Способ оценки протективного иммунитета к возбудителю бруцеллёза Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 G01N33/52 G01N33/53 

Изобретение относится к областям иммунологии и вакцинологии, а именно к лабораторной оценке протективного иммунитета, обеспечивающего иммунологическую защиту от заболевания бруцеллезом. Сущность изобретения состоит в определении с использованием проточной цитометрии значений коэффициента стимуляции Т-лимфоцитов CD3⁺IL-2Rα⁺(CD25⁺) в ответ на специфическую ex vivo активацию бруцеллезным антигеном.

Известно, что после проникновения в организм хозяина, бруцеллы способствуют ингибированию интенсивности иммуновоспалительных реакций, уклоняются от эффекторов врожденного иммунитета (нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки, NK-клетки, система комплемента и др.), в том числе за счет моделирования их защитных функций [1]. Кроме того, экспериментально было показано [2], что удаление полиморфноядерных клеток до начала формирования адаптивного иммунитета способствует более быстрой элиминации бруцелл, это свидетельствует о том, что нейтрофилы способствуют ингибированию иммунного ответа макроорганизма.

Адаптивный иммунитет организма на бруцеллезную инфекцию включает гуморальный и Т-клеточный иммунные ответы. Доказано, что PrpA (пропил-рацемаза) Brucella spp.способствует активной пролиферации В-лимфоцитов (активация Th2-иммунного ответа), синтезу моноцитами и регуляторными Т-клетками IL-10, подавлению продукции IFN-γ, TNF-α и усилению синтеза антипролиферативного фактора TGFβ1 клетками ММС. При этом доказано, что активный синтез антител не обеспечивает полное освобождение организма от инфекции [3-8].

Многими исследователями было показано, что протективный иммунитет против возбудителя бруцеллеза обеспечивается главным образом специфической активностью иммунного ответа Th1-типа (с эффективной антигенпрезентацией фагоцитами, экспрессией провоспалительных цитокинов) и эффекторной клеточно-опосредованной цитотоксичностью за счет профессиональных макрофагов и Т-лимфоцитов (CD3⁺). Вместе с тем известно, что Т-лимфоциты в кооперации с NK, NK-T-клетками выполняют функцию связующего звена врожденного и адаптивного иммунитета. Премированные Т-лимфоциты способны распознавать непептидные антигены без участия главного комплекса гистосовместимости (МНС). У людей специфические для бруцелл фосфоантигены (презентируются поверхностными молекулами АПК) активируют Т-клетки Vc9Vd2 в начальной стадии инфекции. Кроме того, CD3⁺CD8⁺ лимфоциты ингибируют внутриклеточное выживание бруцелл с помощью гранул и лиганда Fas, проявляют цитотоксичность (секреция гранулизина и кателицидина) в отношении инфицированных макрофагов и приводят Fas-FasL-опосредованной гибели [9-12].

Таким образом, для объективной оценки наличия и активности иммунитета к возбудителю бруцеллеза необходимо исследования реактивности популяции Т-лимфоцитов на антигены бруцелл. Кроме того, показатели антигенреактивности Т-клеток можно использовать с прогностической целью для определения наличия (отсутствия) показаний к вакцинации и оценки коллективного иммунитета против бруцеллеза.

К настоящему времени нормативно методической базы для количественной оценки напряженности протективного Т-клеточного иммунитета к возбудителю бруцеллеза не разработано.

К недостаткам способов оценки напряженности протективного иммунитета против бруцеллеза на основании анализа уровня специфических антител с использованием методов, регламентированных МУК 3.1.7.3402-16 «Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза» (ИФА, реакции агглютинации Хеддельсона и Райта, тест Кумбса и др.) можно отнести низкую информативность результатов иммуно-серологических реакций, так как, известно, что антитела не полностью защищают организм человека и животных от заболевания бруцеллезом. Серологические реакции и ИФА для поиска противобруцеллезных антител используются преимущественно для диагностики бруцеллеза. Кроме того, к недостаткам серологических реакций можно отнести относительно низкую диагностическую точность (чувствительность, специфичность), достигающую в некоторых случаях лишь не более 65-70%. В литературе описано достаточное количество случаев, демонстрирующих ненадежность регламентированных серологических тестов для диагностики бруцеллеза [13-16].

Не представляется возможным объективно оценивать протективную активность поствакцинального и постинфекционного противобруцеллезного иммунитета с использованием аллергологических тестов, регламентированных МУК 3.1.7.3402-16 и разделом XIII СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» (проба Бюрне, реакция лейкоцитолиза, цитометрический тест активации базофилов in vitro) [17, 18], так как аллергические реакции при бруцеллезе не в полной мере ассоциированы с напряженностью протективного иммунитета, а отражают наличие и степень гиперчувствительности организма к антигенам бруцелл и продуктам их жизнедеятельности [19]. Кроме того, проба Бюрне и реакция лейкоцитолиза обладают низкой диагностической специфичностью (не более 50%) и в настоящее время практически не используются на практике [20].

Исследователями разработан способ оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл, предусматривающий ИФА анализ культуральных супернатантов клеток периферической крови на наличие фактора некроза опухолей (ФНО-α), интерлейкина-1β (ИЛ-1β) и колониестимулирующего фактора (КСФ), синтезированных мононуклеарами и полинуклеарами клеток периферической крови in vitro под воздействием антигенов бруцелл. По содержанию и соотношению указанных цитокинов 1-1,25 (ΦΗΟ-α):2-2,50 (ИЛ-1β):3- 3,70 (КСФ) определяют иммуногенность изучаемых штаммов бруцелл [21].

Известен способ оценки поствакцинального иммунитета против бруцеллеза основанный на определении концентрации спонтанного и индуцированного антигеном гамма-интерферона (ИФН-γ) в культуральном супернатанте с помощью ИФА и последующим расчетом индекса стимуляции [22].

К основным недостаткам двух вышеуказанных способов оценки противобруцеллезного иммунитета можно отнести то, что они в основном позволяют судить об уровне иммуноаллергической перестройки организма к бруцеллезным антигенам и недостаточно объективно отражают количественные значения интенсивности иммунологической клеточной реакции с позиций исследования протективных (защитных) свойств специфического противобруцеллезного иммунитета. Кроме того, ФНО-α, ИЛ-1β и КСФ синтезируются клетками моноцитарно-макрофагальной системы и в большей степени опосредуют интенсивность воспалительной реакции и в меньшей - уровень приобретенного иммунитета.

В соответствии с фармакопейной статьей «Вакцина бруцеллезная живая» от 29.10.2015 № ФС.3.3.1.0011.15 [23] напряженность иммунитета после вакцинации оценивают с использованием биологических моделей (не менее 10 вакцинированных и 3 контрольных невакцинированных морских свинок), путем их заражения 2 минимальными дозами патогенного штамма Brucella melitensis 565 на 28-30 сутки после вакцинации. На 28-30 сутки после инфицирования животных подвергают эвтаназии и вскрытию. Бактериологическим методом исследуют печень, селезенку, регионарные и висцеральные лимфатические узлы. В течение 7 суток инкубируют посевы (37±1)°С, выделенные культуры дифференцируют. Судят о наличии протективного поствакцинального иммунитета, в том случае если у не менее чем 7 морских свинок, иммунизированных вакциной, при высевах из органов не выявлено роста патогенного штамма Brucella melitensis. У всех контрольных (неиммунизированных) животных должна быть бруцеллезная инфекция, т.е. выделение Brucella melitensis из паренхиматозных органов и лимфатических узлов.

К существенным недостаткам указанного способа оценки протективного иммунитета, а соответственно и иммуногенности, протективных свойствах противобруцеллезной вакцины, можно отнести длительность (более 2-х месяцев) и очень большую трудоемкость, ресурсоемкость и дороговизну процедуры. Также, этот способ требует соответствующей профессиональной подготовки и навыков у специалиста-бактериолога, организации безопасной лабораторной работы с особо опасной инфекцией (минимизация биологических рисков), условий для карантинирования, содержания, кормления лабораторных животных, в т.ч. инфицированных возбудителем бруцеллеза, а также существенных финансовых затрат на приобретение биомоделей, приготовления и контроль питательных сред. Указанные недостатки полностью ограничивают широкое применение этого методического подхода на практике.

Разработан способ оценки фактической привитости людей против бруцеллеза на ранних сроках после вакцинации с использованием антигенспецифического теста in vitro и проточной цитометрии. Который заключается в определении на 14 сутки после вакцинации количества лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы CD25 при стимуляции бруцеллезным антигеном. О факте привитости людей против бруцеллеза судят по наличию не менее чем двукратного увеличения количества CD25-позитивных лимфоцитов в образцах крови [24].

Указанный способ предполагает лабораторное подтверждение факта иммунизации (фактической привитости), т.е. подтверждение иммунного ответа на вакцину на ранних сроках после иммунизации (14 сут). Однако метод не позволяет оценить наличие и напряженность протективного иммунитета, сформировавшегося после вакцинации.

В качестве прототипа можно рассматривать методический подход для оценки формирования поствакцинального иммунитета против бруцеллеза с использованием клеточной антиген-стимулированной реакции in vitro. Методика позволяет исследовать in vitro реакцию клеточного звена иммунитета на антиген по совокупности показателей интенсивности экспрессии лимфоцитами маркеров активации CD25, CD69, МНС-II, CD95 и др. в динамике развития иммунологической реакции [25-27].

К общему основному недостатку вышеуказанного подхода можно отнести отсутствие критериально-прогностического значения, количественно отражающего степень активности протективного иммунитета, т.е. того показателя специфического иммунного статуса (напряженность), который прогнозируемо обеспечивает иммунологическую защиту от заболевания бруцеллезом.

Цель заявленного изобретения - создание способа оценки наличия и протективной активности (защитного уровня) поствакцинального и постинфекционного иммунитета к возбудителю бруцеллеза, основанного на анализе антигенреактивности Т-лимфоцитов - CD3⁺IL-2Rα⁺. Увеличение количества активированных антигеном Т-лимфоцитов (CD3⁺IL-2Rα⁺) свидетельствует о наличии у обследуемого пула премированных лимфоцитов, несущих антигенспецифические рецепторы (рецепторы к антигенам бруцелл), которые образовались при взаимодействии антигенов бруцелл с иммунной системой хозяина в результате инфекционного процесса или формирования поствакцинального иммунитета.

Поставленная цель решается за счет применения клеточного антигенспецифического теста (КАСТ) и проточно-цитометрического анализа, что позволяет в заявляемом способе количественно (в %) учесть реакцию активации гейтированной (цитометрически выделенной) популяции CD3⁺-лимфоцитов по интенсивности экспрессии рецептора интерлейкина-2 (IL-2Rα, CD25) с последующим расчетом коэффициента стимуляции Т-лимфоцитов по формуле:

KC=(a-b)/a × 100%,

где:

a - относительный уровень содержания в крови активированных антигеном CD3⁺IL-2Rα⁺-лимфоцитов (в опытной пробе после инкубации с бруцеллезным антигеном);

b - относительный (фоновый, естественный) уровень в крови активированных CD3⁺IL-2Rα⁺-лимфоцитов (в контрольной пробе после инкубации со стерильным изотоническим раствором натрия хлорида).

Интерпретация результатов исследования:

- значения КС от 0 до 39,9% - слабый ex vivo ответ Т-лимфоцитов на бруцеллезный антиген, протективный иммунитет отсутствует (отрицательная реакция);

- значения КС от 40 до 49,9% - умеренный ex vivo ответ Т-лимфоцитов на бруцеллезный антиген, протективный иммунитет слабый или отсутствует (сомнительная реакция);

- значения КС 50% и более - сильный ex vivo ответ Т-лимфоцитов на бруцеллезный антиген, наличие протективного иммунитета (положительная реакция).

Для постановки теста необходимо подготовить и промаркировать 2 пробирки (1 - опытная, 2 - контрольная). В каждую пробирку внести по 50 мкл исследуемой крови стабилизированной гепарином. В опытную пробирку добавить 50 мкл бруцеллезного антигена, в контрольную - 50 мкл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Во все пробирки внести по 100 мкл среды для выращивания культур клеток с L-глутамином (например, DMEM) и закрыть целлюлозными газопроницаемыми пробками. Далее пробы необходимо перемешать с помощью перемешивающего устройства в течение 5 секунд и инкубировать при 37±1°С в условиях повышенного содержания СО₂ (5-10%) в течение 24 часов. После инкубации, из проб с помощью дозатора необходимо удалить надосадочную жидкость, образовавшуюся в результате естественного оседания форменных элементов крови. Далее перемешать с помощью перемешивающего устройства в течение 5 секунд. Из опытной и контрольной пробирок отобрать по 50 мкл образца в отдельные, соответствующим образом маркированные пробирки, в которые внести по 5 мкл моноклональных антител к антигенам CD3 и IL-2Rα и инкубировать 15 мин при температуре 18-25°С. После инкубации во все пробирки внести по 450 мкл лизирующего эритроциты раствора в рабочем разведении 1:10. Инкубировать 5-10 мин при температуре 18-25°С и центрифугировать 5 минут при 700 g. Супернатант необходимо удалить. Во все пробирки внести по 450 мкл отмывочной жидкости и перемешать в течение 5 секунд с помощью перемешивающего устройства. Пробы центрифугировать 5 минут при 700 g и удалить супернатант. К осадку добавить 450 мкл отмывочного буфера и анализировать пробу с помощью проточного цитометра (в течение 2-3 ч) с использованием программы для учета результатов цитометрического исследования.

Заявляемый способ отличается наличием возможности на основании лабораторных исследований определить наличие/отсутствие протективного противобруцеллезного иммунитета и количественно оценить его специфическую (защитную) активность, которую отражает значение коэффициента антигенной стимуляции Т-лимфоцитов ex vivo, учитываемый по интенсивности антиген-индуцированной экспрессии рецептора к IL 2. Заявляемый способ позволяет получить критериально-прогностическое значение, количественно отражающее степень активности (наличие протективных свойств) иммунитета, т.е. того показателя специфического иммунного статуса (напряженность), который прогнозируемо обеспечивает иммунологическую защиту от заболевания бруцеллезом. К не менее важному отличию заявляемого способа можно отнести методическую простоту постановки реакции, быстроту получения результата - через 24 ч. Учет реакции производится экспрессным высокоточным методом проточной цитометрии. Заявляемый способ в сравнении с методом, регламентированным ФС «Вакцина бруцеллезная живая» от 29.10.2015 № ФС.3.3.1.0011.15 существенно менее трудоемкий и менее ресурсозатратами, не требует приобретение и содержание лабораторных животных и может выполняться в клинических лабораториях, не имеющих обязательную лицензию на работу с особо опасной инфекцией, а соответственно имеет потенциальную возможность более широкого внедрения в лабораторную практику.

Возможность практического применения предлагаемого способа иллюстрируется примером его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример: учитывая объективную невозможность проведения у людей экспериментальной оценки состояния протективного иммунитета, соответственно исследования степени иммунологической защиты, с использованием заявляемого способа, были проведены в условиях экспериментального моделирования бруцеллезной инфекции путем заражения лабораторных животных наиболее патогенным для человека штаммом Brucella melitensis. Всего обследовано 280 аутбредных белых мышей (самцы весом 18-20 г). Животных разделили на 4 группы: биомоделей из 1, 2 и 3 опытных групп иммунизировали культурой Brucella abortus 19ВА («Вакцина бруцеллезная живая» НПО «Микроген» Минздрава России) в дозах, соответственно 1×10³, 1×10⁵ и 1×10⁸ живых микробных клеток (ж.м.к.) в 0,5 мл стерильного изотонического раствора. Микробную взвесь вводили подкожно в паховую область. Животные 4 группы были контрольными им вводили аналогичный объем стерильного физиологического раствора. Перед вакцинацией и через 7, 14, 30, 60 и 90 суток после иммунизации у мышей всех групп (по 10 особей от каждой группы) брали кровь для цитометрического анализа. Уровень антигенреактивных Т-лимфоцитов определяли с применением КАСТ, анализируя на проточном цитометре фоновое количество CD3⁺IL-2Rα⁺ и численность этой популяции после инкубации с бруцеллезным антигеном. Для учета результатов антигениндуцированной активации рассчитывали коэффициент стимуляции (КС) лимфоцитов. На 90 день после иммунизации, вакцинированных (по 12 жив. от каждой группы) и контрольных биомоделей заражали подкожно в паховую область двухсуточной вирулентной культурой Brucella melitensis 16М в дозе 1×10³ живых микробных клеток в 0,5 мл стерильного изотонического раствора. На 21 сутки после инфицирования производили убой и бактериологическое исследования биоматериала от животных. Исследовали паховые, аксиллярные, парааортальные лимфатические узлы, селезенку и печень. Материал засевали в пробирки с Бруцеллагаром и Бруцелла-бульоном. Посевы выдерживали 21 сутки в термостате при температуре 37±0,5°С. Просмотр посевов в пробирках с агаром и бульоном проводили каждые 2 дня, из помутневших бульонов делали высевы в пробирки со скошенным агаром (посевы из бульона культивировали не менее 14 суток). Индекс инфицированности (ИИ) организма биомоделей, после заражения патогенным штаммом бруцелл, вычисляли по формуле: х=(а*100)/(b*с), где: x - индекс инфицированности (%), а - число выделенных культур, b - количество животных в группе, с - количество объектов (органы, ткани) отобранных от одной биомодели. Вместе с тем рассчитывали индекс интенсивности обсеменения внутренних органов (ИИОВО), который определяли путем деления суммы баллов, характеризующих интенсивность роста бруцелл, на число исследуемых объектов, умноженное на 4. Интенсивность роста культур бруцелл оценивали по 4-х бальной системе. Для статистической обработки полученных результатов применяли аналитический пакет Microsoft Excel 2010. Рассчитывали среднюю (х_ср), интервал (min+max), медиану (Me) и показатель корреляции (r) по методу Пирсона. Связь между переменными учитывали по шкале Е.П. Голубкова. Различия считали статистически значимыми при р≤0,05. Вместе с тем проводили регрессионный анализ влияния уровня антигереактивности популяции клеток CD3⁺IL-2Rα⁺ на индексы инфицированности и интенсивности обсеменения внутренних органов организма биомоделей из групп сравнения после заражения патогенным штаммом бруцелл.

По результатам цитометрических исследований было установлено, что вне зависимости от срока наблюдения наиболее интенсивная активация пулов клеток CD3⁺IL-2Rα⁺ отмечалась в группе животных, иммунизированных наиболее высокой дозой Brucella abortus 19-ВА (1×10⁸ ж.м.к.). Анализ тесноты связи динамики уровня интенсивности экспрессии рецепторов активации и увеличения количества вводимых ж.м.к. вакцинного штамма бруцелл указал на наличие тесной прямой прямо пропорциональной зависимости. Так, на 7 сут коэффициент линейной корреляции составил r=0,844, 14 сут - r=0,803, 30 сут - r=0,843, 60 сут - r=0,932 и 90 сут - r=0,940.

В результате проведения биологических и бактериологических исследований было установлено, что после заражения мышей референтным патогенным штаммом В. melitensis 16М (1×10³ ж.м.к.) у 100% особей контрольной группы регистрировалось развитие бруцеллезной инфекции, из которых 25% с регионарной, 75% с генерализованной инфекцией, ИИ составил 73,3%, ИИОВО - 0,521 ед. Среди животных 1 группы у 9 особей (75%) был исследованиями подтвержден бруцеллез (55% - регионарная, 45% - генерализованная инфекция), ИИ составил 31,7%, ИИОВО - 0,204 ед. В результате инфицирования мышей из 2 группы только у 41,7% отмечалось развитие бруцеллеза, из которых у 80% - регионарная, 20% -генерализованная инфекция), ИИ составил 21,7%, ИИОВО - 0,108 ед. У животных 3 группы не регистрировалось развитие бруцеллезной инфекции после заражения патогенным штаммом бруцелл (таблица).

Анализ зависимости изменения доли антигенреактивного пула CD3⁺IL-2Rα⁺ клеток, количества животных, заразившихся бруцеллезом, а также значений ИИ, ИИОВО у биомоделей из групп сравнения указал на высокую степень корреляции исследуемых показателей. Исследования показали наличие обратно пропорциональной совместной изменчивости - увеличения доли пула антигенреактивных Т-клеток и снижения количества биомоделей, заразившихся бруцеллезом (r=-0,966), ИИ (r=-0,837), ИИОВО (r=-0,795).

Регрессионный анализ зависимости интенсивности антигеспецифической ex vivo активации Т-клеток с уровнем инфицированности и интенсивности обсеменения внутренних органов организма биомоделей из групп сравнения, после заражения патогенным штаммом бруцелл показал высокую степень влияния состояния антигенреактивности у животных CD3⁺IL-2Rα⁺ (R²=0,932, 0,701, 0,632).

В представленном примере показано, что по результатам исследований была установлена тесная (сильная) прямая пропорциональная связь величины дозы (количества вводимых живых микробных клеток Brucella abortus 19 ВА) вакцины и повышения in vitro интенсивности антигенреактивности Т-лимфоцитов. У биомоделей 3 группы (доза вакцины 1×10⁸ ж.м.к.) установлены наиболее высокие значения интенсивности антигениндуцированной активации Т-лимфоцитов. Наиболее высокая численность пула антигенреактивных CD3⁺IL-2Rα⁺ сохранялась во все сроки наблюдения - до 90 суток после иммунизации. Установлено наличие тесной корреляционной связи (r=-0,841÷-0,966, R²=0,708÷43,969) высокой интенсивности специфической активации Т-лимфоцитов ex vivo и уровня протективного иммунитета после иммунизации против бруцеллеза, обеспечивающего защиту от заражения наиболее патогенным видом бруцелл - Brucella melitensis. Выявлено, что у вакцинированных против бруцеллеза биомоделей при значении коэффициента стимуляции Т-лимфоцитов 50% и более (по интенсивности антиген-индуцированной ex vivo экспрессии IL-2Rα⁺) обеспечивается 100% защита от развития бруцеллезной инфекции после заражения Brucella melitensis в дозе 1×10³ живых микробных клеток (более двух минимальных инфицирующих доз).

Таким образом, заявляемый способ реально осуществим и позволяет проводить оценку протективного противобруцеллезного иммунитета и количественно учитывать его специфическую (защитную) активность, которую отражает значение коэффициента антигенной стимуляции Т-лимфоцитов ex vivo, оцениваемый цитометрически по интенсивности антиген-индуцированной экспрессии рецептора к IL 2.

Используемая литература

1. Contreras-Rodriguez A, Ramirez-Zavala В, Contreras A, Schurig GG, Sriranganathan Ν, Lopez-Merino A. Purification and characterization of an immunogenic aminopeptidase of Brucella melitensis. Infect Immun. 2003 Sep;71(9):5238-44. doi: 10.1128/IAI.71.9.5238-5244.2003

2. Mora-Cartin R, Gutierrez-Jimenez C, Alfaro-Alarco η A, Chaves-Olarte E, Chacon-Diaz C, Barquero-Calvo E, Moreno E. 2019. Neutrophils dampen adaptive immunity in brucellosis. Infect Immun 87:e00118-19 https://doi.org/10.1128/IAI.00118-19.

3. Lopez-Santiago R, Sanchez-Argaez AB, De Alba-Nunez LG, Baltierra-Uribe SL, Moreno-Lafont MC. Immune Response to Mucosal Brucella Infection. Front Immunol. 2019 Aug 20;10:1759. doi: 10.3389/fimmu.2019.01759. PMID: 31481953; PMCID: PMC6710357.

4. Dancella M. Fernandes, Xiaosui Jiang, Jae Ho Jung, Cynthia L. Baldwin, Comparison of Τ cell cytokines in resistant and susceptible mice infected with virulent Brucella abortus strain 2308, FEMS Immunology & Medical Microbiology, Volume 16, Issue 3-4, December 1996, Pages 193-203, https://doi.org/10.1111/j.1574-695X.1996.tb00136.x/

5. Jiao, H.; Zhou, Z., Li, B. Xiao, Y.; Li, M.; Zeng, H.; Guo, X.; Gu G. The Mechanism of Facultative Intracellular Parasitism of Brucella. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3673. https://doi.org/10.3390/ijms22073673

6. Vitry MA, Hanot Mambres D, De Trez C, Akira S, Ryffel B, Letesson JJ, Muraille E. Humoral immunity and CD4+Th1 cells are both necessary for a fully protective immune response upon secondary infection with Brucella melitensis. J Immunol. 2014 Apr 15;192(8):3740-52. doi: 10.4049/jimmunol. 1302561. Epub 2014 Mar 19. PMID: 24646742.

7. Cannella AP, Tsolis RM, Liang L, Feigner PL, Saito M, Sette A, Gotuzzo E, Vinetz JM. Antigen-specific acquired immunity in human brucellosis: implications for diagnosis, prognosis, and vaccine development. Front Cell Infect Microbiol. 2012 Feb 1;2:1. doi: 10.3389/fcimb.2012.00001. PMID: 22919593; PMCID: PMC3417515.

8. Dadelahi AS, Lacey CA, Chambers CA, Ponzilacqua-Silva B, Skyberg JA. В Cells Inhibit CD4+Τ Cell-Mediated Immunity to Brucella Infection in a Major Histocompatibility Complex Class II-Dependent Manner. Infect Immun. 2020 Apr 20;88(5):e00075-20. doi: 10.1128/IAI.00075-20. PMID: 32071068; PMCID: PMC7171242.

9. Skendros P, Pappas G, Boura P. Cell-mediated immunity in human brucellosis. Microbes Infect. 2011 Feb;13(2):134-42. doi: 10.1016/j.micinf.2010.10.015. Epub 2010 Oct 27. PMID: 21034846.

10. Kianmehr, Z.; Soleimanjahi, H.; Ardestani, S.K.; Fotouhi, F.; Abdoli, A. Influence of Brucella abortus lipopolysaccharide as an adjuvant on the immunogenicity of HPV-16 L1VLP vaccine in mice. Med. Microbiol. Immunol. 2015,204, 205-213

11.Salcedo, S.P.; Marchesini, M.I.; Lelouard, H.; Fugier, E.; Jolly, G.; Balor, S.; Muller, Α.; Lapaque, N.; Demaria, O.; Alexopoulou, L.; et al. Brucella control of dendritic cell maturation is dependent on the TIR-containing protein Btpl. PLoS Pathog 2008, 4, e21.

12. Li, W.; Ke, Y.; Wang, Y.; Yang, M.; Gao, J.; Zhan, S.; Xinying, D.; Huang, L.; Li, W.; Chen, Z.; et al. Brucella TIR-like protein TcpB/Btpl specifically targets the host adaptor protein MAL/TIRAP to promote infection. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2016, 477, 509-514.

13. Corbel M.J. Brucellosis: an overview. Emerg. Infect. Dis., 1997, no. 3, pp. 213-221. doi: 10.320 l/eid0302.970219

14. Naha K., Dasari S., Pandit V., Seshadri S. A rare case of seronegative culture-proven infection with Brucella suis. Australas Med. J., 2012, vol. 5, no. 7, pp. 340-343. doi: 10.4066/AMJ.2012.1177

15. Potasman I., Even L., Banai M., Cohen E., Angel D., Jaffe M. Brucellosis: an unusual diagnosis for a seronegative patient with abscesses, osteomyelitis, and ulcerative colitis. Rev. Infect. Dis., 1991, vol. 13, pp.1039- 1042.

16. Tekin-Koruk S., Duygu F., Gursoy В., Karaagac L., Bayraktar M. A rare case of seronegative neurobrucellosis. Ann. SaudiMed., 2010, vol. 30, no. 5, pp.412-414. doi: 10.4103/0256-4947.67084.

17. Методические указания МУК 3.1.7.3402-16 «Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза» URL: https://docs.cntd.ru/document/456083631

18. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» URL: https.7/docs.cntd.ru/document/573660140

19. Galinska ЕМ, Zagorski J. Brucellosis in humans - etiology, diagnostics, clinical forms. Ann Agric Environ Med. 2013;20(2):233-8. PMID: 23772567.

20. Бруцеллез. Современное состояние проблемы (издание второе, дополненное) / под ред. Г.Г. Онищенко, А.Н. Куличенко. - Н. Новгород: Союзполиграф, Кириллица, 2021 - 356 с.

21. Пат. RU 2009127461 А Российская Федерация, МПК G01N 33/50(2006.01) Способ оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов / Нурпейсова А.Х и др.; заявитель и патентообладатель ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». - №2009127461/15; заявл. 16.07.2009; опубл. 27.01.2011 Бюл. №3 https://patentimages.storage.googleapis.com/0c/b8/2a/347e32b0b7U22/RU200912 7461A.pdf

22. Пат .RU 2740009 C1 Российская Федерация, МПК G01N 33/53 (2006.01). Способ оценки поствакцинального иммунитета против бруцеллеза / Нурпейсова А.Х и др.; заявитель и патентообладатель ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора. - №2019122697; заявл. 15.07.2019; опубл. 30.12.2020 Бюл. №1 URL: https://patenton.ru/patent/RU2740009C1.pdf

23. Фармакопейная статья «Вакцина бруцеллезная живая» ФС.3.3.1.0011.15 Взамен ГФ X, ст. 718, ФС 42-3177-https://pharmacopoeia.ru/fs-3-3-l -0011 -15-vaktsina-brutselleznava-zhivaya/

24. Пат. RU 2714136 C1 Российская Федерация, МПК G01N 33/53 (2006.01). Способ оценки фактической привитости людей против бруцеллеза на ранних сроках после вакцинации / Пономаренко Д.Г. и др.; заявитель и патентообладатель ФКУЗ Ставропольский противочумный институт. - №2019109438; заявл. 2019.03.29; опубл. 2020.02.12 Бюл. №5 URL: https://vandex.ru/patents/doc/RU2714136C1 20200212

25. Almajid FM. Lymphocyte activation test for diagnosis of seronegative brucellosis in humans. Indian J Pathol Microbiol. 2011 Oct-Dec;54(4):775-81. doi: 10.4103/0377-4929.91499. PMID: 22234109

26. Костюченко M.B., Пономаренко Д.Г., Ракитина Е.Л., Логвиненко О.В., Санникова И.В., Дейнека Д.А., Голубь О.Г. Перспектива оценки антигенреактивности лимфоцитов in vitro для диагностики острого бруцеллеза. Инфекция и иммунитет.2017;7(1):91-96. https://doi.org/10.15789/2220-7619-2017-1-91-96

27. Костюченко М.В., Ракитина Е.Л., Пономаренко Д.Г., Логвиненко О.В., Курчева С.А., Бердникова Т.В., Русанова Д.В., Куличенко А.Н. Изучение формирования клеточного поствакцинального иммунитета против бруцеллеза в лимфоцитарных тестах in vitro с использованием экспериментального антигенного комплекса. Медицинская иммунология. 2019;21(3):547-554. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2019-3-547-554/.

Изобретение относится к областям микробиологии и иммунологии. Описан способ оценки протективного иммунитета к возбудителю бруцеллеза. Способ отличается возможностью установления значения критериального показателя наличия/отсутствия протективного противобруцеллезного иммунитета. Указанный показатель получается на основании цитометрического учета реакции антигенной ex vivo активации популяции CD3⁺-лимфоцитов по интенсивности антигениндуцированной экспрессии рецептора интерлейкина-2 (IL-2Rα), с последующим расчетом коэффициента антигенной стимуляции CD3⁺IL-2Rα⁺-лимфоцитов по формуле. Техническим результатом является меньшая трудоемкость и меньшая ресурсозатратность способа, который не требует приобретение и содержание лабораторных животных и может выполняться в клинических лабораториях, не имеющих обязательную лицензию на работу с особо опасной инфекцией, а соответственно имеет потенциальную возможность более широкого внедрения в лабораторную практику. 1 табл., 1 пр.

Способ оценки протективного иммунитета к возбудителю бруцеллеза, отличающийся возможностью установления значения критериального показателя наличия/отсутствия протективного противобруцеллезного иммунитета, полученного на основании цитометрического учета реакции антигенной ex vivo активации популяции CD3⁺-лимфоцитов по интенсивности антигениндуцированной экспрессии рецептора интерлейкина-2 (IL-2Rα), с последующим расчетом коэффициента антигенной стимуляции CD3⁺IL-2Rα⁺-лимфоцитов по формуле:

КС=(а-b)/а × 100%,

где:

а - относительный уровень содержания в крови активированных антигеном CD3⁺IL-2Rα⁺-лимфоцитов;

b - относительный (фоновый) уровень в крови CD3⁺IL-2Rα⁺-лимфоцитов,

значение КС 50% и более указывает на наличие протективного иммунитета к возбудителю бруцеллеза.