СПОСОБ УЛУЧШЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ Российский патент 2001 года по МПК A61K39/395 A61P15/08 

Изобретение относится к медицине, а именно к андрологии, репродуктологии, и может быть использовано при искусственной инсеменации и экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) для улучшения оплодотворяющих свойств спермы за счет повышения подвижности сперматозоидов.

Установлено, что бесплодие в супружеской паре на 50% обусловлено снижением оплодотворяющей способности (фертильности) эякулята [4, 6], стандартными характеристиками и показателями которого являются общая концентрация сперматозоидов и процент активноподвижных форм [5]. В настоящее время причиной, ведущей к снижению оплодотворяющей способности спермы, является хроническое воспаление предстательной железы, придатков яичка, семенных пузырьков - в 24%, или имеет идиопатический характер в 20% [5]. Используемые при ЭКО и искусственной инсеменации приемы, улучшающие исходные свойства спермы, сводятся либо к повышению концентрации сперматозоидов центрифугированием, либо к флотации активноподвижных сперматозоидов в специальных средах [1, 8].

Известен способ повышения концентрации сперматозоидов за счет центрифугирования. Сперму собирают в среду Эрла и после полной гомогенизации центрифугируют. Супернатант сливают и на осадок наслаивают среду Menezzo B2, выдерживают 1 час при комнатной температуре, после чего собирают 0,5 мл наслоенной среды и используют для искусственной инсеменации [8]. Существенным недостатком известного способа является механическое повреждение сперматозоидов при центрифугировании, их агглютинация и, как следствие, снижение исходной подвижности. Оценка эффективности способа - субъективна.

В качестве ближайшего аналога нами избран способ улучшения подвижности сперматозоидов методом флотации, предотвращающий механическое повреждение, при котором повышение подвижности достигается за счет флотации активноподвижных сперматозоидов in vitro в специальные среды, наслаиваемые на нативную сперму, в частности раствор Бакера, который состоит из 3 г глюкозы, 0,6 г натрия сульфата, 0,2 г натрия хлорида, 0,01 г калия сульфата, растворенных в 100 мл дистиллированной воды [1] , в которые флотируют активноподвижные сперматозоиды [8].

В известных способах эффективность оценивается по обнаружению активных сперматозоидов при микроскопировании в концентрации 0,1 млн в 1 мл среды [8] , что носит субъективный характер и зависит от опыта работы лаборанта. Показатели (количественные и качественные) эффективности способа отсутствуют.

Недостатками способа прототипа являются:
1. Отсутствие качественных показателей улучшения свойств спермы.

2. Исходно низкое содержание сперматозоидов в эякуляте затрудняет проведение способа, т.к. часть их не может флотировать вообще.

3. Беременности при использовании известных способов наступают в том же проценте случаев, что и при отсутствии лечения. Велик процент выкидышей и преждевременных родов с рождением нездорового потомства [1, 8].

4. Используются среды, не учитывающие ферментный, белковый и гормональный состав эякулята.

Указанные недостатки предполагается устранить в заявляемом способе.

Техническим решением поставленной задачи является повышение подвижности сперматозоидов в пробе эякулята, предназначенном для ЭКО или искусственной инсеменации, за счет активирования малоактивноподвижных их форм, путем внесения в сперму раствора плацентарного α₂ -микроглобулина (ПАМГ-2) при одновременном сохранении концентрации гамет с эффективностью 89%
Технический результат достигается тем, что в 0,9 мл спермы вносят 0,1 мл 0,05% раствора ПАМГ-2, инкубируют, после чего оценивают эффективность по соотношению числа активных сперматозоидов к имеющимся в эякуляте и сравнивают с исходными показателями. При возрастании активности более чем в 3 раза подвижность оценивается как (высокая) достаточная для оплодотворения.

Способ осуществляется следующим образом. Эякулят собирается у мужчины в стерильную стеклянную посуду при мастурбации после как минимум 72 часового воздержания с идиопатическим снижением подвижности сперматозоидов и с проявлениями хронического воспаления предстательной железы, придатков яичка, семенных пузырьков. Сперма выдерживается при комнатной температуре 1 час для полной ее гомогенизации, после чего ПАМГ-2 в количестве 0,1 мл 0,05% раствора вносится в 0,9 мл эякулята. Смесь инкубируется при t +37^oC в течение 10 минут. Подвижность сперматозоидов оценивалась на анализаторе клеточных тест-объектов с лазерным излучением по стандартной методике [3] и выражалась в виде частоты попадания подвижных клеток в фиксированную область пространства, которая пропорциональна концентрации подвижных клеток и их среднему модулю скорости [3], данные выводились на монитор PC 286 IBM в виде электронных таблиц. Эффект устанавливался по увеличению мелькания сперматозоидов в плоскости прохождения луча лазера (см. табл. 1). Показатели подвижности активных сперматозоидов оценивают до и после обработки раствором ПАМГ-2. (При нормальных показателях эякулята частота мелькания составляет от 50 до 200, при сниженной подвижности - от 0 до 50 мельканий).

Предлагаемый нами механизм воздействия ПАМГ-2 на сперматозоид - усиление кальциевого обмена между клеткой и сперматоплазмой при адсорбции ПАМГ-2 на клеточной мембране. Нами установлено, при инкубировании спермы при t +37^oC в течение 10 минут уровень ионов Ca⁺² практически не менялся (в среднем исходная концентрация кальция 36,23 мг%, после инкубирования 32,3 мг% - p < 0,05); при инкубировании с раствором ПАМГ-2 при тех же условиях уровень ионов кальция достоверно снижался (с исходной концентрации 36,23 мг%, до 23,65 мг% с ПАМГ-2; p < 0,05).

Новизна способа: впервые для улучшения подвижности сперматозоидов применяется раствор плацентарного α₂ -микроглобулина.

Ранее плацентарный α₂ -микроглобулин (ПАМГ-2) с лечебной целью применялся в медицине для лечения заболеваний с иммунными нарушениями - псориаз, экзема [7], с диагностической целью - как тест-система для определения уровня ПАМГ-2 в биологических жидкостях при иммунодиффузии [2].

Отличительными признаками предлагаемого способа является использование 0,05% раствора ПАМГ-2 в количестве 0,1 мл для внесения в пробы эякулятов с исходно сниженной подвижностью сперматозоидов, что приводит к увеличению подвижности сперматозоидов in vitro в среднем в 3-5 раз (300-500%) за счет активирования малоактивных сперматозоидов при сохранении их исходной концентрации.

Существо способа поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Больной Волков Ю. А., 36 лет, образование высшее, отмечает бесплодие в браке в течение 15 лет. Жена по данным обследования здорова.

Морфотип мужской: оволосение умеренное по мужскому типу, костно-мышечная система развита достаточно, подкожно-жировая клетчатка развита слабо, конституция нормостеническая.

Состояние полового аппарата: оволосение по мужскому типу, мошонка умеренно пигментирована, складчатость выражена, препуциальная складка смещается свободно. Пальпация органов мошонки и полового члена безболезненная. Предстательная железа контурируется четко, междолевая борозда выражена, безболезненная.

Общесоматически - практически здоров. Оперативных вмешательств не было. Аллергии не отмечает.

УЗС органов малого таза и мошонки - в пределах физиологической нормы.

Анализ эякулята: объем - 4 мл серо-белого цвета, вязкость норма, разжижение через 50 минут. Концентрация в 1 мл - 55 млн., подвижных - 60%, из них активноподвижных - 55%, морфологически измененные - нет, агглютинация - нет, лецитиновые зерна - (++), лейкоцитов - 0-3-5 в поле зрения, клетки сперматогенеза - отсутствуют. ПАМГ-2 спермы - 1:16 иммунодиффузионным методом (В норме уровень ПАМГ-2 в сперме: 1:16 - 1:16 - 1:32).

(Нормальные показатели эякулята: объем 2 - 6 мл, серо-белого цвета, разжижение в течение 1 ч, концентрация - в 1 мл 60 млн, подвижных - 75 - 80%, из них активноподвижных - 70%, морфологически измененных до 20%, агглютинации нет, лецитиновые зерна - (++-+++), лейкоциты до 10 в 1 мл эякулята. - Руководство по андрологии. / Под ред. Тикнинского О.Д. - Л.: Медицина. 1990. - 416 с.)
В мазках из уретры - умеренное количество Гр (-) и (+) флоры.

Ds: Бесплодие I. Олигозооспермия I степени.

Получал лечение: клостилбегит, антибактериальная терапия - без особого эффекта.

Показатели подвижности на анализаторе клеточных тест-объектов с лазерным излучением в виде таблиц с числовыми выражениями частоты попадания подвижных сперматозоидов в фиксированную область в эякуляте с концентрацией активноподвижных сперматозоидов в 1 мл 18 млн (в норме более 26 млн/мл (см. табл. 1).

Заключение: Внесение ПАМГ-2 в пробу эякулята увеличило уровень активноподвижных сперматозоидов на 590% или в 5,9 раза ( p < 0,001).

Пример 2.

Больной Платонов В.Г., 29 лет, образование высшее, отмечает бесплодие во втором браке. Жена по данным клинического обследования здорова.

Морфотип мужской: оволосение по мужскому типу, несколько избыточно, костно-мышечная система развита удовлетворительно, подкожно-жировая клетчатка развита несколько избыточно, конституция по гиперстеническому типу.

Состояние полового аппарата: оволосение по мужскому типу, кожа мошонки гиперпигментирована, складчатость хорошо выражена, препуциальная складка отсутствует. Пальпация органов мошонки и полового члена безболезненная. Предстательная железа несколько тестоватой консистенции, нормальных размеров, междолевая борозда сглажена, при пальпации чувствительна. Анамнестически отмечает инфекционный паротит, гонорейную инфекцию.

При физикальном исследовании: пищеварительная система: печень несколько увеличена, при пальпации безболезненная (в анамнезе - вирусный гепатит A), периферическая нервная система - рефлексы живые, D = S, черепно-мозговые нервы - без очаговой патологии (в анамнезе - черепно-мозговая травма), другие органы и системы без патологии.

Оперативные вмешательства - аппендэктомия. Аллергия на антибактериальные препараты группы пенициллина в виде петехиальной сыпи.

УЗС органов малого таза и мошонки: простата несколько увеличена, повышенной эхоплотности. в головке левого придатка жидкостное образование до 2 мм в диаметре.

Анализ эякулята: объем - 5 мл, серо-белого цвета, вязкость повышена, разжижение 60 минут. Концентрация - 60 млн. в 1 мл, подвижных - 50%, из них активноподвижных - 40%, морфологически измененных нет, агглютинация - (++), лецитиновые зерна - (+), лейкоциты - 15-17-20 в поле зрения, клетки сперматогенеза - нет. ПАМГ-2 спермы иммунодиффузионным методом - 1:32.

Ds: Бесплодие II. Хронический простатоэпидидимит в стадии ремиссии.

Получал лечение: противовоспалительное, антибактериальное, аппаратную физиотерапию - без особого эффекта.

Показатели подвижности на анализаторе клеточных тест-объектов с лазерным излучением в виде таблиц с числовыми выражениями частоты попадания подвижных сперматозоидов в фиксированную область в эякуляте с уровнем активноподвижных сперматозоидов 12 млн/мл (в норме более 26 млн/мл) (см. табл. 2).

Заключение: добавление ПАМГ-2 к пробе эякулята привело к увеличению подвижности на 315% или в 3 раза (p < 0,01).

Пример 3.

Больной Сорокин Р.Б., образование среднее специальное, отмечает бесплодие в 1-ом браке. Жена по данным обследования - здорова.

Морфотип мужской: оволосение по мужскому типу, скудное, костно-мышечная система развита удовлетворительно, подкожно-жировая клетчатка развита умеренно, конституция по нормостеническому типу.

Состояние полового аппарата: оволосение по мужскому типу, наружные половые органы развиты правильно, мошонка умеренно пигментирована, складчатость выражена, пальпация органов мошонки и наружней части уретры безболезненная. Предстательная железа эластичной консистенции, междолевая борозда выражена, пальпация безболезненная, семенные пузырьки при пальпации безболезненные.

Физикальное обследование: соматически практически здоров. В анамнезе: перенес острый бронхит. Оперативные вмешательства: аппендэктомия.

УЗИ органов малого таза без патологии.

Анализ эякулята: объем - 4 мл, цвет - серая, вязкость - снижена, разжижение через 30 минут, концентрация 100 млн. в 1 мл, подвижных - 20%, активноподвижных - нет, морфологически измененных нет, агглютинация - (++), лейкоцитов 0-5-3 в поле зрения. ПАМГ-2 спермы иммунодиффузионным методом - 1:32.

Ds.: Бесплодие I. Олигозооспермия III степени.

Астенозооспермия.

Получал лечение: препараты мужских половых гормонов, тропных гормонов гипофиза, лазеро-терапию - без особого эффекта.

Для улучшения показателей подвижности сперматозоидов применялся препарат ПАМГ-2.

Показатели подвижности сперматозоидов на анализаторе клеточных тест-объектов с лазерным излучением в виде таблиц с числовым выражением частоты попадания подвижных сперматозоидов в фиксированную область в эякуляте с исходным уровнем подвижности 2 млн/мл подвижных форм (в норме более 26 млн/мл) (см. табл. 3).

Заключение: внесение ПАМГ-2 в сперму привело к увеличению подвижности на 52% или в 1,5 раза (p < 0,5), что указывает на неэффективность воздействия ПАМГ-2 в данном случае.

Из приведенных примеров видно, что внесение ПАМГ-2 в дозе 0,1 мл 0,05% раствора в 0,9 мл спермы приводит к усилению подвижности сперматозоидов in vitro в 3-5 раз и может быть использовано для обработки эякулятов со сниженной исходной подвижностью (при воспалении придаточных желез в стадии ремиссии) независимо от уровня эндогенного ПАМГ-2 в сперме, при подготовке для использования в ЭКО и искусственной инсеменации.

Заявляемым способом обработана сперма от 36 мужчин. Достоверное усиление подвижности произошло в 32 эякулятах, что составило 89%
Преимущества способа:
1. Простота.

2. Высокая эффективность - 89%.

3. Сохранение высокой активности сперматозоидов в течение 24 часов.

Список литературы.

1. Бесплодие в супружестве / под ред. И.Ф. Юнды // Киев, "Здоровья". - 1990 - 464 с.

2. Городков В. Н., Посисеева Л.В., Василева Т.П., Татаринов Ю.С., Олефиренко Г. А., Борзова Н.Ю., Фетисова И.И. Организация профилактики невынашивания беременности в супружеской паре. // Метод. рекоменд. - Иваново. - 1991. - 12 с.

3. Еськов А.П., Лужецкий А.С., Гурилев О.М., Рязанов Ю.Н., Денисова Г.П. Оценка подвижности сперматозоидов человека с помощью лазерного устройства. // Урол. и нефрол. - 1986. N 4. - С. 57-59.

4. Топка Э. Г. , Горпинченко И.И., Малышкин И.Н. Этиология, патогенез, клиническая картина и лечение вторичного мужского бесплодия. // Урол. и нефрол. - 1993. - N 2 - С. 43-48.

5. Устинкина Т.И., Баласанян И.Г., Савичева А.М., Попова М.В., Грачева Н. Е. Значение обследования мужа в диагностике бесплодного брака. // Акуш. и гин. - 1986. - N 7. - С. 16-18.

6. Male infertility / Jequer A.M. // Brit. J. Obstet. and Gynaecol. - 1993. - 100, N 7 - P. 612-614.

7. Mason, Fenwick, Lawrence. A method treating an immune system disorder in a human by administering to the human therapeutically effective amount of an active substance selected from the group consisting of PP-14 // U.S. patent application Ser. N 295,734, filed Jan. 11, 1989, now U.S. Pat. N 5,039,521.

8. Panel P. , Chansigaud J.P., de Meeus J.B., Magnin G. Insemenation artificielles intra-uterines. // J. Gynecol. Obstet. Biol. Reprod. - 1995. - N 24 - p. 496-504.

Изобретение относится к медицине, а именно к андрологии, репродуктологии. Способ улучшения подвижности сперматозоидов в пробе эякулята заключается в том, что воздействие на пробу осуществляют раствором α₂ микроглобулина и при возрастании активности сперматозоидов более чем в 3 раза от исходной ее оценивают как высокую и достаточную для оплодотворения. Простота в исполнении, высокая эффективность и сохранение активности сперматозоидов в течение 24 ч позволяют широко использовать способ при искусственной инсеменации и экстракорпоральном оплодотворении. 3 табл.

Способ улучшения подвижности сперматозоидов в пробе эякулята, отличающийся тем, что воздействие на пробу осуществляют раствором α₂-микроглобулина и при возрастании активности сперматозоидов более чем в 3 раза от исходной ее оценивают как высокую и достаточную для оплодотворения.