Способ детекции ДНК вируса герпеса КРС 6 типа в биологическом материале крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени Российский патент 2022 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может применяться для выявления Bovine Herpesvirus 6 (BoHV-6) в различном биологическом материале крупного рогатого скота (КРС), в том числе в цельной крови, сыворотке и сперме быков, используемой для искусственного осеменения.

BoHV-6, также известный как бычий лимфотропный герпесвирус (BLHV), представитель семейства Herpesviridae, подсемейства Gammaherpesvirinae, рода Macavirus был впервые обнаружен и выделен в США из лимфомы животного с вирусным лейкозом, вызванным Bovine leukemia virus (BLV). Была предположена его роль в качестве кофактора при BLV-ассоциированном заболевании.

Gammaherpesvirinae, к которому относится BoHV-6, преимущественно инфицируют лимфоидные клетки, где они вызывают латентную инфекцию, при этом некоторые представители рода Macavirus способны вызывать злокачественную трансформацию клеток.

ДНК BoHV-6 выявляли у коров, страдающих послеродовым метритом, не отвечающим на традиционное лечение антибиотиками в Европе, а также при абортах крупного рогатого скота в Канаде. Это дало основание предположить роль BoHV-6 в развитии нарушений репродуктивной системы. Однако экспериментальные данные, подтверждающие связь BoHV-6 с патологическими процессами отсутствуют. Сообщалось о выявлении генетического материала вируса у молочных коров в различных странах. Полученные данные об экспрессии генов лейкоцитов КРС свидетельствует о том, что присутствие в клетках BoHV-6 меняет механизмы клеточного противовирусного ответа, что снижает способность формировать надежную иммунную защиту против данного вируса. Было показано, что BoHV-6 может инфицировать мононуклеарные клетки периферической крови и часто выявляется у здоровых взрослых животных и телят.

На настоящее время BoHV-6 представляет собой плохо охарактеризованный вирус, этиологическая роль которого в патогенезе болезней КРС требует изучения.

В настоящее время для выявления BoHV-6 не разработаны коммерческие диагностические тесты.

Ранее были предложены лабораторные варианты систем праймеров для амплификации консервативной области генов ДНК-полимеразы герпесвирусов, которые позволяют амплифицировать в том числе и BoHV-6, однако не дают возможность без секвенирования полученного фрагмента точно идентифицировать тип вируса [Rovnak J, Quackenbush SL, Reyes RA, Baines JD, Parrish CR, Casey JW. Detection of a novel bovine lymphotropic herpesvirus. J Virol. 1998 May;72(5):4237-42. doi: 10.1128/JVI.72.5.4237-4242.1998.; Ling, Y., Zhang, X., Qi, G. et al. Viral metagenomics reveals significant viruses in the genital tract of apparently healthy dairy cows. Arch Virol 164, 1059-1067 (2019). https://doi.org/10.1007/s00705-019-04158-4].

Целью настоящего изобретения является разработка способа выявления ДНК вируса герпеса КРС 6 типа в биологическом материале КРС методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Технический результат - выявление ДНК BoHV-6 в биологическом материале крупного рогатого скота с высокой специфичностью и чувствительностью достигается использованием набора олигонуклеотидов, комплементарных области гена ДНК-полимеразы (ORF9) BoHV-6, содержащего прямой (BHV6-pol-F 5'ACAGACGGGCAGCAGATAAG3') и обратный (BHV6-pol-R 5'ATGGTTCGCCCCTGTAGAGT3') праймеры и флуоресцентно-меченый зонд (BHV6-pol-Z 5'(R6G)CACGGACGGATACCAGGGCGCTACAG(BHQ-1)3'). Для ПЦР используется реакционная смесь следующего состава: 10 мм3 ДНК-матрицы, 10 мм3 ПЦР-смеси-1 (6 пмоль праймеров BHV6-pol-F и BHV6-pol-R, 3 пмоль зонда BHV6-pol-Z; 2,5 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 25ммоль/мм3 (Синтол, Россия), деионизованная вода), 0,5 мм3 Taq-F полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера-Flu (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора); амплификация проводится по следующей программе: 15 мин при 95 °C; циклирование №1: 10 с при 95 °C, 20 с при 60 С, 10 с при 72 С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); циклирование №2: 10 с при 95 °C, 20 с при 55 С, 10 с при 72 С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала при 55 С). Детектирование результата амплификации ДНК BoHV-6 проводится на канале R6G/Yellow; результаты амплификации оценивают с помощью программного обеспечения амплификатора, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией и диагностируют наличие генома вируса герпеса КРС 6 типа. Чувствительность ПЦР составляет 4×10³ коп/см³ в образцах сыворотки крови КРС и спермы КРС. Специфичность идентификации и детекции ДНК вируса герпеса КРС 6 типа при исследовании контрольной панели вирусов и бактериальных культур составляет 100%.

Технический результат достигается высокой степенью гомологии выбранных олигонуклеотидов с фрагментом гена ДНК-полимеразы BoHV-6 и значительным отличием от нуклеотидных последовательностей других вирусов семейства Herpesviridae, подобранными температурными условиями ПЦР и концентрацией спецефических праймеров.

После сбора и анализа нуклеотидных последовательностей геномов вирусов рода Macavirus подсемейства Gammaherpesvirinae, представленных в базе данных GenBank в качестве мишени для амплификации был выбран фрагмент гена ДНК-полимеразы (гомолога ORF9). При подборе праймеров и флуоресцентного зонда рассчитывали температуру отжига, оценивали возможность формирования димеров и вторичной структуры олигонуклеотидов.

Выбранные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:

BHV6-pol-F 5’-ACAGACGGGCAGCAGATAAG-3’

BHV6-pol-R 5’- ATGGTTCGCCCCTGTAGAGT-3’

BHV6-pol-Z 5’-(R6G)CACGGACGGATACCAGGGCGCTACAG(BHQ-1)-3’

Амплификацию ДНК вируса герпеса КРС 6 типа проводят методом ПЦР в реальном времени в конечном объеме 25 мм³ со следующим составом реакционной смеси: 10 мм³ ДНК-матрицы, 10 мм³ ПЦР-смеси-1 (6 пмоль специфических праймеров BHV6-pol-F и BHV6-pol-R, 3 пмоль специфического зонда BHV6-pol-Z; 2,5 мм³ раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 25 ммоль/мм³ (Синтол, Россия), деионизованная вода), 0,5 мм³ Taq-F полимеразы, 5 мм³ ПЦР-буфера-Flu (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Состав реакционной смеси и условия амплификации оптимизированы: подобраны концентрации праймеров и зонда, температура отжига праймеров, длительность основных стадий амплификации, установки для оптимальной детекции флуоресцентного сигнала.

Выявление ДНК BoHV-6 проводится на приборах RotorGene Q (Qiagen, Германия) или CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) по следующему температурному протоколу: 15 мин при 95 °C; циклирование 1: 10 с при 95 °C, 20 с при 60 С, 10 с при 72 С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); циклирование 2: 10 с при 95 °C, 20 с при 55 С, 10 с при 72 С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала при 55 С). Детектирование результата амплификации ДНК BoHV-6 проводится на канале R6G/Yellow. Результаты амплификации в режиме реального времени оценивают с помощью программного обеспечения, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией.

Пример 1. Проверка специфичности детекции ДНК вируса герпеса КРС 6 типа

С целью подтверждения специфичности ПЦР, реакцию проводили с ДНК/кДНК различных микроорганизмов и вирусов, вызывающих инфекционные заболевания КРС, а также геномной ДНК крупного рогатого скота (табл.1).

Таблица 1. Результаты амплификации ДНК/кДНК, выделенных из образцов контрольной панели

№
образца Наличие фрагмента генома BoHV-6 Полученный результат Наименование Образца Повтор1 Повтор2 + + + Материал КРС, содержащий ДНК BoHV-6, подтвержденный секвенированием - - - Bovine herpesvirus 1 МВА 2 - - - Bovine herpesvirus 2 ATCC-VR845 - - - Bovine herpesvirus 4 ATCC-VR631 - - - Equine Herpesvirus 1 - - - Arcanobacterium pyogenes АТСС 8164 - - - Aspergillus brasiliensis (niger) АТСС 16404 - - - Biberstenia trehalosi 1982 ДНК от 280420 - - - Bordetella bronchiseptica В-С2 - - - Campylobacter fetus 136 - - - Candida albicans АТСС 102231 - - - Enterococcus faecalis АТСС 29212 - - - Escherichia coli 0157: H7 - - - Histophilus somni АТСС 700025 - - - Klebseiella oxitoca - - - Lactobacillus acidipholus АТСС 4356 - - - Leptospira interrogans Pomona ВГНКИ-6 - - - Mycoplasma arginini - - - Mycobacterium avium D-4 - - - Mycoplasma bovirhinis АТСС 27748 - - - Mycoplasma bovis АТСС 25523 - - - Mycoplasma bovigenitalium АТСС 19852 - - - Mycoplasma bovigenitalium АТСС 27748 - - - Neospora caninum АТСС-50977 - - - Pasterella multocida АТСС 43137 - - - Pseudomonas aeruginosa 017 1681 - - - Staphylococcus aureus ВКПМВ 566 - - - Yersinia pseudotuberculosis 6 - - - Аденовирус КРС BV-10 - - - Вирус диареи КРС (Бизон) - - - Вирус диареи КРС (NADL) - - - Вирус парагриппа КРС (ПТК 45186) - - - Вирус респираторно-синцитиальной инфекции КРС (3 РСВ) - - - Геномная ДНК КРС - - - Положительный материал от КРС, зараженного вирусом нодулярного дерматита - - - Вирус Шмалленберга (кДНК)

Проведенное исследование показало, что выбранные праймеры амплифицируют только фрагменты генома BoHV-6 и не амплифицируют ДНК/кДНК других микроорганизмов, вирусов и геномную ДНК животных.

Данный пример демонстрирует высокую специфичность (100%) настоящей разработки в рамках предложенной панели образцов.

Пример 2. Оценка абсолютной чувствительности набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК BoHV-6

Определение абсолютной чувствительности набора олигонуклеотидов проводили способом оценки результатов амплификации последовательных разведений положительного контрольного образца (ПКО) - рекомбинантной плазмиды, представляющей собой плазмиду pAL2-ТА, содержащую целевую вставку с фрагментом гена ДНК-полимеразы (ORF9) BoHV-6.

Использовали серии десятикратных разведений ПКО BoHV-6 c известной концентрацией плазмидной ДНК (4×10⁶ копий/см³) в РНК-буфере (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) с концентрациями от 4×10⁶ копий/см³ до 4×10² копий/см³.

Амплификацию проводили на приборе Rotor Gene Q (Qiagen, Германия). Эксперимент проводили в разные дни, разные исполнители на разных приборах. Результаты представлены на фиг.1.

Фиг.1. Оценка абсолютной чувствительности набора олигонуклеотидов и способа идентификации и детекции ДНК BoHV-6.

За абсолютную чувствительность принимали наименьшую концентрацию ПКО, для которой получен положительный результат ПЦР в трех повторах (значения Ct < 35).

Абсолютная чувствительность набора праймеров для детекции ДНК вируса герпеса КРС 6 типа составила 4×10³ коп/см³.

Пример 3. Оценка аналитической чувствительности способа идентификации и детекции ДНК BoHV-6 в сперме и сыворотке крови крупного рогатого скота

Для определения аналитической чувствительности способа идентификации ДНК вируса герпеса КРС 6 типа в сперме и сыворотке крови КРС готовили: последовательные десятикратные разбавления ПКО BoHV-6 с концентрациями от 4×10⁶ копий/см³ до 4×10² копий/см³ в предварительно проверенных отрицательных образцах спермы КРС, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида 0,9% в соотношении 1:3 и десятикратные разведения ПКО BoHV-6 в предварительно проверенных отрицательных образцах сыворотки крови КРС с концентрациями от 4×10⁶ копий/см³ до 4×10² копий/см³.

Для экстракции ДНК использовали 100 мм³ полученной смеси. Выделение ДНК проводили с использованием преципитационного метода (набор «Рибо-преп», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Амплификацию проводили на приборе Rotor Gene Q (Qiagen, Германия). Эксперимент проводили в разные дни, разные исполнители на разных приборах. Результаты представлены на фиг.2. и фиг.3

Фиг.2. Оценка аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов для амплификации и детекции ДНК BoHV-6 в сперме крупного рогатого скота.

Фиг.3. Оценка аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов для амплификации и детекции ДНК BoHV-6 в сыворотке крови крупного рогатого скота.

За аналитическую чувствительность принимали наименьшую концентрацию ПКО, для которой получен положительный результат ПЦР в трех повторах (значения Ct < 35).

Аналитическая чувствительность набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК вируса герпеса КРС 6 типа в сперме и сыворотке крови крупного рогатого скота составляет 4×10³ коп/см³.

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной вирусологии и может применяться для выявления вируса герпеса КРС 6 типа. Способ предполагает проведение ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени с использованием набора олигонуклеотидов, комплементарных области гена ДНК-полимеразы (ORF9) BoHV-6, включающего: прямой праймер BHV6-pol-F (5'- ACAGACGGGCAGCAGATAAG -3'), обратный праймер BHV6-pol-R (5'- ATGGTTCGCCCCTGTAGAGT -3') и флуоресцентно-меченый зонд BHV6-pol-Z (5'- (R6G)CACGGACGGATACCAGGGCGCTACAG(BHQ-1) -3'). Способ обладает высокой специфичностью и может быть использован при тестировании сыворотки и криоконсервированной спермы КРС. 3 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ детекции ДНК вируса герпеса КРС 6 типа в биологическом материале крупного рогатого скота методом ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени, характеризующийся тем, что способ осуществляется с использованием набора олигонуклеотидов, комплементарных области гена ДНК-полимеразы (ORF9) BoHV-6, содержащего прямой BHV6-pol-F 5'-ACAGACGGGCAGCAGATAAG-3' и обратный BHV6-pol-R 5'-ATGGTTCGCCCCTGTAGAGT-3' праймеры и флуоресцентно-меченый зонд BHV6-pol-Z 5'-(R6G)CACGGACGGATACCAGGGCGCTACAG(BHQ-1)-3', реакционная смесь имеет следующий состав: 10 мм³ ДНК-матрицы, 10 мм³ ПЦР-смеси-1, 6 пмоль праймеров BHV6-pol-F и BHV6-pol-R, 3 пмоль зонда BHV6-pol-Z; 2,5 мм³ раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 25 ммоль/мм³, деионизованная вода, 0,5 мм³ Taq-F полимеразы, 5 мм³ ПЦР-буфера-Flu; амплификацию проводят по следующей программе: 15 мин при 95°C; циклирование №1: 10 с при 95°C, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С - 5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала; циклирование №2: 10 с при 95°C, 20 с при 55°С, 10 с при 72°С - 35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала при 55°С, при этом детектирование результата амплификации ДНК BoHV-6 проводят на канале R6G/Yellow; результаты амплификации оценивают с помощью программного обеспечения амплификатора, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией и диагностируют наличие генома вируса герпеса КРС 6 типа.