Тест-система на раннее выявление Porphyromonas gingivalis, участвующей в воспалительных реакциях Российский патент 2023 года по МПК C12N15/00 C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины и клинической стоматологии, заключается в определении патогенности бактерий присутствующих в полости рта и вызывающих болезни периодонта, оценке вероятного риска сердечно-сосудистых заболеваний, атеросклероза, инсульта, сахарного диабета, тяжелых респираторных инфекций, преждевременных родов и малого веса ребенка при рождении.

Болезни периодонта - группа воспалительных заболеваний, поражающих десну и находящиеся под ней альвеолярные отростки, поддерживающие зубы. Различают гингивит (воспаление десны) и периодонтит (воспаление периодонтальной связки, проявляющееся в прогрессивной резорбции альвеолярных отростков, увеличивающейся подвижности зубов и их потере на позднейших стадиях).

Бактериальные заболевания периодонта, несмотря на локальный характер очага поражения и воспаления, могут оказывать системное действие на состояние здоровья человека.

При периодонтите (форма болезни периодонта) происходит размножение пародонтопатогенных бактерий, которые разрушают ткань и вызывают ответ организма на патогены и продукты их жизнедеятельности. При этом проникновение бактерии или их токсинов в кровоток может способствовать развитию атеросклероза, тяжелых респираторных заболеваний, инсульта и других заболеваний [Veloso F. T. [et al] Extraintestinal manifestations of inflammatory bowel disease: do they influence treatment and outcome? // World J Gastroenterol. 2011. Р. 2702-2707].

Заболевание периодонта может приводить к развитию заболеваний сердца и инсульту мозга, за счет того, что бактерии и их патогены оказавшись в кровотоке могут взаимодействовать с жировыми бляшками в артериях, способствовать образованию небольших кровеносных сгустков и закупорке микрососудов. Кроме того, развивающийся при периодонтите воспалительный процесс и накопление цитоплазматических медиаторов воспаления может стимулировать образование атеросклеротических бляшек и утолщение стенок артерий [Stephen S. Dominy [et al] Porphyromonas gingivalis in Alzheimer's disease brains: Evidence for disease causation and treatment with small-molecule inhibitors. 2019].

Porphyromonas gingivalis идентифицирован в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера и его роль в патогенезе данного заболевания обусловлена нейротоксичностью гингипаинов, оказывающих вредное воздействие на тау-белок, необходимый для нормальной функции нейронов. Ингибирование гингипаина уменьшает бактериальную нагрузку мозга P. gingivalis, блокирует продукцию Aβ 1-42, уменьшает нейровоспаление и сохраняет нейроны в гиппокампе [Stephen S. Dominy [et al] Porphyromonas gingivalis in Alzheimer's disease brains: Evidence for disease causation and treatment with small-molecule inhibitors. 2019].

Определено влияние качественного и количественного состава орального микробиома на функциональную активность иммунной системы человека и развитие ревматоидного артрита [Zhang X [et. al.] The oral and gut microbiomes are perturbed in rheumatoid arthritis and partly normalized after treatment. 2015. P. 895-905].

С целью определения патогенности бактерий, обитающих в полости рта, предложен подход, основанный на определении специфических последовательностей геномной ДНК, кодирующих белковые факторы вирулентности гингипаины и фимбрии с помощью мультипраймерной ПЦР, одного из важнейших пародонтопатогенных микробов - Porphyromonas gingivalis.

Известен подход для определения пародонтогенных бактерий Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, основанный на проведении мультиплeкcнoй пoлимepaзнoй цeпнoй peaкции с помощью тест-системы, включающей кoмплeкт peaгeнтoв для пoдгoтoвки пpoбы, кoмплeкт для aмплификaции, coдepжaщий специфичные пpaймepы, пoлoжитeльный и oтpицaтeльный кoнтpoльныe oбpaзцы, и кoмплeкт для aнaлизa конечных пpoдyктoв. Пpимeнeниe изoбpeтeния обеспечивает oднoвpeмeннoe, быcтpoe, пpocтoe и тoчнoe oбнapyжeниe 5 видoв пapoдoнтoпaтoгeнoв в oднoй пpoбe (RU 2306341, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.09.2007).

Недостатком известного подхода является отсутствие возможности определения их патогенности, и в том, что каждая ПЦР-реакция проводится в отдельной пробирке.

Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке тест-системы на раннее выявление специфических последовательностей геномной ДНК и факторов вирулентности Porphyromonas gingivalis, состоящей из набора для ПЦР в реальном времени и набора реагентов для определения активности гингипаинов Kgp. Мультипраймерный ПЦР набор с проведением реакции в одной пробирке основан на применении разработанных и синтезированных олигонуклеотидных праймерах и зондов специфичных к генам, кодирующим белковые факторы вирулентности гингипаины и фимбрии.

Сущность изобретения заключается в том, что тест-система на раннее выявление Porphyromonas gingivalis, участвующей в воспалительных реакциях, включает набор для проведения ПЦР в реальном времени в одной пробирке и набор реагентов для определения активности гингипаинов Kgp, при этом набор ПЦР в режиме реального времени содержит ПЦР-бyфep, Taq-ДНК-полимеразу, дeзoкcинyклeoзидтpифocфaты, деонизированную воду, пoлoжитeльный и oтpицaтeльный кoнтpoльныe oбpaзцы ДHK. В комплект реагентов для амплификации включены: две пары прямых и обратных праймеров и зондов, для выявления гена Kgp кодирующего экзотоксическую протеазу Лиз-гингипаин, первая пара праймеров F-5’-ACTTTCTGGGTATGCGCACA-3’, R-5’-GGAAAACCGTCGTTGACTGC-3’, флуоресцентный зонд FAM-5’-CGGAAGCTATTCGTGGTCGT-3’-BHQ1, вторая пара праймеров: F-5’-GGAACCTGCATCCGGAAAGA-3’, R-5’-CGATCGTCTTCCATGAGGCA-3’, флуоресцентный зонд ROX-5-AGACGATTCACCTGCAAGCT-3’-BHQ2 и две пары прямых и обратных праймеров и зондов для выявления гена Mfa1-фимбрии, кодирующего белок, отвечающий за прикрепление к поверхностям клеток-хозяев, колонизацию, адгезию и агрегацию, образование биопленки - первая пара праймеров F-5’-GGGTGACGGACAGGATCAAG-3’, R-5’-CGATAGCATTGGCCTCGGAT-3’, флуоресцентный зонд Cy5-5’-CTGCAACCCACAATGCCATT-3’-RTQ2 и вторая пара праймеров F-5’-GCCGTAATCAGTGGAACTCAA-3’, R-5’-GAACGTATCCTGATCAGGCAA-3’, флуоресцентный зонд R6G-5’-GCTGCCTCGTCAGACTATAAGA-3’-RTQ1, концентрация каждого праймера и зонда равна 100 пкмоль/мкл. Набор реагентов для определения активности гингипаинов Kgp содержит специфические ингибиторы карбобензокси-Lys-Arg-CO-Lys-N-(CH₃)₂ и карбобензокси-Glu(NHN(CH₃)Ph)-Lys-CO-NHCH₂Ph и субстраты (человеческий коллаген I типа, фибриноген или карбобензокси-Phe-Arg-4-метил-7-кумариламид (MCA) и карбобензокси-His-Glu-Lys-MCA).

Изобретение осуществляется следующим образом.

В состав предложенной для определения патогенности Porphyromonas gingivalis тест-системы входят следующие компоненты: реакционная смесь (1000 мкл), ПЦР-буфер, Taq-ДНК-полимераза (1000 мкл), дезоксинуклеозидтрифосфаты дATФ, дГTФ, дЦTФ, дTTФ, MgCl₂, деионизированная вода, 4 пары олигонуклеотидных праймеров, 4 флуоресцентных зонда, отрицательный контрольный образец (водный раствор, обработанный нуклеазами, 200 мкл), положительный контрольный образец (ДHK peкoмбинaнтныx плaзмид c клoниpoвaнными фpaгмeнтaми нуклеотидных последовательностей генов гингипаинов и фимбрии Porphyromonas gingivalis).

Последовательности праймеров и ДНК-зондов для идентификации гена Kgp, кодирующего экзотоксическую протеазу Лиз-гингипаин: первая пара праймеров: F-5’-ACTTTCTGGGTATGCGCACA-3’, R-5’-GGAAAACCGTCGTTGACTGC-3’, флуоресцентный зонд FAM-5’-CGGAAGCTATTCGTGGTCGT-3’-BHQ1, где BHQ1 - темновой гаситель флуоресценции, a FAM - флуоресцентный краситель; вторая пара праймеров: F-5’-GGAACCTGCATCCGGAAAGA-3’, R-5’-CGATCGTCTTCCATGAGGCA-3’, флуоресцентный зонд ROX-5-AGACGATTCACCTGCAAGCT-3’-BHQ2, где BHQ2 - темновой гаситель флуоресценции, a ROX - флуоресцентный краситель. Для выявления отвечающей за прикрепление к поверхностям клеток-хозяев, колонизацию, адгезию и агрегацию, образование биопленки Mfa1-фимбрии P. gingivalis разработаны и синтезированы третья пара праймеров: F-5’-GGGTGACGGACAGGATCAAG-3’, R-5’-CGATAGCATTGGCCTCGGAT-3’, флуоресцентный зонд Cy5-5’-CTGCAACCCACAATGCCATT-3’-RTQ2, где RTQ2 - темновой гаситель флуоресценции, a Cy5 - флуоресцентный краситель; 4 пара праймеров: F-5’-GCCGTAATCAGTGGAACTCAA-3’, R-5’-GAACGTATCCTGATCAGGCAA-3’, флуоресцентный зонд R6G-5’-GCTGCCTCGTCAGACTATAAGA-3’-RTQ1, где RTQ1 - темновой гаситель флуоресценции, a R6G - флуоресцентный краситель. Концентрация каждого праймера и зонда равна 100 пкмоль/мкл.

Параметры программы циклов ПЦР в режиме реального времени: начальная денатурация: 95 °С - 5 мин, 1 цикл; денатурация: 95 °С - 10 с, 35 циклов; отжиг: 59 °С - 25 с, 35 циклов; элонгация: 72 °С - 30 с, 35 циклов; достраивание цепей ДНК: 72 °С - 30 с, 1 цикл.

Измерение протеолитической активности гингипаинов Kgp проводится с использованием белкового экстракта из слюны и ротовой жидкости зубодесневого кармана в присутствии и без специфических ингибиторов карбобензокси-Lys-Arg-CO-Lys-N-(CH₃)₂ и карбобензокси-Glu (NHN (CH₃)Ph)-Lys-CO-NHCH₂Ph в натрий-фосфатном буфере pH 7,5, содержащем субстраты (человеческий коллаген I типа, фибриноген или карбобензокси-Phe-Arg-4-метил-7-кумариламид (MCA) и карбобензокси-His-Glu-Lys-MCA). После 10-минутной инкубации при 40°C реакцию останавливают добавлением 100 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 5,0, содержащего 10 мМ йодуксусной кислоты. Определение активности гингипаинов при использовании синтетического субстрата проводят спектрофлуориметрическим методом при λ _{флуоресценции 460 нм}, λ _{возбуждения 380 нм}, при использовании белковых субстратов спектрофотометрическим методом Лоури. Доля активности, утерянной после воздействия ингибиторами, представляет собой активность гингипаинов.

Тест-система предназначена для использования в целях диагностики бактериального носительства и оценки бактериальной вирулентности при различных заболеваниях и предполагает поэтапное исследование, а именно забор биологического материала из ротовой полости (чаще всего используют десневую жидкость пародонтального кармана), пробоподготовку, выделение ДНК; проведение ПЦР в режиме реального времени на наличие патогенного микроба; определение протеолитической активности гингипаинов Kgp.

Пример 1.

У пациента 1966 года (женщина, 56 лет) жалоб нет, проходит поддерживающее пародонтологическое лечение, на этапе протезирования. Диагноз: Хронический пародонтит средней степени тяжести генерализованная форма в стадии ремиссии. В ходе исследования была выявлена концентрация микроба 2.112Е+01, протеолитическая активность гингипаинов Kgp равна 4 у.е.

Пример 2.

У пациента 1988 года (мужчина, 34 года) жалобы на кровоточивость при чистке зубов. Диагноз: хронический гингивит простой маргинальный, генерализованная форма в стадии ремиссии. В ходе исследования была выявлена концентрация микроба 3.584Е+04, протеолитическая активность гингипаинов Kgp равна 5 у.е.

Пример 3.

У пациента 1963 года (мужчина, 59 лет) жалобы на запах из полости рта, кровоточивость десен. Диагноз: хронический пародонтит генерализованная форма тяжелой степени тяжести в ремиссии, зубные отложения над- и поддесневые обильные, кровоточивость при зондировании 3 степени, галитоз. В ходе исследования была выявлена концентрация микроба 1.079Е+05, протеолитическая активность гингипаинов Kgp равна 7 у.е.

Пpeдлaгaeмый нaбop peaктивoв с представленными парами олигонуклеотидных праймеров и зондов для эффективного oпpeдeлeния пapoдoнтoпaтoгeнного микроорганизма Porphyromonas gingivalis обладает высокой чувствительностью и эффективностью, требует минимум времени для пробоподготвки и постановки реакции.

Изобретение относится к биотехнологии, заключается в определении патогенности бактерий, присутствующих в полости рта и вызывающих болезни периодонта, оценив вероятный риск сердечно-сосудистых заболеваний, атеросклероза, инсульта, сахарного диабета, тяжелых респираторных инфекций, преждевременных родов и малого веса ребенка при рождении. В комплект набора входят разработанные и синтезированные пары праймеров и зондов, специфичных к генам, кодирующим белковые факторы вирулентности гингипаины и фимбрии. Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке тест-системы на раннее выявление специфических последовательностей геномной ДНК Porphyromonas gingivalis. 3 пр.

Тест-система на раннее выявление Porphyromonas gingivalis, участвующей в воспалительных реакциях, включает набор для проведения ПЦР в реальном времени в одной пробирке и набор реагентов для определения активности гингипаинов Kgp, при этом набор ПЦР в режиме реального времени содержит ПЦР-бyфep, Taq-ДНК-полимеразу, дeзoкcинyклeoзидтpифocфaты, деонизированную воду, пoлoжитeльный и oтpицaтeльный кoнтpoльныe oбpaзцы ДHK, в комплект реагентов для амплификации включены: две пары прямых и обратных праймеров и зондов, для выявления гена Kgp, кодирующего экзотоксическую протеазу Лиз-гингипаин, первая пара праймеров F-5’-ACTTTCTGGGTATGCGCACA-3’, R-5’-GGAAAACCGTCGTTGACTGC-3’, флуоресцентный зонд FAM-5’-CGGAAGCTATTCGTGGTCGT-3’-BHQ1, вторая пара праймеров: F-5’-GGAACCTGCATCCGGAAAGA-3’, R-5’-CGATCGTCTTCCATGAGGCA-3’, флуоресцентный зонд ROX-5-AGACGATTCACCTGCAAGCT-3’–BHQ2 и две пары прямых и обратных праймеров и зондов для выявления гена Mfa1-фимбрии, кодирующего белок, отвечающий за прикрепление к поверхностям клеток-хозяев, колонизацию, адгезию и агрегацию, образование биопленки - первая пара праймеров F-5’-GGGTGACGGACAGGATCAAG-3’, R-5’-CGATAGCATTGGCCTCGGAT-3’, флуоресцентный зонд Cy5-5’-CTGCAACCCACAATGCCATT-3’-RTQ2 и вторая пара праймеров F-5’-GCCGTAATCAGTGGAACTCAA-3’, R-5’-GAACGTATCCTGATCAGGCAA-3’, флуоресцентный зонд R6G-5’-GCTGCCTCGTCAGACTATAAGA-3’-RTQ1, концентрация каждого праймера и зонда равна 100 пкмоль/мкл, набор реагентов для определения активности гингипаинов Kgp содержит специфические ингибиторы карбобензокси-Lys-Arg-CO-Lys-N-(CH₃)₂ и карбобензокси-Glu(NHN(CH₃)Ph)-Lys-CO-NHCH₂Ph и субстраты (человеческий коллаген I типа, фибриноген или карбобензокси-Phe-Arg-4-метил-7-кумариламид (MCA) и карбобензокси-His-Glu-Lys-MCA).