СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ К ТОКСОПЛАЗМАМ Российский патент 2023 года по МПК A61B10/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к инфекционным болезням и эпидемиологии, может быть использовано при обследовании лиц с подозрением на токсоплазмоз для установления факта сенсибилизации к токсоплазменным антигенам, а также для оценки степени эндемичности территории и риска заражения токсоплазмами.

Токсоплазмоз - паразитарное заболевание, вызываемое внутриклеточным простейшим - Toxoplasma gondii. Для токсоплазмоза характерна убиквитарность, инвазия регистрируется практически во всем мире. Показали зараженности токсоплазмами населения составляют от 5% до 88% в разных странах. У иммунокомпетентных лиц преобладают латентные формы заболевания. Эффект латентного токсоплазмоза на здоровье населения может быть гораздо более серьезным, чем обычно предполагается. Опубликованы данные, свидетельствующие о сильной корреляции токсоплазмоза с расстройствами в костно-мышечной, пищеварительной системах, с некоторыми нейродегенеративными и психическими расстройствами [Flegr J, Escudero DQ. Impaired health status and increased incidence of diseases in Toxoplasma-seropositive subjects - an explorative cross-sectional study // Parasitology. 2016 Dec; 143(14): 1974-1989.; David C.N., Frias E.S., Szu J.I., VieiraP.A., Hubbard J. A., Lovelace J. at al. GLT-1-Dependent Disruption of CNS Glutamate Homeostasis and Neuronal Function by the Protozoan Parasite Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 2016; Jun 9;12(6):e1005643. doi: 10.1371/journal.ppat. 1005643. eCollection 2016 Jun.], с ревматоидным артритом [El-Henawy AA1, Hafez EAR2, Nabih N3, Shalaby NM3, Mashaly M. Anti-Toxoplasma antibodies in Egyptian rheumatoid arthritis patients // Rheumatol Int. 2017 May;37(5):785-790. doi: 10.1007/s00296-017-3703-8.], с клиническими проявлениями менопаузы, и, даже влиять на глобальную вариацию соотношения пола потомства у людей [Dama MSI, Martinec Nováková L2, Flegr J3. Do differences in Toxoplasma prevalence influence global variation in secondary sex ratio? Preliminary ecological regression study // 58. Parasitology. 2016 Aug;143(9):1 193-203. doi: 10.1017/S0031182016000597].

Иммунный ответ при токсоплазмозе включает как феномены клеточного иммунитета, так и выработку специфических антител различных классов. Ведущая роль в установлении факта зараженности токсоплазмами принадлежит оценке результатов серологических методов обнаружения антител. Такие методы, как реакция связывания комплемента (РСК), иммунофлюоресценции, непрямой агглютинации (РНГА) в настоящее время практически не применяются из-за их недостаточной чувствительности и специфичности. [Васильев В.В., Тимченко В.Н., Васильева И.С. Современная диагностика токсоплазмоза у детей // Ж. Детские инфекции. - 2004. - №1. с. 63-66]. В настоящее время методом выбора является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Для идентификации текущей, недавней или прошлой инфекции, вызванной токсоплазмами выявляют специфические антитела классов М (IgM), G (IgG), A (IgA). Недостатком серологических реакций, в том числе, ИФА для выявления лиц, зараженных токсоплазмами, является вероятность получения ложноположительных результатов вследствие перекрестных реакций с антигенами других микроорганизмов, имеющих общие детерминанаты с токсоплазмами. Кроме того, многолетняя персистенция возбудителя сопровождается "плавающими" концентрациями специфических антител [Лобзин Ю.В., Буланьков Ю.И., Казанцев А.П., Васильев В.В. Хронический токсоплазмоз: рациональная терапия. // Российские медицинские вести. - 1997. - №2. - С. 67-69], следовательно, не исключены ложноотрицательные результаты исследования.

Основную роль в устойчивости к токсоплазмам играет клеточно-опосредованный иммунитет. Антигенпредставляющие клетки, такие как макрофаги и дендритные клетки, активируют Т-клетки и индуцируют развитие Th1-клеток и антигенспецифических киллерных CDS-T-клеток. [Sasai M1,2, Pradipta A1, Yamamoto M1,2. Host immune responses to Toxoplasma gondii. // Int Immunol. 2018 Mar 10;30(3): 113-119. doi: 10.1093/intimm/dxy004]. Зараженность токсоплазмами можно определить при оценке феноменов клеточного иммунитета в ответ на стимуляцию токсоплазменными антигенами в реакциях in vivo или in vitro.

Известен способ определения степени гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к токсоплазмам путем постановки внугрикожной пробы с токсоплазмином [Методические рекомендации «Клиника, лечение и диагностика токсоплазмоза» - М., 1981. - 25 с]. Способ заключается во внутрикожном введении токсоплазменного аллергена. Учет реакции проводят через 24 и 48 часов. У лиц, инфицированных токсоплазмами на месте введения аллергена возникает гиперемия и определяемый пальпаторно инфильтрат. Положительной считают реакцию, если через 24 часа после инъекции диаметр участка покраснения и инфильтрата кожи не менее 10 мм и через 48 часов не уменьшается. К недостаткам метода относятся инвазивность процедуры, риск развития сильной аллергической реакции у лиц с иммунопатологическими состояниями, сложность стандартизации препарата. В настоящее время в России и зарубежных странах данный метод практически не используется.

Известен метод определения иммунологической реактивности при токсоплазмозе в реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) с токсоплазменным антигеном [Лобзин Ю.В., Калинина Н.М., Васильев В.В., Сысоев К.А. Иммуномодуляция токсоплазмином в лечении хронического токсоплазмоза // Медиц. Иммунология. - 2000. - Т. 2 - №3. - С. 299-304].

Однако, РТМЛ имеет ряд недостатков, в том числе, невозможность количественного выражения результатов анализа.

Также известен способ оценки степени сенсибилизации лейкоцитов к токосплазмам с использованием реакции специфического лейкоцитолиза (РЛ) [Саидов М.С., Царуева Т.В., Саидова Б.М., Джалилова Д.Н., Саидова З.М. Аллергодиагностика токсоплазмоза // Вестник ДГМА. - 2015 - №1(14). - С. 34-36]. Суть метода заключается в способности сенсибилизированных лейкоцитов лизироваться в присутствии специфического антигена. Однако, и в данном способе, оценка результата как положительного при лизисе 15% лейкоцитов, является субъективной.

Наиболее близким по технической сущности решением к заявленному изобретению, является способ оценки сенсибилизации лимфоцитов крови к токсоплазмам в реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) [Веремеевич Л.И., Пацула Ю.И., Боровец Н.И. Диагностическое значение бластной трансформации при токсоплазмозе у детей // - Мед. Иммунология. - 1999. - Т. 1. - №3-4. - С. 52]. Способность к бласттрансформации отражает функциональную активность иммунокомпетентных клеток. Способ включает инкубацию при 37°С гепаринизированной крови с токсоплазмозным антигеном в ростовой среде с токсоплазменным антигеном в течение 72 часов. За 18 часов до окончания культивирования, в культуры клеток (опытную и контрольную) вносили ³Hi-тимидин. По окончании культивирования, клетки крови собирали на стекловолоконные фильтры, высушивали и учитывали результаты радиометрическим методом, измеряя уровень включения в ДНК лимфоцитов тимидина, меченного тритием. Основным недостатком прототипа является использование радиоактивных реактивов, работа с которыми требует особых условий организации лаборатории, что ограничивает применение этого метода.

Задачей изобретения является создание способа определения специфической сенсибилизации лимфоцитов к токсоплазмам, основанного на модифицированной реакции бласттрансформации лимфоцитов (мРБТЛ) с токсоплазменным антигеном (Toxoplasma gondii, штамм RH), определении концентрации спонтанного и антиген-индуцированного гамма-интерферона (ИФН-γ) в культуральном супернатанте с помощью ИФА с последующим расчетом индекса стимуляции и показателя разности значений концентрации антиген-индуцированного и спонтанного ИФН-γ. Выбор интерферона гамма в качестве маркера функциональной активации лимфоцитов связан тем, что согласно ряду исследований, ИФН-γ является одним из основных медиаторов иммунного ответа при токсоплазмозе, который вырабатывается иммунными клетками, в том числе, активированными Т-лимфоцитами [Meira CS1, Pereira-Chioccola VL1, Vidal JE2, de Mattos CC3, Motoie G1, Costa-Silva TA1, Gava R1, Frederico FB4, de Mattos LC. Cerebral and ocular toxoplasmosis related with IFN-γ, TNF-α, and IL-10 levels. // Front Microbiol. 2014 Oct 13;5:492. doi: 10.3389/fmicb.2014.00492; Mammari N1, Vignoles PI, Halabi MA2, Darde ML3, Courtioux B. Interferon gamma effect on immune mediator production in human nerve cells infected by two strains of Toxoplasma gondii. // Parasite. 2015;22:39. doi: 10.105l/parasite/2015039; Sasai M1,2, Pradipta A1, Yamamoto M1,2. Host immune responses to Toxoplasma gondii. // Int Immunol. 2018 Mar 10;30(3): 113-119. doi: 10.1093/intimm/dxy004].

Поставленная задача решается благодаря тому, что в заявляемом способе оценивается клеточно-опосредованная реакция в ответ на специфический токсоплазменный антиген в условиях in vitro. Предложенный способ отличается тем, что активация лимфоцитов оценивается по уровню антиген-индуцированной продукции ИФН-γ, как показателя активации клеточного иммунного ответа, в модифицированной реакции бласттрансформации лимфоцитов. Кроме того, определение концентрации спонтанного и антиген-индуцированного ИФН-γ в культуральном супернатанте проводится спектрофотометрически с помощью ИФА, при этом уровень специфического клеточного ответа оценивается по индексу стимуляции и разности концентраций антиген-индуцированного и спонтанного ИФН-γ в культуральном супернатанте.

Техническое решение позволяет оценивать специфический клеточный иммунитет при токсоплазмозе in vitro при помощи доступных лабораторных методов, оборудования и реактивов, не требующих высоких финансовых и трудозатрат, в том числе за счет применения коммерческих наборов тест-систем для определения ИФН-γ в биологических жидкостях.

Техническая сущность предлагаемого технического решения состоит в том, что с помощью мРБТЛ с водорастворимыми антигенами Toxoplasma gondii (штамм RH) и определения концентрации спонтанного и антиген-индуцированного ИФН-γ в культуральном супернатанте при помощи ИФА, проводят оценку состояния специфического клеточного иммунного ответа in vitro по индексу стимуляции и разности концентраций антиген-индуцированного и спонтанного ИФН-γ.

Описанное выше техническое решение «Способ определения специфической сенсибилизации лимфоцитов к токсоплазмам» осуществляется следующим образом. Сначала забирают кровь обследуемого пациента в вакуумную пробирку с зеленой крышкой (Li-гепарин/Na-гепарин). В две лунки стерильного круглодонного планшета для иммунологических реакций вносят по 145 мкл полной ростовой среды (ПРС) и по 25 мкл гепаринизированной крови. В одну из лунок вносят разведенный в ПРС токсоплазменный антиген, до конечного разведения 30-40 мкг/мл; во вторую лунку вносят ПРС в объеме, равном объему антигена. Контрольный (не содержащий токсоплазменный антиген) и опытный (содержащий токсоплазменный антиген) образцы инкубируют в течение 72 часов во влажной камере термостата или CO2-инкубатора.

Из полученных контрольного и опытного образцов крови отбирают культуральные супернатанты (надосадок) и используют их для определения концентрации ИФН-γ с помощью коммерческого набора реагентов тест-системы ИФА (например, «γ-Интерферон-ИФА-БЕСТ», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя.

По значению индекса стимуляции (ИС ГАМ) и разности значений концентрации антиген-индуцированного и спонтанного ИФН-γ (ДГАМ) судят о специфическом клеточном ответе на токсоплазменный антиген. Индекс стимуляции рассчитывается по формуле:

ИС ГАМ = Оп/К, где

Оп - значение опытного образца в пг/мл (антиген- индуцированная продукция ИФН-γ); К - значение контрольного образца в пг/мл (спонтанная продукции ИФН-γ)

Разность значений концентрации антиген-индуцированного и спонтанного ИФН-γ рассчитывают по формуле:

ΔГАМ = Оп - К, где

Оп - значение опытного образца в пг/мл (антиген-индуцированная продукция ИФН-γ); К - значение контрольного образца в пг/мл (спонтанная продукции ИФН-γ)

Для реализации способа используют:

1. Полная ростовая среда (ПРС): среда 199, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамин (2 mM), HEPES (10 mM), гентамицина сульфат 50 мкг/мл.

2. Контрольный образец крови (25 мкл).

3. Опытный образец крови (25 мкл).

4. Инактивированный водорастворимый токсоплазмозменный антиген, полученный из тахизоидов Toxoplasma gondii (штамм RH).

5. Раствор хлорида натрия 0,9%, стерильный, для разведения антигена.

6. Коммерческий набор реагентов для иммуноферментного определения концентрации γ-интерферона в сыворотке, плазме крови, культуральном супернатанте.

Для статистической обработки полученных результатов и построения графиков использовали программу Epitools. Вычисляли медиану, для характеристики разброса значений в выборках - интерквартильный размах (Q3-Q1). Для оценки достоверности различий между результатами групп применяли критерии Манна-Уитни-Вилкоксона, Стьюдента. Для расчета статистических показателей, отражающих вероятность правильного прогноза при оценке показателей, полученных заявленным способом (ИС ГАМ и ΔГАМ), диагностической специфичности, использовали ROC анализ [Goksuluk D, Korkmaz S, Zararsiz G, Karaagaoglu AE (2016) easyROC: An Interactive Web-tool for ROC Curve Analysis Using R Language Environment. The R Journal, 8(2):213-230].

Для вычисления точек отсечения (диагностической границы) значений ИС ГАМ и ΔГАМ проведено обследование предлагаемым способом 202 лиц в возрасте от 18 до 70 лет. Все 202 человека были предварительно обследованы на наличие антител классов IgM, IgG, IgA к токсоплазмам. По результатам ИФА были выделены 2 группы: лица, у которых отсутствовали антитела к токсоплазмам, отнесены нами к контрольной группе (серонегативные, не инвазированные лица), вторая группа лиц, у которых обнаружены антитела к токсоплазмам (серопозитивные, инвазированные лица).

В обеих группах оценивали уровень спонтанной продукции ИФН-γ, уровень антиген-индуцированной продукции ИФН-γ токсоплазменным антигеном Т. gondii (штамм RH), рассчитывали индекс стимуляции ИС ГАМ и разность значений ΔГАМ.

Не установлено статистически значимой разницы в уровнях продукции спонтанного INF-Y у лиц не инвазированных и инвазированных токсоплазмами, согласно U-критерию Манна-Уитни (р=0,35, рис. 1). Следовательно, не выявлена зависимость выработки лейкоцитами спонтанного INF-Y от наличия в организме человека возбудителя токсоплазмоза.

При оценке разности значений концентрации антиген-индуцированного и спонтанного ИФН-γ в группах не инвазированных и инвазированных токсоплазмами лиц, установлено, что в группе инвазированных токсоплазмами лиц, показатели ИС ГАМ, согласно U-критерию Манна- Уитни, статистически значимо превышали аналогичные показатели в группе не инвазированных лиц (р<0,0001, рис. 2). Значения ΔГАМ в группе инвазированных лиц также достоверно значимо превышали аналогичные показатели среди не инвазированных лиц (р<0,0001, рис. 3), согласно U-критерию Манна-Уитни (рис. 3).

Согласно полученным результатам, выбранные нами показатели - индекс стимуляции (ИС ГАМ) и разность значений концентрации антиген-индуцированного и спонтанного ИФН-γ (ΔГАМ) могут быть использованы как критерии оценки специфической сенсибилизации лимфоцитов к токсоплазмам. С помощью ROC - анализа были рассчитаны точки отсечения (диагностическая граница) для ИС ГАМ и ΔГАМ.

Согласно расчетам, показатель AUC (площадь под кривой) при анализе показателя ИС ГАМ составил 0,99 (ДИ 0,98-0,99), при анализе показателя ΔГАМ - 0,99 (ДИ 0,99-1,0), что свидетельствует о высоком качестве модели.

При анализе ROC - кривой оптимальной точкой отсечения для ИС ГАМ является показатель 23 при уровне специфичности 0,99 (ДИ 0,94-1,0) и чувствительности 0,82 (ДИ 0,74-0,89); для ΔГАМ - показатель 77 пкг/мл при уровне специфичности 0,99 (ДИ 0,95-1,0) и чувствительности 0,95 (0,89-0,98).

Таким образом, результат считается положительным, если индекс стимуляции (ИС ГАМ) превышает 23, или разность значений концентрации антиген-индуцированного и спонтанного ИФН-γ (ΔГАМ) превышает 77 пкг/мл. В таком случае можно говорить о наличии сенсибилизации лимфоцитов к токсоплазмам. Если оба показателя одновременно превышают соответствующие диагностические границы (ИС ГАМ > 23 и ΔГАМ > 77 пкг/мл), можно говорить о выраженной сенсибилизации лимфоцитов к токсоплазмам.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Обследование пациентов с суставным и астеническим синдромами заявленным способом

В настоящее время при обследовании лиц, инвазированных токсоплазмами или с подозрением на токсоплазмоз, не используются кожные тесты, а следовательно, теряется оценка клеточного звена иммунитета. Заявляемый способ позволяет оценить клеточно-опосредованный ответ на специфический токсоплазменный антиген в условиях in vitro. В отличие от кожного теста, предлагаемый способ не является инвазивным и не требует наблюдения за развитием кожной реакции у пациента.

Нами проведено обследование 60 пациентов в возрасте от 32 до 70 лет с суставным (жалобы на боли в крупных и мелких суставах, онемение рук, парестезии конечностей, онемение нижней трети голени) и астеническим синдромами (головная боль, слабость, снижение памяти). Факт сенсибилизации к токсоплазмозному антигену установлен у 56,7% (34 чел) обследованных лиц, из них, у 26 (43,3%) человек оба показателя специфической стимуляции лимфоцитов были выше диагностической границы опыта (таблица 2), что свидетельствовало о выраженной сенсибилизации к токсоплазмам.

Сравнение с серологическими тестами показало, что среди лиц с выраженной сенсибилизацией к токсоплазмам, специфические антитела присутствуют у всех 26 человек, причем, у 9 человек помимо антител IgG, в крови выявлены антитела IgA и (или) IgM, что указывало на недавнее заражение или реактивацию инвазионного процесса. Среди лиц с положительным значением АГАМ, в двух случаях антитела к токсоплазмам в сыворотках крови отсутствовали. Известно, что для антител к токсоплазмам характерны «плавающие» концентрации [Лобзин Ю.В., Буланьков Ю.И., Казанцев А.П., Васильев В.В. Хронический токсоплазмоз: рациональная терапия // Российские медицинские вести. - 1997. - №2. - С. 67-69], следовательно у инвазированных токсоплазмами лиц серологические реакции могут быть отрицательными. Так как показатель ΔГАМ согласно расчетам обладает специфичностью 0,99 (ДИ 0,95-1,0) и чувствительности 0,95 (ДИ 0,89-0,98), он может применяться как более чувствительный показатель зараженности токсоплазмами, чем серологические тесты. Таким образом, заявленный способ может быть использован как скрининговый метод отбора лиц с подозрением на токсоплазмоз для дальнейшего углубленного медицинского обследования.

Пример 2. Оценка степени эндемичности территории и риска заражения токсоплазмами заявленным способом

С целью оценки степени эндемичности в отношении токсоплазмоза проведено обследование заявленным способом жителей Омской области и Республики Тыва. Для проводимого исследования были выбраны контингенты, находящиеся в сходных условиях - лица, связанные с животноводством и мясной промышленностью. Всего было обследовано 118 человек, проживающих в Омской области и 72 человека, проживающих на территории Республики Тыва.

Наблюдается заметная разница в характере ответа клеточного звена иммунитета на токсоплазменный антиген у жителей данных территорий. Среди жителей Республики Тыва сесибилизация лимфоцитов к токсоплазмам выявлена только согласно показателю ΔГАМ у 8,3% обследованных лиц (табл. 3), в то время как у жителей Омской области значения ΔГАМ>77 пкг/мл встречались почти в 6 раз чаще (разница статистически значима, р<0,01). Кроме того, у 39% проживающих в Омской области, инфицирование токсоплазмами подтверждено одновременно двумя показателями продукции ИФН-γ (табл. 3). В группе жителей Республики Тыва не регистрировались значения индекса стимуляции, превышающие диагностическую границу, а следовательно, не выявлено лиц с выраженной сенсибилизацией к токсоплазмам (табл. 3). По результатам исследований, территория Омской области отнесена нами к территории среднего риска заражения токсоплазмами, а территория Республики Тыва, на которой проводились наблюдения - к территории низкого риска заражения. Сероэпидемиологические исследования, проведенные на этих же территориях, показали практическое совпадение результатов с данными оценки антиген-индуцированного клеточного иммунного ответа. Антитела к токсоплазмам выявлены у 50,8±4,6% лиц, проживающих на территории Омской области и у 4,2±2,4% жителей Республики Тыва.

Таким образом, заявленный способ определения специфической сенсибилизации лимфоцитов к токсоплазмам может использоваться как инструмент для изучения популяциоиного иммунитета у лиц, инфицированных токсоплазмами на территориях разного уровня эндемии.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен способ определения специфической сенсибилизации лимфоцитов к токсоплазмам включает инкубацию цельной гепаринизированной крови с токсоплазменным антигеном в течение 72 часов. Далее определяют концентрации спонтанного и антиген-индуцированного интерферона гамма в культуральном супернатанте спектрофотометрически с помощью ИФА, при этом уровень специфического клеточного ответа оценивается по индексу стимуляции и показателю разности значений концентрации антиген-индуцированного и спонтанного интерферона гамма, и если значение индекса стимуляции превышает 23 или разность значений концентрации антиген индуцированного и спонтанного интерферона гамма превышает 77 пкг/мл, то результат считается положительным, свидетельствующим о наличии специфической сенсибилизации лимфоцитов к токсоплазмам; при одновременном превышении индекса стимуляции значения 23 и разности значений концентрации антиген-индуцированного и спонтанного интерферона гамма, превышающей 77 пкг/мл, сенсибилизация лимфоцитов к токсоплазмам считается выраженной. Изобретение может быть использовано при обследовании лиц с подозрением на токсоплазмоз для установления факта сенсибилизации к токсоплазменным антигенам, а также для оценки степени эндемичности территории и риска заражения токсоплазмами и направлено на усовершенствование оценки клеточного звена иммунитета против токсоплазмоза in vitro. 3 ил., 3 табл., 2 пр.

Способ определения специфической сенсибилизации лимфоцитов к токсоплазмам с помощью модифицированной реакции бласттрансформации лимфоцитов с токсоплазменным антигеном - Toxoplasma gondii, штамм RH, и определением концентрации спонтанного и антиген-индуцированного интерферона гамма в культуральном супернатанте в иммуноферментном анализе с последующим расчетом индекса стимуляции и показателя разности значений концентрации антиген-индуцированного и спонтанного интерферона гамма, отличающийся тем, что в качестве индуктора применяется инактивированный водорастворимый токсоплазменный антиген в конечном разведении 30-40 мкг/мл, полученный из штамма RH Toxoplasma gondii, а определение концентрации спонтанного и антиген-индуцированного интерферона гамма в культуральном супернатанте проводится спектрофотометрически с помощью ИФА, при этом уровень специфического клеточного ответа оценивается по индексу стимуляции и показателю разности значений концентрации антиген-индуцированного и спонтанного интерферона гамма, и если значение индекса стимуляции превышает 23 или разность значений концентрации антиген-индуцированного и спонтанного интерферона гамма, превышает 77 пкг/мл, то результат считается положительным, свидетельствующим о наличии специфической сенсибилизации лимфоцитов к токсоплазмам; при одновременном превышении индекса стимуляции значения 23 и разности значений концентрации антиген-индуцированного и спонтанного интерферона гамма, превышающей 77 пкг/мл, сенсибилизация лимфоцитов к токсоплазмам считается выраженной.