ШТАММ, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЭРГОТИОНЕИН, И СПОСОБ ЕГО СКРИНИНГА Российский патент 2023 года по МПК C12N1/14 C12P13/04 C12R1/645 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области микробиологии, а в частности к штамму HT-3 Hericium erinaceus и к способу его скрининга.

Предпосылки создания изобретения

Эрготионеин, научным названием которого является внутренняя соль триметил-2-меркапто-L-гистидина, представляет собой природную 2-тиоимидазол-аминокислоту. Эрготионеин в растворенном состоянии имеет два таутомерных изомера, тиол и тион, и существует, в основном в форме тиона в условиях физиологического pH. Эрготионеин был впервые выделен Tanret С. из спорыньи (склероция, образованного грибком, паразитирующим на ржи, то есть, злаковом растении) в 1909 году. Чистый продукт представляет собой белые кристаллы, хорошо растворимые в воде до 0,9 моль/л при комнатной температуре, и является достаточно стабильным при физиологическом pH и в сильной щелочной среде.

Эрготионеин имеет уникальные физиологические функции, такие как антиокислительное действие, акцептироваие свободных радикалов, образование хелатных комплексов с ионами металлов, защита от повреждения УФ-излучением, ингибирование рака и т.п., а в некоторых случаях, он превосходит природные антиоксиданты, такие как глутатион.

Эрготионеин присутствует в различных растениях и у животных. Однако животные не могут синтезировать эрготионеин сами по себе и могут получать его только с пищей. Многие микроорганизмы, такие как грибы и актиномицеты, могут синтезировать эрготионеин, но бактерии сами по себе не могут синтезировать это соединение. На данный момент было проведено еще больше исследований по продуцированию эрготионеина с использованием грибов.

Как описано в заявке на патент Китая CN103184246A, «Способ биосинтеза эрготионеина», эрготионеин синтезируют путем инокуляции и ферментации мицелия макрогрибов (Lepista sordida, Pleurotus plumonarius и Pleurotus sapidus дикого типа), при этом наибольшее содержание эрготионеина в сбраживаемом бульоне составляло 51 мг/л для Lepista sordida, 48 мг/л для Pleurotus plumonarius и 37 мг/л для Pleurotus sapidus дикого типа. Выход эрготионеина был все еще невысоким, а цикл роста грибов довольно продолжительным.

В заявке на патент Китая CN103734022A «Штамм для получения эрготионеина и способы получения эрготионеина» раскрываются стадии синтеза эрготионеина посредством ферментации Pleurotus ostreatus и экстракции эрготионеина из клеток мицелия, но не раскрывается способ скрининга штаммов Pleurotus ostreatus.

В заявке на патент Китая CN102978121A «Способ получения эрготионеина посредством трансформации микроорганизмов» раскрывается получение эрготионеина посредством трансформации микроорганизма Lepista caespitosa. Однако биотрансформация влияет на жизнеспособность грибковых клеток, и эффективность такой трансформации невысока.

Hericium erinaceus, также известный как гриб «Львиная грива», назван по его форме, напоминающей гребень. Гифы Hericium erinaceus имеют тонкие клеточные стенки с перегородками и пряжкой. Плодовые тела имеют вид колоний, плоско-полусферическую или головчатую форму с волосатыми мясистыми шипами на поверхности ворсинчатой части. В свежем виде, этот гриб является белым, а в высушенном виде, он имеет цвет от светло-желтого до светло-коричневого. Этот гриб имеет узкое основание или немного укороченный стебель, а также увеличенную верхнюю часть диаметром 3,5-10 см. На расстоянии, он похож на золотистый гребень, а поэтому его называют Hericium erinaceus. Hericium erinaceus является очень вкусным, а тело гриба является свежим, нежным и ароматным, и этот гриб известен как «вегетарианское мясное блюдо». Hericium erinaceus является не только очень вкусным, но также содержит множество аминокислот, 8 из которых необходимы человеческому организму, и кроме того, он богат полисахаридами, различными витаминами, неорганическими солями, пептидами и ненасыщенными жирными кислотами. Hericium erinaceus легко сбраживается и культивируется, растет быстро, и имеет короткий цикл роста и высокую урожайность.

Сущность изобретения

Для решения проблемы, существующих в данной области, было разработано настоящее изобретение, относящееся к штамму Hericium erinaceus HT-3, который был депонирован в Китайской Коллекции Типовых Культур (CCTCC) 23 августа 2018 г., под депозитарным номером CCTCC No. M 2018567. Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей Hericium erinaceus и сбраживаемый бульон, и к способу скрининга Hericium erinaceus. Настоящее изобретение включает следующие варианты его осуществления:

1. Гриб Hericium erinaceus с депозитарным номером CCTCC No. M 2018567.

2. Гриб Hericium erinaceus согласно пункту 1, который имеет последовательность гена 18s рРНК, представленную в SEQ ID NO: 1

(TTGTACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATG GTACCTTGCTACATGGATAACTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCAATTAAGCC CCGACTTCCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCGGCTCGCCGCTCC TTTGGTGATTCATAATAACTTCTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGCTTCATT CAAATATCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTTTCAAC GGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACC ACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTA GTGACAATAAATAACAATATAGGGCTCTTTTGGGTCTTATAATTGGAATGAGTACAA TTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGG TAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTG AACTTCAGGCCTGGCCGGGCGGTCTGCCTAACGGTATGTACTGTCTGGCCGGGCCTT ACCTCCTGGTGAGCCGGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTA CCTTGAGAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTATGCCCGAATACATTAGCATGGA ATAATAAAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGAATCGCCGTAATGAT TAATAGGGATAGTTGGGGGCATTAGTATTGCGTTGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATT TACGCAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAA CGAAGGTTAGGGGATCGAAAACGATCAGATACCGTTGTAGTCTTAACAGTAAACTA TGCCGACTAGGGATCGGGCGACCTCAATTTAATGTGTCGCTCGGCACCTTACGAGAA ATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAA TTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGG GGAAACTCACCAGGTCCAGACATAACTAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGA TTTTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAAT TCCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGGCCGGCTTTTGCTGGTCGCTGGCTTCTTAGAGGG).

3. Гриб Hericium erinaceus согласно пункту 1, который имеет последовательность ITS, представленную в SEQ ID NO: 2 (TGCGGAAGGATCATTAATGAATTTGAAAGGAGTTGTTGCTGGCCTGAAACCCAGGC ATGTGCACGCTCCAATCTCATCCATCTTACACCTGTGCACCCTTGCGTGGGTCCGTCG GCTTTGCGGTCGATGGGCTTGCGTTTTTCATAAACTCTTATGTATGTAACAGAATGTC ATAATGCTATAAACGCATCTTATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCA TCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAA TCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCACGCCTGTT CGAGTGTCGTGAAATTCTCAACTCAATCCTCTTGTTATGAGAGGGCTGGGCTTGGAC TTGGAGGTCTTGCCGGTGCTCCCTCGGGAAGTCGGCTCCTCTTGAATGCATGAGTGG ATCCCTTTTGTAGGGTTTGCCCTTGGTGTGATAATTATCTACGCCGCGGGTAGCCTTG CGTTGGTCTGCTTCTAACCGTCTTCGGACAACTTTCATCTCAACTTGACCTCGAATCA GGCGGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCA).

4. Гриб Hericium erinaceus согласно пункту 1, который продуцирует эрготионеин в сбраживаемом бульоне, где количество эрготионеина в сбраживаемом бульоне составляет более 41 мг/л, и где сбраживаемый бульон получают из сбраживаемой среды, содержащей источник углерода, источник азота, неорганические соли и витамины.

5. Композиция, содержащая гриб Hericium erinaceus и сбраживаемый бульон, который содержит эрготионеин, где количество эрготионеина в сбраживаемом бульоне составляет более 41 мг/л, и где сбраживаемый бульон получают из сбраживаемой среды, содержащей источник углерода, источник азота, неорганические соли и витамины.

6. Композиция согласно пункту 5, где гриб Hericium erinaceus представляет собой гриб Hericium erinaceus согласно любому из пунктов 1-4.

7. Способ скрининга гриба Hericium erinaceus, включающий следующие стадии:

(1) помещения тканевого блока гриба Hericium erinaceus на твердую среду с картофельным агаром с декстрозой, содержащую антибиотик; культивирования в течение 5-12 дней при 23~28°С для получения мицелия Hericium erinaceus; инокуляции мицелия Hericium erinaceus на твердой среде с картофельным агаром, содержащим декстрозу; культивирования в течение 5-12 дней при 23~28°С для получения штамма Hericium erinaceus;

(2) инокуляции штамма Hericium erinaceus, полученного в стадии (1), в сбраживаемую среду; культивирования в течение 12-20 дней при 23~26°С, где вещество-предшественник подают на дни 7-10 во время культивирования для получения сбраживаемого бульона;

(3) центрифугирования сбраживаемого бульона; удаления супернатанта для фильтрации; определения количества эрготионеина в фильтрате; и скрининга штамма на продуцирование эрготионеина;

предпочтительно, способ скрининга дополнительно включает, после стадии (2), стадию экстракционного вымачивания эрготионеина из клеток мицелия за их пределы.

8. Способ скрининга согласно пункту 7, где стадию экстракционного вымачивания эрготионеина из клеток мицелия проводят путем:

гомогенизации сбраживаемого бульона мицелия, а затем нагревания для экстракции эрготионеина из клеток мицелия за их пределы; или

сбора мицелия путем разделения твердой и жидкой фаз в бульоне для ферментации мицелия; получения суспензии мицелия путем добавления воды; гомогенизации; и последующего нагревания для экстракции эрготионеина из клеток мицелия за их пределы.

9. Способ скрининга гриба Hericium erinaceus согласно пункту 7, где антибиотик на стадии (1) включает любой один компонент или комбинацию двух или более из этих компонентов, а именно, пенициллина, стрептомицина и хлорамфеникола.

10. Способ скрининга гриба Hericium erinaceus согласно пункту 7, где вещество-предшественник на стадии (2) включает любой один компонент или комбинацию двух или более из этих компонентов, а именно, цистеина, метионина и гистидина.

11. Способ скрининга гриба Hericium erinaceus согласно пункту 7, где сбраживаемая среда содержит от 20 до 60 г/л источника углерода, от 10 до 30 г/л источника азота, от 2 до 5 г/л неорганических солей и 0,001~0,005 г/л витаминов.

Преимущества настоящего изобретения заключаются в том, что штамм Hericium erinaceus HT-3 CCTCC No.: M 2018567, полученный в соответствии с настоящим изобретением, легко культивируется и имеет высокий выход эрготионеина.

Способ скрининга гриба Hericium erinaceus согласно изобретению является простым, удобным в эксплуатации и недорогостоящим, а также он может быть применен для крупномасштабного скрининга, и позволяет легко отбирать штамм гриба с высоким выходом.

Описание чертежей

На фиг. 1 представлена фотография, иллюстрирующая морфологические характеристики колонии Hericium erinaceus HT-3 CCTCC NO: M 2018567.

На фиг. 2 представлена микрофотография мицелия Hericium erinaceus HT-3 CCTCC NO: M 2018567.

На фиг. 3 представлена последовательность гена рРНК 18s Hericium erinaceus HT-3 CCTCC NO: M 2018567.

На фиг. 4 представлена последовательность ITS Hericium erinaceus HT-3 CCTCC NO: M 2018567.

На фиг. 5 представлена ВЭЖХ-хроматограмма, иллюстрирующая содержание эрготионеина в сбраживаемом бульоне Hericium erinaceus HT-3 CCTCC NO: M 2018567, определенное с помощью ВЭЖХ.

Подробное описание изобретения

Нижеследующее описание настоящего изобретения приводится лишь для иллюстрации конкретных вариантов его осуществления, и эти варианты не следует рассматривать как ограничение настоящего изобретения. Любые другие изменения, модификации, замены, комбинации и упрощения, не выходящие за рамки существа и принципа настоящего изобретения, рассматриваются как эквиваленты и входят в объем охраны изобретения.

Экспериментальные методы, применяемые, как описано ниже, являются традиционными, если это не оговорено особо.

Используемые ниже материалы и реагенты являются коммерчески доступными, если это не оговорено особо.

В качестве конкретного варианта осуществления изобретения приводится штамм Hericium erinaceus HT-3 CCTCC No: M 2018567, который быстро растет на среде с картофельным агаром, содержащим декстрозу (то есть на твердой среде с PDA). Колония после культивирования при 25°С в течение 8 дней достигает 50-55 мм в диаметре, является белой, блестящей и расширяется радиально, а основание колонии имеет светло-коричневую окраску; см. фиг. 1 с морфологическими характеристиками колонии. Гифы штамма являются прочными и толстыми, состоят из трубчатых клеток с тонкими клеточными стенками, и имеют перегородки и ветви, а также соединения в виде пряжек, см. фиг. 2.

Гриб «Львиная грива» представляет собой Hericium erinaceus (Rull ex F.) и принадлежит к роду Hydnaceae, Polyporaceae, Базидиомицетов и Грибов, а также является сапрофитом и известным съедобным грибом. Его форма напоминает ежа или гребень, а поэтому его обычно называют гребнем или грибом Львиная грива. В настоящем изобретении, Hericium erinaceus предпочтительно представляет собой Hericium erinaceus CCTCC No. M 2018567, который был депонирован в Китайской Коллекции Типовых Культур (CCTCC) 23 августа 2018 г.

Последовательность гена 18s рРНК Hericium erinaceus HT-3 CCTCC No. M2018567 представлена в SEQ ID NO: 1, см. фиг. 3.

Последовательность ITS Hericium erinaceus HT-3 CCTCC No. M 2018567 представлена в SEQ ID NO: 2, см. фиг. 4.

В качестве конкретного варианта осуществления изобретения, способ скрининга штамма Hericium, продуцирующего эрготион (Hericium erinaceus HT-3), включает:

(1) вырезание блока ткани размером приблизительно 0,5×0,5 см из гриба Hericium erinaceus и помещение на твердую среду с PDA, содержащую антибиотик; культивирование в течение 5-12 дней, предпочтительно в течение 7-10 дней, при 23~28°С предпочтительно при температуре 24°С, с получением мицелия Hericium erinaceus; инокуляцию мицелия Hericium erinaceus на твердой среде с PDA; культивирование в течение 5-12 дней, предпочтительно в течение 8 дней, при 23~28°С, предпочтительно при температуре 24°С, с получением мицелия Hericium erinaceus,

где твердая среда с PDA, как обычная твердая среда, является полусинтетической средой и была приготовлена путем выщелачивания раствора, полученного из 200 г картофеля, 20 г глюкозы, 15-20 г агара и 1000 мл воды, без регуляции pH.

(2) инокуляцию штамма Hericium erinaceus, полученного на стадии (1), в сбраживаемую среду; культивирование в течение 12-20 дней, предпочтительно в течение 15 дней, при 23~28°С предпочтительно при 24°С, где вещество-предшественник подают на дни 7-10 во время культивирования для получения сбраживаемого бульона;

(3) центрифугирование сбраживаемого бульона со скоростью 8000~10000 об/мин, а предпочтительно 8000 об/мин, в течение 10~20 минут, предпочтительно в течение 20 минут, удаление супернатанта для фильтрации через микропористый 0,22 мкм-фильтр, определение количества эрготионеина в фильтрате и скрининг штамма на продуцирование эрготионеина. Тканевый блок гриба Hericium erinaceus на стадии (1) представляет собой ворсинчатую часть, стык ворсинок и ножки, среднюю часть и основание ножки, а предпочтительно, ворсинчатую часть.

Антибиотик на стадии (1) включает любой один компонент или комбинацию из двух или более компонентов, а именно, пенициллина, стрептомицина и хлорамфеникола, а предпочтительно стрептомицина.

Концентрация антибиотика составляет 0,01~0,1 г/л.

Вещество-предшественник на стадии (2) включает любой один компонент или комбинацию из двух или более компонентов, а именно, цистеина, метионина и гистидина.

Концентрация каждого из веществ-предшественников на стадии (2) составляет 1~3 мМ, соответственно.

Определение количества эрготионеина в фильтрате на стадии (3) осуществляют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Условиями ВЭЖХ могут быть: хроматографическая колонка: колонка Hypersil ODS C18 (250 мм×4,6 мм, размер частиц 5 мкм); температура колонки: 30°C; подвижная фаза: ацетонитрил-вода (3:97); скорость потока: 1,0 мл/мин; длина волны детектирования: 254 нм; объем загрузки: 20 мкл.

В конкретном варианте осуществления изобретения, способ скрининга дополнительно включает стадию, проводимую после стадии (2), а именно, экстракционное вымачивание эрготионеина из клеток мицелия за их пределы. В конкретном варианте, стадию экстракционного вымачивания эрготионеина из клеток мицелия проводят путем гомогенизации сбраживаемого бульона мицелия при скорости от 1000 до 6000 об/мин, а предпочтительно при 4000 об/мин, в течение 20-100 минут, предпочтительно в течение 60 минут, с последующим повышением температуры сбраживаемого бульона до 60~100°С, предпочтительно 80°C, и нагреванием в течение 20~100 минут, предпочтительно в течение 50 минут, с последующей экстракцией эрготионеина из клеток мицелия за их пределы.

В конкретном варианте осуществления изобретения, стадию экстракционного вымачивания эрготионеина из клеток мицелия осуществляют посредством сбора мицелия путем разделения твердой и жидкой фаз в бульоне для ферментации мицелия; получения суспензии мицелия путем добавления воды с последующей гомогенизацией при скорости от 1000 до 6000 об/мин, а предпочтительно при 4000 об/мин, в течение 20-100 минут, а предпочтительно в течение 60 минут, с последующим повышением температуры сбраживаемого бульона до 60~100°С, предпочтительно 80°C, и нагреванием в течение 20~100 минут, предпочтительно в течение 60 минут, с последующей экстракцией эрготионеина из клеток мицелия за их пределы.

Сбраживаемая среда содержит от 20 до 60 г/л источника углерода, от 10 до 30 г/л источника азота, от 2 до 5 г/л неорганических солей и 0,001~0,005 г/л витаминов.

Кроме того, источник углерода, содержащийся в сбраживаемой среде, включает любой один компонент или комбинацию по меньшей мере из двух компонентов, а именно, растворимого крахмала, глюкозы, сахарозы, фруктозы, мальтозы и кукурузной муки;

предпочтительно, источник углерода, содержащийся в сбраживаемой среде, включает любой один компонент или комбинацию по меньшей мере из двух компонентов, а именно, глюкозы и мальтозы.

Источник азота, содержащийся в сбраживаемой среде, включает любой один компонент или комбинацию по меньшей мере из двух компонентов, а именно, триптона, дрожжевого порошка, соевой муки, отрубей, порошкообразного соевого пептида, пшеничного пептона, казеинового пептона, жидкого кукурузного экстракта, говяжьего экстракта и сульфата аммония.

Предпочтительно, источник азота, содержащийся в сбраживаемой среде, включает любой любой один компонент или комбинацию по меньшей мере из двух компонентов, а именно, говяжьего экстракта и триптона.

Неорганическая соль, содержащаяся в сбраживаемой среде, включает любую одну из солей или комбинацию по меньшей мере двух солей из NaH₂PO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄ и MgSO₄.

Предпочтительно, неорганическая соль, содержащаяся в сбраживаемой среде, представляет собой NaH₂PO₄.

Витамины, содержащиеся в сбраживаемой среде, включают любой один витамин или комбинацию по меньшей мере из двух витаминов, а именно, витамина B₁, витамина B₂, ниацина, пантотеновой кислоты, витамина B₆, витамина H и витамина B₁₂;

предпочтительно, витамины, содержащиеся в сбраживаемой среде, включают любой один витамин или комбинацию из двух витаминов, а именно, витамина B₁ и ниацина.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей сбраживаемый бульон Hericium erinaceus HT-3, где указанная композиция содержит эрготионеин, количество которого в сбраживаемом бульоне составляет по меньшей мере 41 мг/л, предпочтительно по меньшей мере 60 мг/л, более предпочтительно по меньшей мере 70 мг/л, еще более предпочтительно по меньшей мере 80 мг/л, а наиболее предпочтительно 90 мг/л, 100 мг/л, 110 мг/л, 120 мг/л, 130 мг/л, 140 мг/л или 150 мг/л. Hericium erinaceus HT-3 представляет собой Hericium erinaceus HT-3 CCTCC No. M 2018567 согласно изобретению.

Примеры

Пример 1

Скрининг штамма Hericium erinaceus на продуцирование эрготионеина

(1) Блоки ткани размером примерно 0,5×0,5 см вырезали из ворсинок плодовых тел Hericium erinaceus, образовавшихся на различных участках, помещали на твердую среду с PDA, содержащую антибиотики; культивировали при 24°С, и полученные мицелии инокулировали на твердой среде с PDA для очистки культуры. Очищенные штаммы инокулировали на скошенном PDA и хранили при 3~4°C для последующего использования;

(2) Твердые штаммы, полученные на стадии (1), инокулировали в сбраживаемую среду и культивировали при 24°С в течение 16 дней для получения бульона для ферментации мицелия. Среда для ферментации состояла из 35 г/л сахарозы, 20 г/л жидкого кукурузного экстракта, 3 г/л KH₂PO₄, 3 мг/л витамина B₁ и воды. После 10-дневной ферментации подавали аминокислоты-предшественники, цистеин, метионин и гистидин, каждую в концентрации 2 мМ, соответственно.

(3) По окончании ферментации, бульон для ферментации мицелия гомогенизировали при 4000 об/мин в течение 60 минут, а затем гомогенизированный сбраживаемый бульон нагревали до 80°C в течение 50 минут, после чего эрготионеин подвергали вымачивающей экстракции из клеток мицелия в сбраживаемый бульон, центрифугировали при 8000 об/мин в течение 20 минут, а затем супернатант удаляли для фильтрации через микропористый 0,22 мкм-фильтр, и штамм с самым высоким содержанием эрготионеина в фильтрате был отобран и назван Hericium erinaceus HT-3.

Пример 2

Морфологическое наблюдение Hericium erinaceus HT-3

Hericium erinaceus HT-3 CCTCC NO: M 2018567 быстро размножался на среде с картофельным агаром, содержащим декстрозу, прилипая к поверхности среды и распространяясь в эту среду с поверхности. После культивирования при 25°С в течение 8 дней, колония достигла 50-55 мм в диаметре, становилась белой и бархатистой, а затем радиально расширялась в окружающую среду и имела светло-коричневое основание. Морфологические характеристики колонии представлены на фиг. 1. Гифы штамма были прочными и толстыми, состояли из трубчатых клеток с тонкими клеточными стенками и имели перегородки, ветви и соединения пряжки, см. фиг. 2.

Пример 3

Идентификация и классификация Hericium erinaceus HT-3

Hericium erinaceus HT-3 был идентифицирован путем секвенирования генома компанией Shanghai Shenggong Biological Engineering (Shanghai) Co., Ltd. Штамм был идентифицирован как Hericium erinaceus, и имел следующую таксономию: Fungi, Dikarya, Basidiomycota, Agaricomycotina, Agaricomycetidae, Russulales, Hericiaceae, Hericium. Результат секвенирования гена 18s рРНК показан на фиг. 3, а результат секвенирования ITS показан на фиг. 4.

Пример 4

Детектирование эрготионеина

Сбраживаемый бульон HT-3 Примера 1 использовали в качестве тестируемого образца, а содержание эрготионеина определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Условия ВЭЖХ: Хроматографическая колонка: колонка Hypersil ODS C18 (250 мм × 4,6 мм, размер частиц 5 мкм); температура колонки: 30°C; подвижная фаза: ацетонитрил-вода (3:97); скорость потока: 1,0 мл/мин; длина волны детектирования: 254 нм; объем загрузки: 20 мкл. Хроматограмма показана на фиг. 4, где а) представляет собой стандартный продукт (концентрация эрготионеина составляет 9,4 мкг/мл), а b) представляет собой сбраживаемый бульон для ферментации HT-3.

Пример 5

Оптимизация сбраживаемой среды

В этом примере, для эксперимента были выбраны пять сбраживаемых сред с различными компонентами, содержанием и значениями pH. Состав и pH каждой сбраживаемой среды показаны ниже в Таблице 1.

(1) Скошенный мицелий Hericium erinaceus CCTCC NO: M 2018567 инокулировали в жидкую посевную среду и культивировали в течение 5-10 дней при 15~30°C и 100~300 об/мин.

Жидкая посевная среда: 4% (мас/об) сахарозы, 1,5% (мас/об) порошкообразной соевой муки, 0,2% (мас/об) дигидрофосфата натрия, 0,1% (мас/об) сульфата натрия и вода, добавленная до 100%.

(2) Посевной бульон, полученный на стадии (1), инокулировали в сбраживаемую среду для ферментации с добавлением веществ-предшественников и культивировали в течение 7-15 дней при 15~30°C и 100~300 об/мин. По окончании ферментации, сбраживаемый бульон собирали. Аминокислоты-предшественники, цистеин, метионин и гистидин, каждую в концентрации 2 мМ, добавляли на 10-й день ферментации.

(3) По окончании ферментации, бульон для ферментации мицелия гомогенизировали при 4000 об/мин в течение 60 минут, а затем гомогенизированный сбраживаемый бульон нагревали до 80°C в течение 50 минут, эрготионеин экстрагировали из клеток мицелия во внеклеточный сбраживаемый бульон, центрифугировали при 8000 об/мин в течение 20 минут, после чего супернатант удаляли для фильтрации через микропористый 0,22 мкм-фильтр и определяли содержание эрготионеина в фильтрате.

Было выбрано пять различных сред для ферментации, и оцененное содержание эрготионеина в конечном фильтрате показано в Таблице 1.

Таблица 1

Серийный номер Источник углерода Источник азота Неорганические соли Витамины Значение pH Содержание эрготионеина 1 Сахароза, 35 г/л Жидкий кукурузный экстракт, 20 г/л KH₂PO₄
3 г/л Витамин B₁
3 мг/л 4,5 132,1 мг/л 2 Растворимый крахмал, 20 г/л Триптон, 30 г/л KH₂PO₄
5 г/л Витамин B₆
5 мг/л 5,2 41,2 мг/л 3 Глюкоза, 60 г/л Говяжий экстракт, 10 г/л K₂HPO₄
3 г/л Витамин H
1 мг/л 5,0 150,3 мг/л 4 Мальтоза, 40 г/л Казеиновый пептон, 25 г/л KH₂PO₄
2 г/л Ниацин
2 мг/л 5,5 115,4 мг/л 5 Фруктоза, 40 г/л Пшеничный пептон, 25 г/л NaH₂PO₄
2 г/л Витамин B₁₂
2 мг/л 5,1 83,2 мг/л

В настоящее время описаны некоторые способы получения эрготионеина путем биологической ферментации. Так, например, эрготион может быть получен, например, путем культивирования мицелия Pleurotus eryngii в глубинно-жидкой культуре с выходом в конце ферментации, достигающим 62,20 мг/л; путем культивирования мицелия Lentinus edodes в глубинно-жидкой культуре с выходом в конце ферментации, достигающим 23,6 мг/л; путем жидкостной ферментации Lepista sordida с максимальным выходом 51 мг/л; путем жидкостной ферментации Pleurotus plumonarius с максимальным выходом 48 мг/л; путем жидкостной ферментации Pleurotus sapidus дикого типа с максимальным выходом 37 мг/л. Можно видеть, что выходы эрготионеина, полученного такими методами биологической ферментации, являются невысокими. Однако при использовании штамма согласно изобретению, более высокий выход эрготионеина может быть получен в условиях с использованием слегка оптимизированной среды.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> BLOOMAGE BIOTECHNOLOGY CORPORATION LIMITED

SHANDONG BLOOMAGE HYINC BIOPHARM CORPORATION LIMITED

<120> ШТАММ, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЭРГОТИОНЕИН, И СПОСОБ ЕГО СКРИНИНГА

<130> PB00324

<141> 2018-12-26

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1316

<212> ДНК/РНК

<213> Hericium erinaceus

<400> 1

ttgtactgtg aaactgcgaa tggctcatta aatcagttat agtttatttg atggtacctt

60

gctacatgga taactgtggt aattctagag ctaatacatg caattaagcc ccgacttccg

120

gaaggggtgt atttattaga taaaaaacca acgcggctcg ccgctccttt ggtgattcat

180

aataacttct cgaatcgcat ggccttgtgc cggcgatgct tcattcaaat atctgcccta

240

tcaactttcg atggtaggat agaggcctac catggtttca acgggtaacg gggaataagg

300

gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg

360

cgcaaattac ccaatcccga cacggggagg tagtgacaat aaataacaat atagggctct

420

tttgggtctt ataattggaa tgagtacaat ttaaatccct taacgaggaa caattggagg

480

gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat taaagttgtt

540

gcagttaaaa agctcgtagt tgaacttcag gcctggccgg gcggtctgcc taacggtatg

600

tactgtctgg ccgggcctta cctcctggtg agccggcatg cccttcactg ggtgtgtcgg

660

ggaaccagga cttttacctt gagaaaatta gagtgttcaa agcaggccta tgcccgaata

720

cattagcatg gaataataaa ataggacgtg cggttctatt ttgttggttt ctagaatcgc

780

cgtaatgatt aatagggata gttgggggca ttagtattgc gttgctagag gtgaaattct

840

tggatttacg caagactaac tactgcgaaa gcatttgcca aggatgtttt cattaatcaa

900

gaacgaaggt taggggatcg aaaacgatca gataccgttg tagtcttaac agtaaactat

960

gccgactagg gatcgggcga cctcaattta atgtgtcgct cggcacctta cgagaaatca

1020

aagtctttgg gttctggggg gagtatggtc gcaaggctga aacttaaagg aattgacgga

1080

agggcaccac caggagtgga gcctgcggct taatttgact caacacgggg aaactcacca

1140

ggtccagaca taactaggat tgacagattg atagctcttt cttgatttta tgggtggtgg

1200

tgcatggccg ttcttagttg gtggagtgat ttgtctggtt aattccgata acgaacgaga

1260

ccttaacctg ctaaatagcc cggccggctt ttgctggtcg ctggcttctt agaggg

1316

<210> 2

<211> 605

<212> ДНК/РНК

<213> Hericium erinaceus

<400> 2

tgcggaagga tcattaatga atttgaaagg agttgttgct ggcctgaaac ccaggcatgt

60

gcacgctcca atctcatcca tcttacacct gtgcaccctt gcgtgggtcc gtcggctttg

120

cggtcgatgg gcttgcgttt ttcataaact cttatgtatg taacagaatg tcataatgct

180

ataaacgcat cttatacaac tttcaacaac ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa

240

cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga

300

acgcaccttg cgccccttgg tattccgagg ggcacgcctg ttcgagtgtc gtgaaattct

360

caactcaatc ctcttgttat gagagggctg ggcttggact tggaggtctt gccggtgctc

420

cctcgggaag tcggctcctc ttgaatgcat gagtggatcc cttttgtagg gtttgccctt

480

ggtgtgataa ttatctacgc cgcgggtagc cttgcgttgg tctgcttcta accgtcttcg

540

gacaactttc atctcaactt gacctcgaat caggcgggac tacccgctga acttaagcat

600

atcat

605

<---

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм гриба Hericium erinaceus с депозитарным номером CCTCC No. M 2018567 для продуцирования эрготионеина. Также предложена композиция для продуцирования эрготионеина, содержащая указанный штамм гриба Hericium erinaceus в сбраживаемой среде, содержащей источник углерода, источник азота, неорганические соли и витамины. Изобретение обеспечивает высокий выход эрготионеина. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 5 пр.

1. Штамм гриба Hericium erinaceus с депозитарным номером CCTCC No. M 2018567 для продуцирования эрготионеина.

2. Штамм гриба Hericium erinaceus по п. 1, который имеет последовательность гена 18s рРНК, представленную в SEQ ID NO: 1.

3. Штамм гриба Hericium erinaceus по п. 1, который имеет последовательность ITS, представленную в SEQ ID NO: 2.

4. Штамм гриба Hericium erinaceus по п. 1, который продуцирует эрготионеин в сбраживаемом бульоне, где количество эрготионеина в сбраживаемом бульоне составляет более 41 мг/л, и где сбраживаемый бульон получают из сбраживаемой среды, содержащей источник углерода, источник азота, неорганические соли и витамины.

5. Композиция для продуцирования эрготионеина, содержащая штамм гриба Hericium erinaceus по любому из пп. 1-4 в сбраживаемой среде, содержащей источник углерода, источник азота, неорганические соли и витамины.