и до установления рН 9-10, после чего осуществляют обработку реакционной массы сероуглеродом из расчета мольного соотношении тетраэтиламинородамина к сероуглероду, равного 0,040:0,063-0,076, затем выдерживают полученную реакционную массу при температуре 0-4°С в течение 1,5-2,5 часов и вводят ее в одномолярный водный раствор соли тяжелого металла, выбранного из группы: железо, медь, свинец, и образовавшийся осадок соответствующей соли тяжелого металла подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1, после чего осуществляют фильтрацию, сушку, экстракцию ацетоном, затем хлороформом, пропускание через слой силикагеля и упаривание.

Оптимально в качестве солей тяжелых металлов используют соединения, выбранные из группы: хлорид железа, сульфат меди, нитрат свинца.

При получении тетраэтил-4-родамин-изотиоцианата в качестве исходного соединения используется тетраэтил-4-аминородамин.

При получении тетраэтил-5-родамин-изотиоцианата в качестве исходного соединения используется тетраэтил-5-аминородамин.

При получении смеси тетраэтил-4 (или 5)-родаминизотиоцианатов в качестве исходного соединения используется смесь тетраэтил-4(или 5)-аминородаминов.

В основе предлагаемого способа получения тетраэтилродаминизотиоцианата лежит известная реакция взаимодействия тетраэтиламинородамина с серосодержащим соединением, но в котором в качестве серосодержащего соединения вместо тиофосгена используется сероуглерод. Ниже приводится механизм и схема синтеза тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов предлагаемым способом:

Согласно приведенной схеме, тетраэтиламинородамин реагирует с сероуглеродом в присутствии аммиака с образованием аммонийной соли родаминдитиокарбаминовой кислоты, которая под действием соли тяжелого металла превращается тетраэтилродамин изотиоцианат.

Существенными признаками данного способа являются количественные соотношения реагентов (мольное соотношение тетраэтиламинородамина к сероуглероду, равное 0,040:0,063-0,076), а также временные и температурные режимы (выдерживание реакционной массы при температуре 0-4°С в течение 1,5-2,5 часов), а также последовательность стадий обработки и выделения конечного продукта.

В результате предлагаемого способа получается тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианат более высокого качества, чем по известной методике. Получаемые продукты не содержат примеси, мешающие в дальнейшем применению при приготовлении люминесцирующих сывороток и обеспечивают получение чистых сывороток. Предлагаемый процесс технологичен и более безопасен ввиду исключения из синтеза токсичного тиофосгена.

В результате предлагаемого способа получаются либо отдельные изомеры: тетраэтил-4-родаминизотиоцианат (РИТЦ-4), тетраэтил-5-родаминизотиоцианат (РИТЦ-5), либо смесь изомеров тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов.

Качество данных продуктов подтверждено следующими показателями (коэффициентом экстинции измеренным в этиловом спирте и в диметилформамиде, и связываемостью с белком):

Тетраэтил-4-родаминизотиоцианат - (РИТЦ-4):

Коэффициент экстинции в диметилформамиде, в этиловом спирте. Связываемость с белком 85%.

Тетраэтил-5-родаминизотиоцианат-(РИТЦ-5):

Коэффициент экстинции в диметилформамиде, в этиловом спирте. Связываемость с белком 90%.

Смесь изомеров тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов:

в диметилформамиде, в этиловом спирте. Связываемость с белком 85%.

Кроме того, сам процесс получения тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов технологичен и более безопасен ввиду исключения из синтеза токсичного тиофосгена, как в прототипе и замена его на сероуглерод.

Ниже изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения тетраэтил-4-родаминизотиоцианата (РИТЦ-4): В колбу загружают 18,0 г (0,040 моль) тетраэтил-4-аминородамина и 100 мл водного аммиака, реакционную массу охлаждают до 0°С и пропускают 900 мл (0,68 г, 0,040 моль) газообразного аммиака, затем прибавляют 3,8 мл (4,8 г, 0,063 моль) сероуглерода и выдерживают реакционную смесь при температуре 0-4°С в течение двух часов. Реакционную массу выливают в 500 мл одномолярного водного раствора хлорного железа, содержащий 82 г хлорного железа в 500 мл воды, подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1 и отфильтровывают выпавший осадок. Полученный осадок экстрагируют ацетоном (3 раза по 200 мл), к экстракту прибавляют 1200 мл хлороформа и пропускают раствор через слой силикагеля. Экстракт упаривают и получают 15 г тетраэтил-4-родаминизотиоцианата (72%). При в диметилформамиде, в этиловом спирте. Связываемость с белком 85%.

Пример 2. Способ получения смеси тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов.

В колбу загружают 18 г (0,040 моль) тетраэтил-4(или 5)-аминородамина и 100 мл водного аммиака. Реакционную массу охлаждают до 0°С и в течение 30 минут пропускают 1115 мл (0,85 г, 0,050 моль) газообразного аммиака, затем прибавляют 4,5 мл (5,6 г, 0,076 моль) сероуглерода и выдерживают при температуре 0-4°С в течение 2,5 часов. Реакционную массу выливают при температуре 0-4°С в течение двух часов в 500 мл одномолярного водного раствора сульфата меди, содержащий, 80 г сульфата меди в 500 мл воды, подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1 и отфильтровывают выпавший осадок. Полученный осадок экстрагируют ацетоном 3 раза по 200 мл, к экстракту прибавляют 1200 мл хлороформа и пропускают раствор через слой силикагеля. Экстракт упаривают и получают 16 г тетраэтилродамин-4(или 5)-изотиоцианата. Выход 77,6%.

Пример 3. Способ получения тетраэтил-4-родаминизотиоцианата. В колбу загружают 18 г (0,040 моль) тетраэтил-4-аминородамина и 100 мл водного аммиака, охлаждают до 0°С и пропускают 1115 мл (0,85 г, 0,050 моль) газообразного аммиака, затем прибавляют 4,5 мл (5,6 г, 0,076 моль) сероуглерода и выдерживают при температуре 0-4°С 1,5 часа. Реакционную массу выливают в 500 мл одномолярного раствора азотнокислого свинца (116 г азотнокислого свинца в 500 мл воды), подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1 и отфильтровывают выпавший осадок. Полученный осадок экстрагируют ацетоном 3 раза по 200 мл, к экстракту прибавляют 1200 мл хлороформа и пропускают раствор через слой силикагеля. Экстракт упаривают и получают 15,5 г тетраэтил-4-родаминизотиоцианата. Выход 75,2%. При в диметилформамиде, в этиловом спирте. Связываемость с белком 85%.

Пример 4. Способ получения тетраэтил-5-родаминизотиоцианата (РИТЦ-5). В колбу загружают 18 г (0,040 моль) тетраэтил-5-аминородамина и 100 мл водного аммиака. Охлаждают до 0°С и в течение 30 минут пропускают 1115 мл 0,85 г, 0,050 моль) газообразного аммиака, затем прибавляют 4,5 мл (5,6 г, 0,076 моль) сероуглерода и выдерживают при температуре 0-4°С в течение 2,5 часов. Реакционную массу выливают в 500 мл (80 г сульфата меди в 500 мл воды), подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1 и отфильтровывают выпавший осадок. Полученный осадок экстрагируют ацетоном 3 раза по 200 мл, к экстракту прибавляют 1200 мл хлороформа и пропускают раствор через слой силикагеля. Экстракт упаривают и получают 14 г тетраэтил-5-родаминизотиоцианата. Выход 67,2%.

Пример 5. Способ получения тетраэтил-5-родаминизотиоцианата (РИТЦ-5). В колбу загружают 18,0 г (0,040 моль) тетраэтил-5-аминородамина и 100 мл водного аммиака. Охлаждают до 0°С и пропускают 900 мл (0,68 г, 0,040 моль) газообразного аммиака, затем прибавляют 3,8 мл (4,8 г, 0,063 моль) сероуглерода и выдерживают при температуре 0-4°С в течение двух часов. Реакционную массу выливают в 500 мл одномолярного водного раствора хлорного железа (82 г хлорного железа в 500 мл воды), подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1 и отфильтровывают выпавший осадок. Полученный осадок экстрагируют ацетоном 3 раза по 200 мл, к экстракту прибавляют 1200 мл хлороформа и пропускают раствор через слой силикагеля. Экстракт упаривают и получают 16,5 г тетраэтилродамин-5-изотиоцианата. Выход 80%. При в диметилформамиде, в этиловом спирте. Связываемость с белком 90%.

Изобретение относится к области органической химии, конкретно к способу получения тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов. Согласно предлагаемому способу получения тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов осуществляют взаимодействие тетраэтил-4(или 5)-аминородаминов с серосодержащим соединением с последующим выделением целевого продукта. Способ характеризуется тем, что в качестве серосодержащего соединения используют сероуглерод, а исходный тетраэтиламинородамин первоначально подвергают аммиачной обработке водным раствором аммиака, насыщенным газообразным аммиаком при мольном содержании аммиака, равном 0,040-0,050 моль на 0,040 моль тетраэтиламинородамина, проводимой при температуре 0-4°С и до установления рН 9-10. После этого осуществляют обработку реакционной массы сероуглеродом из расчета мольного соотношения тетраэтиламинородамина к сероуглероду, равного 0,040:0,063-0,076, затем выдерживают полученную реакционную массу при температуре 0-4°С в течение 1,5-2,5 ч и вводят ее в одномолярный водный раствор соли тяжелого металла, выбранного из группы железо, медь, свинец. Образовавшийся осадок соответствующей соли тяжелого металла подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1, после чего осуществляют фильтрацию, сушку, экстракцию ацетоном, затем хлороформом, пропускание через слой силикагеля и упаривание. Предлагаемый способ обеспечивает высокий выход и необходимую чистоту конечного продукта, который не содержит примесей, мешающих его применению при приготовлении люминесцирующих сывороток. 4 з.п. ф-лы, 5 пр.

1. Способ получения тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов взаимодействием тетраэтил-4(или 5)-аминородаминов с серосодержащим соединением и последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве серосодержащего соединения используют сероуглерод, а исходный тетраэтиламинородамин первоначально подвергают аммиачной обработке водным раствором аммиака, насыщенным газообразным аммиаком при мольном содержании аммиака, равном 0,040-0,050 моль на 0,040 моль тетраэтиламинородамина, проводимой при температуре 0-4°С и до установления рН 9-10, после чего осуществляют обработку реакционной массы сероуглеродом из расчета мольного соотношения тетраэтиламинородамина к сероуглероду, равного 0,040:0,063-0,076, затем выдерживают полученную реакционную массу при температуре 0-4°С в течение 1,5-2,5 ч и вводят ее в одномолярный водный раствор соли тяжелого металла, выбранного из группы железо, медь, свинец, и образовавшийся осадок соответствующей соли тяжелого металла подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1, после чего осуществляют фильтрацию, сушку, экстракцию ацетоном, затем хлороформом, пропускание через слой силикагеля и упаривание.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что оптимально в качестве солей тяжелых металлов используют соединения, выбранные из группы хлорид железа, сульфат меди, нитрат свинца.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при получении тетраэтил-4-родаминизотиоцианата в качестве исходного соединения используют тетраэтил-4-аминородамин.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при получении тетраэтил-5-родаминизотиоцианата в качестве исходного соединения используют тетраэтил-5-аминородамин.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при получении смеси тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов в качестве исходного соединения используют смесь тетраэтил-4(или 5)-аминородаминов.