НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ДНК БАКТЕРИИ Histophilus somni МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может применяться для диагностики гистофилеза крупного рогатого скота.

Histophilus somni - представитель семейства Pasteurellaceae, является распространенной болезнетворной бактерией крупного рогатого скота. Н. somni - микроорганизм, который, как правило, осложняет вирусные инфекции и увеличивает степень заражения животных другими бактериальными агентами. Н. somni может поражать разные системы органов, вызывая мультисистемное заболевание, известное как гистофилез, при этом инфицирование верхних дыхательных путей часто предшествует поражению других систем органов. Дыхательная, генитальная, нервная, кровеносная и костно-мышечная (суставы) системы могут поражаться как индивидуально, так и вместе.

Лабораторный метод идентификации Histophilus somni чрезвычайно необходим, поскольку клинические симптомы не позволяют дифференцировать гистофилез, вызванный Н. somni, от других бактериальных и вирусных инфекций.

Способность Н. somni поражать разные органы животного и проявляться как комплекс мультисистемных заболеваний, создает проблемы для диагностики и контроля. Заболевания, вызванные Н. somni, в значительной степени не диагностируются, особенно миокардиты, так как небольшие фатальные поражения в сердце могут быть пропущены при вскрытии. Использование серологических методов в данном случае недостаточно эффективно как из-за предшествующей инфекции или колонизации, так и из-за перекрестно-реактивных антител. Выделение Н. somni из органов, особенно легких, в присутствии других патогенных микроорганизмов может быть затруднено, учитывая медленный рост и высокие требования к условиям культивирования данного микроорганизма. Поэтому точная идентификация Н. somni является сложной задачей, и необходим надежный метод выявления данной бактерии в клинических образцах. Метод, основанный на использовании полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяет проводить специфичную идентификацию сложнокультивируемых микроорганизмов, в том числе в присутствии других патогенных бактерий. Диагностикумы на основе ПЦР для выявления Н. somni используются в Европе и Америке, но не разработаны в России.

Аналогом является ПЦР-тест-система для выявления Histophilus somni LSI VetMAX™ Histophilus somni, производство Laboratoire Service International (LSI), Франция, а также лабораторные варианты систем [P. Pansri, J. Katholm... Evaluation of novel multiplex qPCR assays for diagnosis of pathogens associated with the bovine respiratory disease complex https://doi.org/10.1016/i.tvj 1.2020.105425, Loy J.D... Development of a multiplex real-time PCR assay using two thermocycling platforms for detection of major bacterial pathogens associated with bovine respiratory disease complex from clinical samples doi: 10.1177/1040638718800170]. Настоящая набор олигонуклеотидов в отличие от перечисленных аналогов может применяться для анализа не только образцов от крупного рогатого скота (КРС), но также свиней и мелкого рогатого скота (МРС). Кроме того, данный набор олигонуклеотидов и способ идентификации позволяет детектировать Н. somni не только в образцах назальных и транстрахеальных смывов, легких и бактериальных колоний, но также в сперме и образцах репродуктивных смывов. Также преимуществом данного способа идентификации Н. somni с использованием настоящего набора олигонуклеотидов является более быстрое время получения результата ПЦР (1,5 часа) по сравнению с LSI VetMAX™ Histophilus somni (3 часа).

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения достоверной диагностики гистофилеза на основе выявления ДНК бактерии-возбудителя Histophilus somni.

Технический результат достигается конструированием набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда для идентификации ДНК Histophilus somni в биологических образцах методом ПЦР в режиме реального времени. Аналитическая чувствительность методики с использованием набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК Н. somni составляет 1×10⁴ коп/см³ в образцах легких, смывов из респираторного и репродуктивного трактов, а также сперме КРС, свиней и МРС. Специфичность набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК Н. Somni при исследовании бактериальных культур контрольной панели составляет 100%.

На первом этапе был проведен сбор и анализ нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов семейства Pasteurellaceae, представленных в базе данных GenBank. В качестве гена-мишени был выбран ген 16S рРНК. При подборе праймеров и зонда рассчитывали температуру отжига, возможность формирования димеров и вторичную структуру олигонуклеотидов. Технический результат достигается высокой степенью гомологии выбранных олигонуклеотидов с фрагментом гена 16S рРНК Η somni и значительным отличием от нуклеотидных последовательностей других представителей семейства Pasteurellaceae, а также отсутствием формирования шпилек с температурой плавления выше комнатной температуры. Выбранные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:

Hsmn_F 5'- GGAAGGCGATTAGTTTAAGAG-3'

Hsmn_R 5'- CCTCACTTAAGTCACCACCT-3'

HsmnZ (ROX)-CACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGT-(BHQ)

Далее были оптимизированы условия амплификации: концентрации праймеров и зонда, концентрация ионов магния в реакционной смеси, температура отжига праймеров и длительность основных стадий амплификации.

Идентификацию и детекцию ДНК бактерии Histophilus somni осуществляют следующим способом:

Материалом для исследования служат пробы биологического материала сельскохозяйственных животных (образцы назальных и транстрахеальных смывов, репродуктивных смывов, бактериальных колоний, спермы, молока и патологического материала). Отбор материала: пробы отбирают любым пригодным для последующей постановки ПЦР способом. Пробы молока, жидкие культуры микроорганизмов и смывы со слизистых используют без предварительной подготовки. Для экстракции ДНК используют 100 мм³ образца. Пробы паренхиматозных органов измельчают и готовят 10% суспензию в растворе натрия хлорида изотонического 0,9%. Для экстракции ДНК используют 100 мм³ верхней фракции суспензии.

Выделение ДНК проводят с использованием приципитационного метода (наборы «Рибо-преп», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Проводят ПЦР в конечном объеме 25 мм³ со следующим составом реакционной смеси: 10 мм³ ДНК-матрицы, 10 мм³ ПЦР-смеси-1 (3 пмоль специфических праймеров Hsmn F и Hsmn_R, 2 пмоль специфического зонда Hsmn Z, 2,5 мм³ раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм³ (Синтол, Россия), деионизованная вода), 0,5 мм³ Taq-F полимеразы, 5 мм³ ПЦР-буфера-Flu (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).

Оптимизированный состав Выявление ДНК Н. somni проводится на приборах RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия) или RotorGene Q (Qiagen, Германия) по следующему температурному протоколу: 15 мин при 95°С; 10 с при 95°С, 20 с при 63°С, 10 с при 72°С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); 10 с при 95°С, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала). Детектирование результата амплификации ДНК Η somni проводится на канале ROX/Orange. Результаты амплификации в режиме реального времени оценивают с помощью программного обеспечения, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией.

Пример 1. Проверка специфичности набора олигонуклеотидов и способа идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni.

С целью подтверждения специфичности используемой ПЦР, реакцию ставили с ДНК/кДНК различных микроорганизмов и вирусов, вызывающих инфекционные заболевания КРС, а также геномной ДНК крупного рогатого скота (табл. 1).

Данный пример демонстрирует высокую специфичность (100%) настоящей разработки (набор выбранных праймеров амплифицирует только фрагмент генома микроорганизмов Histophilus somni и не амплифицирует ДНК/кДНК других микроорганизмов, вирусов и геномную ДНК крупного рогатого скота).

Пример 2. Оценка аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов и способа идентификации и детекции ДНК Histophilus somni.

Для определения аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов использовали положительный контрольный образец (ПКО) - рекомбинантную плазмиду, представляющую собой плазмиду pAL2-ТА, содержащую целевую вставку с фрагментом гена 16S рРНК Histophilus somni. Структуру положительного контрольного образца подтверждали методом секвенирования по Сенгеру. Секвенирование фрагментов амплификации выполняли методом "cycle sequence" с набором ABI PRISM Big Dye v.1.1 («Applied Biosystems», USA), согласно инструкции изготовителя с использованием капиллярного автоматического секвенатора ABI-3100 PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Капиллярный электрофорез проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer после очистки образцов от избытка дидезоксинуклеотидов и солей.

Определение аналитической чувствительности ПЦР проводили способом последовательного разбавления ПКО Н. somni с известной концентрацией плазмидной ДНК (1×10⁶ копий/см³). Использовали серии десятикратных разведений ПКО Н. somni в отрицательных образцах вагинальных смывов, молока, спермы и внутренних органов КРС с концентрациями от 1×10⁵ копий/см³ до 1×10² копий/см³. Амплификацию проводили на приборе Rotor Gene Q (Qiagen, Германия). Эксперимент проводили в разные дни, разные исполнители на разных приборах. Результаты представлены на фиг. 1.

Фиг. 1. Оценка аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов и способа идентификации и детекции ДНК Histophilus somni.

За аналитическую чувствительность принимали наименьшую концентрацию ПКО, для которой получен положительный результат ПЦР (значения Ct<30).

Аналитическая чувствительность набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК Histophilus somni в образцах биологического материала составляет 1×10⁴ коп/см³.

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может применяться для диагностики гистофилеза крупного рогатого скота. Набор олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni методом ПЦР в режиме реального времени, содержит универсальные прямой (Hsmn_F) и обратный (HsmnR) праймеры и флуоресцентно-меченый зонд (Hsmn Z) для идентификации бактерии Histophilus somni, комплементарные области гена 16 S рибосомальной РНК микроорганизма Histophilus somni, имеющие заявленный нуклеотидный состав. Способ идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni методом ПЦР в режиме реального времени включает выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции с использованием набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni в реакционной смеси. ПЦР в режиме реального времени проводится с использованием установленной программы амплификации. Результаты амплификации в режиме реального времени оценивают с помощью программного обеспечения, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией. 2 н.п. ф-лы, 2 пр., 1 табл., 1 ил.

1. Набор олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni методом ПЦР в режиме реального времени, содержащий универсальные прямой (Hsmn_F) и обратный (Hsmn_R) праймеры и флуоресцентно-меченый зонд (HsmnZ) для идентификации бактерии Histophilus somni, комплементарные области гена 16 S рибосомальной РНК микроорганизма Histophilus somni, имеющие следующий нуклеотидный состав:

Hsmn_F 5'- GGAAGGCGATTAGTTTAAGAG-3'

Hsmn_R 5'- CCTCACTTAAGTCACCACCT-3'

Hsmn Z (ROX)-CACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGT-(BHQ)

2. Способ идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni методом ПЦР в режиме реального времени, включающий выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции с использованием набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni (п.1) в реакционной смеси следующего состава: 10 мм³ ДНК-матрицы, 10 мм³ ПЦР-смеси-1 (3 пмоль специфических праймеров Hsmn_F и Hsmn_R, 2 пмоль специфического зонда Hsmn Z, 2,5 мм³ раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм³, деионизованная вода), 0,5 мм³ Taq-F полимеразы, 5 мм³ ПЦР-буфера-Flu, а также детектирование флуоресцентного сигнала непосредственно в процессе реакции амплификации на канале ROX/Orange, ПЦР в режиме реального времени проводится с использованием следующей программы амплификации: 15 мин при 95°С; 10 с при 95°С, 20 с при 63°С, 10 с при 72°С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); 10 с при 95°С, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала), результаты амплификации в режиме реального времени оценивают с помощью программного обеспечения, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией.