Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 815 068

(13)

(51)

МПК

C12Q1/6883(2018-01-01)

G01N33/68(2006-01-01)

C07K14/715(2006-01-01)

(21) (22)

Заявка

2020112474, 2018-09-05

(24)

Дата начала отсчета патента

2018-09-05

(22)

дата подачи заявки

2018-09-05

(45)

опубликовано

2024-03-11

(72)

авторы

Гонзага-Хауреги, Клаудиа Г.Хоровиц, Джули

(73)

патентообладатели

Ридженерон Фармасьютикалз, Инк.

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

XIONG HUIFANG et al., The sinomenine enteric-coated microspheres suppressed the TLR/NF-[kappa]B signaling in DSS-induced experimental colitis, INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY, 2017, vWO 1999032626 A1, 01.07.1999SHUNJI ISHIHARA et al., Inflammatory bowel disease: review from the aspect of genetics, JOURNAL OF

ВАРИАНТЫ БЕЛКА, РОДСТВЕННОГО РЕЦЕПТОРУ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 И СОДЕРЖАЩЕГО ОДИНОЧНЫЙ ДОМЕН ИММУНОГЛОБУЛИНА (SIGIRR), И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/6883 G01N33/68 C07K14/715

Описание патента на изобретение RU2815068C2

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке США № 62/554857, поданной 6 сентября 2017 г., которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

Ссылка на Перечень последовательностей

Данная заявка включает Перечень последовательностей, поданный в электронной форме в виде текстового файла под названием 18923800602SEQ, созданного 30 августа 2018 г., с размером 56 килобайт. Перечень последовательностей включен в данный документ посредством ссылки.

Область техники изобретения

Данное раскрытие в целом относится к области генетики. В частности, данное раскрытие относится к генным изменениям и полипептидным вариантам белка, родственного рецептору интерлейкина-1 и содержащего одиночный домен иммуноглобулина (SIGIRR; англ. «Single Immunoglobulin Interleukin-1 Receptor Related»), которые связаны, например, с воспалительным заболеванием кишечника с началом в раннем возрасте (ВЗК-РВ).

Уровень техники изобретения

Различные ссылки, включая патенты, патентные заявки, номера доступа, технические статьи и научные статьи, цитируются в тексте данного описания. Каждая ссылка в полном объеме и во всех целях включена в данный документ посредством ссылки.

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) является генетически гетерогенным, хроническим воспалительным расстройством, вызванным неадекватным иммунным ответом на комменсальную микробиоту в желудочно-кишечном тракте, со средним возрастом начала в 30 лет. Тяжелые моногенные формы ВЗК могут наблюдаться с началом в детском возрасте (<18 лет) и были связаны с редкими высокопенетрантными вариантами в около 50 «менделевских» генах. Однако генетическая архитектура воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте (ВЗК-РВ) плохо изучена, а большинство пациентов остаются генетически не диагностированными.

В данном раскрытии предложены варианты SIGIRR, которые помогут понять биологию SIGIRR и облегчат диагностику и лечение детей с воспалительным заболеванием кишечника с началом в раннем возрасте.

Краткое описание сущности изобретения

В данном раскрытии предложены новые молекулы нуклеиновых кислот (т.е. геномная ДНК, мРНК и кДНК), кодирующие вариантные полипептиды SIGIRR, и вариантные полипептиды SIGIRR, которые, как продемонстрировано в данном документе, связаны с воспалительным заболеванием кишечника, таким как воспалительное заболевание кишечника с началом в раннем возрасте.

В частности, в данном раскрытии предложены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий белок SIGIRR, при этом белок усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, или комплементарную цепь последовательности нуклеиновой кислоты.

В данном раскрытии также предложены молекулы геномной ДНК, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере часть человеческого белка SIGIRR, при этом белок усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, или комплементарную цепь последовательности нуклеиновой кислоты.

В данном раскрытии также предложены молекулы кДНК, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере часть человеческого белка SIGIRR, при этом белок усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, или комплементарную цепь последовательности нуклеиновой кислоты.

В данном раскрытии также предложены молекулы мРНК, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере часть человеческого белка SIGIRR, при этом белок усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, или комплементарную цепь последовательности нуклеиновой кислоты.

В данном раскрытии также предложены векторы, содержащие любую из выделенных молекул нуклеиновых кислот, раскрытых в данном документе.

В данном раскрытии также предложены композиции, содержащие любые из выделенных молекул нуклеиновых кислот или векторов, раскрытых в данном документе, и носитель.

В данном раскрытии также предложены клетки-хозяева, содержащие любые из выделенных молекул нуклеиновых кислот или векторов, раскрытых в данном документе.

В данном раскрытии также предложены выделенные рекомбинантные полипептиды, содержащие по меньшей мере часть человеческого белка SIGIRR, при этом белок усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В данном раскрытии также предложены композиции, содержащие любые из выделенных или рекомбинантных полипептидов, раскрытых в данном документе, и носитель.

В данном раскрытии также предложены зонд или праймер, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере около 5 нуклеотидов, которая гибридизируется с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий белок SIGIRR, при этом белок усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, или которая гибридизируется с комплементарной цепью последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий белок SIGIRR, при этом белок усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В данном раскрытии также предложены подложки, содержащие субстрат, с которым может гибридизироваться любой из раскрытых в данном документе зондов.

В данном раскрытии также предложен специфический в отношении изменения зонд или праймер, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, при этом специфический в отношении изменения зонд или праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной к части молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей любую из некоторого количества позиций, соответствующих позициям 186-209 или 211-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или праймер специфически гибридизируется с частью молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей позицию, соответствующую позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, или ее комплементарной цепью. Специфический в отношении изменения зонд или праймер не гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок SIGIRR дикого типа.

Краткое описание графических материалов

Прилагающиеся фигуры, которые включены в это описание и составляют его часть, иллюстрируют несколько аспектов и вместе с описанием служат для пояснения принципов данного изобретения.

На Фиг. 1, панели A, B и C, проиллюстрирован усеченный вариант в SIGIRR с доминантной сегрегацией в семье с болезнью Крона.

На Фиг. 2 проиллюстрированы результаты из панели провоспалительных цитокинов мезомасштабного первичного исследования, проводимого на клеточных культуральных супернатантах, взятых из ЛКЛ, созданных из клеток здоровых доноров, пациента с ПФ-SIGIRR и 4 пациентов с ВЗК-РВ, не имеющих ПФ-SIGIRR, без стимуляции или с обработкой 2 мг/мл ЛПС в течение 72 часов.

На Фиг. 3 проиллюстрированы результаты из панели провоспалительных цитокинов мезомасштабного первичного исследования, проводимого на клеточных культуральных супернатантах, взятых из ЛКЛ, созданных из клеток здоровых доноров, пациента с ПФ-SIGIRR и 4 пациентов с ВЗК-РВ, не имеющих ПФ-SIGIRR, без стимуляции или с обработкой 2 мг/мл анти-IgM/анти-CD40 в течение 16 часов.

Дополнительные преимущества данного раскрытия будут частично приведены в нижеследующем описании, и частично станут очевидны из описания или же могут быть определены при практической реализации раскрытых в данном документе вариантов осуществления. Преимущества данного раскрытия будут реализованы и обеспечены с помощью элементов и комбинаций, явно указанных в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что как вышеприведенное общее описание, так и нижеприведенное подробное описание являются исключительно иллюстративными и пояснительными и не ограничивают заявляемых вариантов осуществления.

Описание

В тексте описания и в формуле изобретения используются различные термины, относящиеся к аспектам раскрытия. Таким терминам следует приписывать их обычное значение в данной области техники, если не указано иное. Другие явным образом определенные термины следует толковать образом, согласующимся с приведенным в данном документе определением.

Если явным образом не указано иное, никоим образом не подразумевается, что любой приведенный в данном документе способ или аспект следует толковать как требующий проведения его этапов в конкретном порядке. Соответственно, если в связанном со способом пункте в формуле изобретения или описаниях явным образом не указано, что этапы следует ограничить конкретным порядком, никоим образом не подразумевается, что порядок следует нарушать, в любом отношении. Это справедливо для любого возможного не заявленного базиса для интерпретации, включая вопросы логики в отношении порядка этапов или технологической схемы, очевидное значение, вытекающее из грамматического построения или пунктуации, или число или тип аспектов, описанных в изобретении.

В контексте данного документа формы единственного числа включают отсылки на множественное число, если из контекста явным образом не следует иное.

В контексте данного документа термины «субъект» и «пациент» используются взаимозаменяемо. Субъект может включать любое животное, включая млекопитающих. Млекопитающие включают, без ограничения, сельскохозяйственных животных (например, лошадей, коров, свиней), домашних животных (например, собак, кошек), лабораторных животных (например, мышей, крыс, кроликов) и отличных от человека приматов. В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.

В контексте данного документа «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «последовательность нуклеиновой кислоты», «полинуклеотид» или «олигонуклеотид» могут содержать полимерную форму нуклеотидов любой длины, могут содержать ДНК и/или РНК и могут быть одноцепочечными, двухцепочечными или многоцепочечными. Одна цепь нуклеиновой кислоты также называется ее комплементарной цепью.

В контексте данного документа выражение «соответствует» или его грамматические вариации, употребляемые в контексте нумерации заданной аминокислотной или нуклеотидной последовательности или позиции, относятся к нумерации конкретной референсной последовательности, когда заданную аминокислотную или нуклеотидную последовательность сравнивают с референсной последовательностью (например, в данном документе референсная последовательность представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты или полипептид (дикого типа или полноразмерные) SIGIRR). Другими словами, номер остатка (например, аминокислоты или нуклеотида) или позицию остатка (например, аминокислоты или нуклеотида) заданного полимера обозначают относительно референсной последовательности, а не согласно действительной числовой позиции остатка в заданной аминокислотной или нуклеотидной последовательности. Например, заданную аминокислотную последовательность можно выровнять с референсной последовательностью путем внесения промежутков для оптимизации совпадений остатков между двумя последовательностями. В таких случаях, хотя промежутки и присутствуют, нумерацию остатка в заданной аминокислотной или нуклеотидной последовательности делают относительно референсной последовательности, с которой ее выравнивали.

Например, выражение «белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9» (и подобные выражения) означает, что если аминокислотную последовательность белка SIGIRR выравнивают с последовательностью SEQ ID NO:9, белок SIGIRR усечен по позиции, которая соответствует позиции 215 в SEQ ID NO:9 (например, концевой аминокислотой белка SIGIRR является аминокислота в позиции 215). Или, другими словами, эти выражения относятся к белку SIGIRR, который имеет усечение в позиции, которая является гомологичной позиции 215 в SEQ ID NO:9. В данном документе такой белок также называют «усеченным белком SIGIRR» или «вариантом p.K186fs*31».

Белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, легко можно идентифицировать, проводя выравнивание последовательностей между заданным белком SIGIRR и аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9. Аналогично, белок SIGIRR, имеющий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, легко можно идентифицировать, проводя выравнивание последовательностей между заданным белком SIGIRR и аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9. Существует ряд вычислительных алгоритмов, которые можно использовать для проведения выравнивания последовательностей с целью идентификации усечения в позиции, которая соответствует позиции 215 в SEQ ID NO:9, или идентификации серина в позиции, которая соответствует позиции 186 в SEQ ID NO:9. Например, используя алгоритм NCBI BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402) или программное обеспечение CLUSTALW (Sievers et al., 2014, Methods Mol. Biol., 1079, 105-116), можно проводить выравнивание последовательностей. При этом последовательности также можно выравнивать вручную.

В соответствии с раскрытием наблюдали, что определенные вариации в SIGIRR связаны с риском развития воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте. В общем случае функция этого белка не до конца понятна, в частности, у детей возрастом до 18 лет. Считается, что ни один из вариантов в гене SIGIRR или белке не имеет известных ассоциаций с воспалительным заболеванием кишечника с началом в раннем возрасте у человека. Дополнительно считается, что ни один из вариантов в гене SIGIRR или белке не имеет известных ассоциаций с воспалительным заболеванием кишечника с началом в раннем возрасте, в частности, у детей. В соответствии с данным раскрытием был идентифицирован редкий вариант в гене SIGIRR, сегрегирующий с фенотипом воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте у пораженных членов одной семьи. Например, согласно наблюдениям, генетическое изменение, которое приводит к делеции аденина в позиции 557 мРНК или кДНК человеческого SIGIRR (например, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:5 дикого типа соответственно), которая приводит к сдвигу рамки с получением белка SIGIRR, усеченного по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9 (например, концевая аминокислота расположена в позиции 215), указывает на то, что у человека, имеющего такое изменение, может развиваться воспалительное заболевание кишечника с началом в раннем возрасте. В целом, описанный в данном документе генетический анализ позволил предположить, что ген SIGIRR и, в частности, варианты с усечением или потерей функции в гене SIGIRR, связаны с повышенной подверженностью развитию воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте. Следовательно, субъектов-людей, которые имеют изменения SIGIRR, которые связаны с воспалительным заболеванием кишечника с началом в раннем возрасте, можно лечить так, чтобы ингибировать воспалительное заболевание кишечника с началом в раннем возрасте, уменьшать его симптомы и/или подавлять развитие симптомов. Соответственно, в данном раскрытии предложены выделенные или рекомбинантные вариантные гены SIGIRR, включая кДНК и мРНК, а также выделенные или рекомбинантные вариантные полипептиды SIGIRR. Дополнительно, в данном раскрытии предложены способы максимального использования идентификации таких вариантов у субъектов для идентификации или стратификации риска развития у таких субъектов воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте или для диагностики субъектов как имеющих воспалительное заболевание кишечника или воспалительное заболевание кишечника с началом в раннем возрасте так, чтобы можно было проводить лечение субъектов, подверженных риску, или субъектов с активным заболеванием.

Аминокислотные последовательности двух белков SIGIRR дикого типа приведены в SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8. Белок SIGIRR дикого типа, имеющий SEQ ID NO:7, имеет длину 410 аминокислот, тогда как белок SIGIRR дикого типа, имеющий SEQ ID NO:8, имеет длину 504 аминокислоты. В случае как SEQ ID NO:7, так и SEQ ID NO:8, позиции 186-215 белков дикого типа содержат следующие аминокислоты в указанном порядке: Lys-Pro-Gln-Leu-Glu-Arg-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Leu-Phe-Leu-Asp-Asp-Arg-Asp-Leu-Leu-Pro-Arg-Ala-Glu-Pro-Ser-Ala-Asp-Leu-Leu (SEQ ID NO:10).

В данном раскрытии предложены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие вариантные белки SIGIRR, которые связаны с воспалительным заболеванием кишечника или воспалительным заболеванием кишечника с началом в раннем возрасте. В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот кодируют усеченный вариантный белок SIGIRR. Например, в данном раскрытии предложены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий белок SIGIRR, при этом белок усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, или комплементарную цепь последовательности нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует усеченный белок SIGIRR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует человеческий белок SIGIRR, имеющий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9, или комплементарной цепи последовательности нуклеиновой кислоты. В данном документе, если приводится ссылка на процент идентичности последовательностей, более высокие значения процента идентичности последовательностей предпочтительнее более низких.

В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует усеченный белок SIGIRR, причем усеченный белок SIGIRR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9, и содержит серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

Последовательность нуклеиновой кислоты геномной ДНК SIGIRR дикого типа приведена в SEQ ID NO:1. Геномная ДНК SIGIRR дикого типа, содержащая SEQ ID NO:1, имеет длину 11739 нуклеотидов. В случае SEQ ID NO:1, позиция 9962 геномной ДНК SIGIRR дикого типа представлена аденином.

В данном раскрытии предложены молекулы геномной ДНК, кодирующие вариантный белок SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления молекулы геномной ДНК кодируют усеченный белок SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления геномная ДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления геномная ДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления геномная ДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий следующую аминокислотную последовательность в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. Ser-Arg-Ser-Trp-Ser-Gly-Val-Gly-Ala-Thr-Ser-Ser-Ser-Trp-Thr-Thr-Ala-Thr-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Trp (SEQ ID NO:11). В некоторых вариантах осуществления геномная ДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариантный белок SIGIRR, имеющий по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления геномная ДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, имеющий SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления геномная ДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует усеченный белок SIGIRR, причем усеченный белок SIGIRR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9, и содержит серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления геномная ДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей гуанин в позиции, соответствующей позиции 9962 в соответствии с SEQ ID NO:2. В противоположность этому, геномная ДНК SIGIRR дикого типа содержит аденин в позиции, соответствующей позиции 9962 в соответствии с SEQ ID NO:1. Изменение в геномной ДНК вариантного SIGIRR связано с делецией этого аденина, что приводит к сдвигу рамки на один нуклеотид, таким образом, приводя к появлению гуанина в позиции, соответствующей позиции 9962 в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления геномная ДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления геномная ДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат меньше, чем полную последовательность геномной ДНК. В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат или состоят из по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 400, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 600, по меньшей мере около 700, по меньшей мере около 800, по меньшей мере около 900, по меньшей мере около 1000, по меньшей мере около 2000, по меньшей мере около 3000, по меньшей мере около 4000, по меньшей мере около 5000, по меньшей мере около 6000, по меньшей мере около 7000, по меньшей мере около 8000, по меньшей мере около 9000, по меньшей мере около 10000, по меньшей мере около 11000 или по меньшей мере около 11500 смежных нуклеотидов SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат или состоят из от по меньшей мере около 1000 до по меньшей мере около 2000 смежных нуклеотидов SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат или состоят из по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 400, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 600, по меньшей мере около 700, по меньшей мере около 800, по меньшей мере около 900, по меньшей мере около 1000, по меньшей мере около 1000, по меньшей мере около 1100, по меньшей мере около 1200, по меньшей мере около 1300, по меньшей мере около 1400, по меньшей мере около 1500, по меньшей мере около 1600, по меньшей мере около 1700, по меньшей мере около 1800, по меньшей мере около 1900, по меньшей мере около 2000, по меньшей мере около 2100, по меньшей мере около 2200, по меньшей мере около 2300, по меньшей мере около 2400 или по меньшей мере около 2500 смежных нуклеотидов SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления такие смежные нуклеотиды можно комбинировать с другими молекулами нуклеиновых кислот из смежных нуклеотидов для получения молекул кДНК, описанных в данном документе.

Такие выделенные молекулы нуклеиновых кислот можно использовать, например, для экспрессии мРНК и белков вариантного SIGIRR или в качестве экзогенных донорных последовательностей. Следует понимать, что генные последовательности в популяции могут варьироваться вследствие полиморфизмов, таких как ОНП. Приведенные в данном документе примеры представляют всего лишь типовые последовательности, но также возможны и другие последовательности.

В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат миниген вариантного SIGIRR, в котором были удалены один или более несущественных сегментов, кодирующих SEQ ID NO:9, относительно соответствующей геномной ДНК SIGIRR дикого типа. В некоторых вариантах осуществления удаленные несущественные сегменты содержат одну или более интронных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления миниген SIGIRR имеет по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности последовательности с частью SEQ ID NO:2, причем миниген содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую гуанин в позиции, соответствующей позиции 9962 в соответствии с SEQ ID NO:2.

Последовательность нуклеиновой кислоты мРНК SIGIRR дикого типа приведена в SEQ ID NO:3. мРНК SIGIRR дикого типа, содержащая SEQ ID NO:3, имеет длину 1230 нуклеотидов. В случае SEQ ID NO:3, позиция 557 мРНК SIGIRR дикого типа представлена аденином.

В данном раскрытии также предложены молекулы мРНК, кодирующие вариантный белок SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления молекулы мРНК кодируют усеченный белок SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий следующую аминокислотную последовательность в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. Ser-Arg-Ser-Trp-Ser-Gly-Val-Gly-Ala-Thr-Ser-Ser-Ser-Trp-Thr-Thr-Ala-Thr-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Trp (SEQ ID NO:11). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариантный белок SIGIRR, имеющий по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, имеющий SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует усеченный белок SIGIRR, причем усеченный белок SIGIRR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9, и содержит серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей гуанин в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:4. В противоположность этому, мРНК SIGIRR дикого типа содержит аденин в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:3. Изменение в мРНК вариантного SIGIRR связано с делецией этого аденина, что приводит к сдвигу рамки на один нуклеотид, таким образом, приводя к появлению гуанина в позиции, соответствующей позиции 557 в SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей кодоны CUA и AGC в позициях, соответствующих позициям 553-555 и 556-558, соответственно, в соответствии с SEQ ID NO:4. В противоположность этому, мРНК SIGIRR дикого типа содержит кодоны CUA и AAG в позициях, соответствующих позициям 553-555 и 556-558, соответственно, в соответствии с SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO:4.

В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит меньше нуклеотидов, чем полная последовательность мРНК SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат или состоят из по меньшей мере около 5, по меньшей мере около 8, по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 12, по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 400, по меньшей мере около 500, или по меньшей мере около 600 смежных нуклеотидов SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат или состоят из от по меньшей мере около 200 до по меньшей мере около 500 смежных нуклеотидов SEQ ID NO:4. В этом отношении более длинные молекулы мРНК предпочтительнее более коротких. В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат или состоят из по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 400 или по меньшей мере около 500 смежных нуклеотидов SEQ ID NO:4. В этом отношении более длинные молекулы мРНК предпочтительнее более коротких. В некоторых вариантах осуществления такие молекулы мРНК содержат кодон, который кодирует серин в позиции, которая соответствует позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления такие молекулы мРНК содержат гуанин в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления такие молекулы мРНК содержат кодоны CUA и AGC в позициях, соответствующих позициям 553-555 и 556-558, соответственно, в соответствии с SEQ ID NO:4.

Последовательность нуклеиновой кислоты кДНК SIGIRR дикого типа приведена в SEQ ID NO:5. кДНК SIGIRR дикого типа, содержащая SEQ ID NO:5, имеет длину 1233 нуклеотида, включая стоп-кодон. В случае SEQ ID NO:5, позиция 557 кДНК SIGIRR дикого типа представлена аденином.

В данном раскрытии также предложены молекулы кДНК, кодирующие вариантный белок SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления молекулы кДНК кодируют усеченный белок SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления кДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления кДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления кДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий следующую аминокислотную последовательность в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. Ser-Arg-Ser-Trp-Ser-Gly-Val-Gly-Ala-Thr-Ser-Ser-Ser-Trp-Thr-Thr-Ala-Thr-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Trp (SEQ ID NO:11). В некоторых вариантах осуществления кДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариантный белок SIGIRR, имеющий по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления кДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, имеющий SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления кДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует усеченный белок SIGIRR, причем усеченный белок SIGIRR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9, и содержит серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления кДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей гуанин в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:6. В противоположность этому, кДНК SIGIRR дикого типа содержит аденин в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:5. Изменение в кДНК вариантного SIGIRR связано с делецией этого аденина, что приводит к сдвигу рамки на один нуклеотид, таким образом, приводя к появлению гуанина в позиции, соответствующей позиции 557 в SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления кДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей кодоны CTA и AGC в позициях, соответствующих позициям 553-555 и 556-558, соответственно, в соответствии с SEQ ID NO:6. В противоположность этому, кДНК SIGIRR дикого типа содержит кодоны CTA and AAG в позициях, соответствующих позициям 553-555 и 556-558, соответственно, в соответствии с SEQ ID NO:5. В некоторых вариантах осуществления кДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления кДНК содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO:6.

В некоторых вариантах осуществления молекулы кДНК содержат менее, чем целую последовательность молекулы кДНК вариантного SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления молекулы кДНК содержат или состоят из по меньшей мере около 5, по меньшей мере около 8, по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 12, по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 400, по меньшей мере около 500, или по меньшей мере около 600 смежных нуклеотидов SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления молекулы кДНК содержат или состоят из от по меньшей мере около 200 до по меньшей мере около 500 смежных нуклеотидов SEQ ID NO:6. В этом отношении более длинные молекулы кДНК предпочтительнее более коротких. В некоторых вариантах осуществления молекулы кДНК содержат или состоят из по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 400 или по меньшей мере около 500 смежных нуклеотидов SEQ ID NO:6. В этом отношении более длинные молекулы кДНК предпочтительнее более коротких. В некоторых вариантах осуществления такие молекулы кДНК содержат кодон, который кодирует серин в позиции, которая соответствует позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления такие молекулы кДНК содержат гуанин в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления такие молекулы кДНК содержат кодоны CTA и AGC в позициях, соответствующих позициям 553-555 и 556-558, соответственно, в соответствии с SEQ ID NO:4.

В данном раскрытии также предложены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые гибридизируются с геномной ДНК вариантного SIGIRR (такой как SEQ ID NO:2), минигенами вариантного SIGIRR, мРНК вариантного SIGIRR (такой как SEQ ID NO:4) и/или кДНК вариантного SIGIRR (такой как SEQ ID NO:6). В некоторых вариантах осуществления такие выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат или состоят из по меньшей мере около 5, по меньшей мере около 8, по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 11, по меньшей мере около 12, по меньшей мере около 13, по меньшей мере около 14, по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 16, по меньшей мере около 17, по меньшей мере около 18, по меньшей мере около 19, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 21, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 23, по меньшей мере около 24, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 55, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 65, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 75, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 85, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 95, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 400, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 600, по меньшей мере около 700, по меньшей мере около 800, по меньшей мере около 900, по меньшей мере около 1000, по меньшей мере около 2000, по меньшей мере около 3000, по меньшей мере около 4000, по меньшей мере около 5000, по меньшей мере около 6000, по меньшей мере около 7000, по меньшей мере около 8000, по меньшей мере около 9000, по меньшей мере около 10000, по меньшей мере около 11000 или по меньшей мере около 11500 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из по меньшей мере 15 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из от по меньшей мере 15 нуклеотидов до по меньшей мере около 35 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления такие выделенные молекулы нуклеиновых кислот гибридизируются с геномной ДНК вариантного SIGIRR (такой как SEQ ID NO:2), минигенами вариантного SIGIRR, мРНК вариантного SIGIRR (такой как SEQ ID NO:4) и/или кДНК вариантного SIGIRR (такой как SEQ ID NO:6) в жестких условиях. Такие молекулы нуклеиновых кислот можно использовать, например, в качестве зондов, в качестве праймеров или в качестве специфических в отношении изменения зондов или праймеров, как описано и проиллюстрировано в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновых кислот гибридизируются с по меньшей мере около 15 смежными нуклеотидами молекулы нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на около 70%, по меньшей мере на около 75%, по меньшей мере на около 80%, по меньшей мере на около 85%, по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95%, по меньшей мере на около 96%, по меньшей мере на около 97%, по меньшей мере на около 98%, по меньшей мере на около 99% или 100% идентична геномной ДНК вариантного SIGIRR (такой как SEQ ID NO:2), минигенам вариантного SIGIRR, мРНК вариантного SIGIRR (такой как SEQ ID NO:4) и/или кДНК вариантного SIGIRR (такой как SEQ ID NO:6). В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат или состоят из от около 15 до около 100 нуклеотидов или от около 15 до около 35 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат или состоят из от около 15 до около 100 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат или состоят из от около 15 до около 35 нуклеотидов

В некоторых вариантах осуществления любые из молекул нуклеиновых кислот, молекул геномной ДНК, молекул кДНК или молекул мРНК, раскрытых в данном документе, могут быть очищены, например, являются по меньшей мере на около 90% чистыми. В некоторых вариантах осуществления любые из молекул нуклеиновых кислот, молекул геномной ДНК, молекул кДНК или молекул мРНК, раскрытых в данном документе, могут быть очищены, например, являются по меньшей мере на около 95% чистыми. В некоторых вариантах осуществления любые из молекул нуклеиновых кислот, молекул геномной ДНК, молекул кДНК или молекул мРНК, раскрытых в данном документе, могут быть очищены, например, являются по меньшей мере на около 99% чистыми. Очистка проводится человеком с помощью разработанных человеком методик очистки.

В данном раскрытии также предложены фрагменты любой из выделенных молекул нуклеиновых кислот, молекул геномной ДНК, молекул кДНК или молекул мРНК, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления фрагменты содержат или состоят из по меньшей мере около 5, по меньшей мере около 8, по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 11, по меньшей мере около 12, по меньшей мере около 13, по меньшей мере около 14, по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 16, по меньшей мере около 17, по меньшей мере около 18, по меньшей мере около 19, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 21, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 23, по меньшей мере около 24, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 55, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 65, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 75, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 85, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 95 или по меньшей мере около 100 смежных остатков любой из раскрытых в данном документе последовательностей нуклеиновых кислот или любой их комплементарной цепи. В этом отношении более длинные фрагменты предпочтительнее более коротких. В некоторых вариантах осуществления фрагменты содержат или состоят из по меньшей мере около 5, по меньшей мере около 8, по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 11, по меньшей мере около 12, по меньшей мере около 13, по меньшей мере около 14, по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 16, по меньшей мере около 17, по меньшей мере около 18, по меньшей мере около 19, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 21, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 23, по меньшей мере около 24, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45 или по меньшей мере около 50 смежных остатков. В этом отношении более длинные фрагменты предпочтительнее более коротких. В некоторых вариантах осуществления фрагменты содержат или состоят из по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30 или по меньшей мере около 35 смежных остатков. В некоторых вариантах осуществления фрагменты содержат или состоят из по меньшей мере около 20 смежных остатков. В некоторых вариантах осуществления фрагменты содержат или состоят из по меньшей мере около 25 смежных остатков. В некоторых вариантах осуществления фрагменты содержат или состоят из по меньшей мере около 30 смежных остатков. В некоторых вариантах осуществления фрагменты содержат или состоят из по меньшей мере около 35 смежных остатков. Подразумевается, что фрагменты содержат или состоят из части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, или кодирует позиции, соответствующие позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. Такие фрагменты можно использовать, например, в качестве зондов, в качестве праймеров или в качестве аллель-специфических праймеров, как описано и проиллюстрировано в данном документе.

В данном раскрытии также предложены зонды и праймеры. Зонд или праймер согласно данному раскрытию имеют последовательность нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизируется с любой из раскрытых в данном документе молекул нуклеиновых кислот или их комплементарной цепью. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер специфически гибридизируется с любой из раскрытых в данном документе молекул нуклеиновых кислот в жестких условиях. В данном раскрытии также предложены молекулы нуклеиновых кислот, имеющие последовательности нуклеиновых кислот, которые гибридизируются в умеренных условиях с любой из раскрытых в данном документе молекул нуклеиновых кислот или их комплементарной цепью. Зонд или праймер в соответствии с раскрытием предпочтительно включает кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, или ее комплементарной цепи. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления в данном раскрытии предложены специфические в отношении изменения праймеры, которые более подробно определены выше и ниже по тексту.

Зонд в соответствии с данным раскрытием можно использовать для обнаружения молекулы нуклеиновой кислоты вариантного SIGIRR (например, геномной ДНК, мРНК и/или кДНК), кодирующей вариантный белок SIGIRR (например, в соответствии с SEQ ID NO:9). Кроме того, праймер в соответствии с данным раскрытием можно использовать для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный белок SIGIRR, или ее фрагмента. В данном раскрытии также предложена пара праймеров, содержащая один из праймеров, описанных выше. Для геномной амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) фрагмента SIGIRR, содержащего вариант со сдвигом рамки, приводящий к усечению, подходящие последовательности праймеров включают, но не ограничиваются этим: прямой праймер (от 5' к 3'): TCAGTGGCTCTGAACTGCAC (SEQ ID NO:12) и обратный праймер (от 5' к 3'): GGTCCTGTTGAGCAGAGGAG (SEQ ID NO:13).

Раскрытые в данном документе молекулы нуклеиновых кислот могут содержать встречающуюся в природе последовательность нуклеиновой кислоты геномной ДНК, кДНК или мРНК-транскрипта SIGIRR или могут содержать не встречающуюся в природе последовательность. В некоторых вариантах осуществления встречающаяся в природе последовательность может отличаться от не встречающейся в природе последовательности вследствие синонимичных мутаций или мутаций, которые не влияют на кодируемый полипептид SIGIRR. Например, последовательность может быть идентичной за исключением синонимичных мутаций или мутаций, которые не влияют на кодируемый полипептид SIGIRR. Синонимичная мутация или замена представляет собой замену одного нуклеотида другим в экзоне гена, кодирующего белок, так, что получаемая аминокислотная последовательность остается немодифицированной. Это возможно вследствие вырожденности генетического кода, когда некоторые аминокислоты кодируются более чем одним кодоном из трех пар оснований. Синонимичные замены используют, например, в процессе оптимизации кодонов. Раскрытые в данном документе молекулы нуклеиновых кислот могут быть кодон-оптимизированными.

Также в данном документе предложены функциональные полинуклеотиды, которые могут взаимодействовать с раскрытыми молекулами нуклеиновых кислот. Функциональные полинуклеотиды представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, которые имеют конкретную функцию, такую как связывание целевой молекулы или катализ конкретной реакции. Примеры функциональных полинуклеотидов включают, но не ограничиваются этим, антисмысловые молекулы, аптамеры, рибозимы, образующие тройную спираль молекулы и внешние направляющие последовательности. Функциональные полинуклеотиды могут действовать как эффекторы, ингибиторы, модуляторы и стимуляторы конкретной активности, которой обладает целевая молекула, или же функциональные полинуклеотиды могут обладать de novo активностью независимо от каких-либо других молекул.

Антисмысловые молекулы предназначены для взаимодействия с целевой молекулой нуклеиновой кислоты посредством канонического или неканонического спаривания оснований. Взаимодействие антисмысловой молекулы и целевой молекулы направлено на стимуляцию разрушения целевой молекулы посредством, например, опосредованной РНКазой-H деградации гибрида РНК-ДНК. В альтернативном варианте антисмысловая молекула предназначена для прерывания функции процессинга, который обычно имеет место в случае целевой молекулы, такого как транскрипция или репликация. Антисмысловые молекулы могут быть сконструированы на основании последовательности целевой молекулы. Существуют многочисленные способы оптимизации эффективности антисмысловых молекул путем идентификации наиболее доступных областей целевой молекулы. Типовые способы включают, но не ограничиваются этим, эксперименты по in vitro селекции и исследования модификации ДНК с применением ДМС и ДЭПК. В общем случае антисмысловые молекулы связывают целевую молекулу с константой диссоциации (k_д), меньшей или равной около 10^-6, меньшей или равной около 10^-8, меньшей или равной около 10^-10 или меньшей или равной около 10^-12. Типовые примеры способов и методик, которые помогают при разработке и применении антисмысловых молекул, можно найти в следующем неограничивающем перечне патентов США: 5135917; 5294533; 5627158; 5641754; 5691317; 5780607; 5786138; 5849903; 5856103; 5919772; 5955590; 5990088; 5994320; 5998602; 6005095; 6007995; 6013522; 6017898; 6018042; 6025198; 6033910; 6040296; 6046004; 6046319; и 6057437. Примеры антисмысловых молекул включают, но не ограничиваются этим, антисмысловые РНК, малые интерферирующие РНК (миРНК) и короткие шпилечные РНК (кшРНК).

Раскрытые в данном документе выделенные молекулы нуклеиновых кислот могут включать РНК, ДНК или как РНК, так и ДНК. Выделенные молекулы нуклеиновых кислот также могут быть связаны или слиты с гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, такой как вектор, или гетерологичной меткой. Например, раскрытые в данном документе выделенные молекулы нуклеиновых кислот могут находиться в векторе или экзогенной донорной последовательности, содержащих выделенную молекулу нуклеиновой кислоты и гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты. Выделенные молекулы нуклеиновых кислот также могут быть связаны или слиты с гетерологичной меткой, такой как флуоресцентная метка. Другие примеры меток раскрыты в другом месте данного документа.

Метка может быть пригодной для прямого обнаружения (например, флуорофор) или непрямого обнаружения (например, гаптен, фермент или гаситель флуорофоров). Такие метки можно обнаруживать спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими или химическими способами. Такие метки включают, например, радиоактивные метки, измерения которых можно проводить с помощью устройств для измерения уровня радиации; пигменты, красители или другие хромогены, которые можно наблюдать визуально или измерять с помощью спектрофотометра; спиновые метки, измерения которых можно проводить с помощью анализатора спиновых меток; и флуоресцентные метки (например, флуорофоры), в случае которых выходной сигнал генерируется за счет возбуждения подходящего молекулярного аддукта и которые можно визуализировать путем возбуждения светом, который поглощается красителем, или можно измерить с помощью стандартных флуорометров или систем визуализации. Метка также может представлять собой, например, хемилюминесцентное вещество, в случае которого выходной сигнал генерируется химической модификацией сигнального соединения; металл-содержащее вещество; или фермент, в случае чего происходит фермент-зависимая вторичная генерация сигнала, такая как образование окрашенного продукта из бесцветного субстрата. Термин «метка» также может называться «тэгом» или гаптеном, которые могут избирательно связываться с конъюгированной молекулой так, чтобы использовать конъюгированную молекулу при последовательном добавлении наряду с субстратом для генерации обнаруживаемого сигнала. Например, в качестве тэга можно использовать биотин, а затем использовать авидиновый или стрептавидиновый конъюгат пероксидазы хрена (HRP) для связывания метки, а затем использовать калориметрический субстрат (например, тетраметилбензидин (ТМБ)) или флуорогенный субстрат для обнаружения присутствия HRP. Типовые метки, которые можно использовать в качестве тэгов для облегчения очистки, включают, но не ограничиваются этим, myc, HA, FLAG или 3XFLAG, 6XHis или полигистидин, глутатион-S-трансферазу (GST), мальтозосвязывающий белок, эпитопный тэг или Fc-часть иммуноглобулина. Многочисленные метки являются известными и включают, например, частицы, флуорофоры, гаптены, ферменты и их калориметрические, флуорогенные и хемилюминесцентные субстраты, а также другие метки.

Раскрытые молекулы нуклеиновых кислот могут содержать, например, нуклеотиды или неприродные или модифицированные нуклеотиды, такие как нуклеотидные аналоги или нуклеотидные заместители. Такие нуклеотиды включают нуклеотид, который содержит модифицированное основание, сахар или фосфатную группу, или в структуру которого входит неприродное соединение. Примеры неприродных нуклеотидов включают, но не ограничиваются этим, дидезоксинуклеотиды, биотинилированные, аминированные, дезаминированные, алкилированные, бензилированные или меченные флуорофором нуклеотиды.

Раскрытые в данном документе молекулы нуклеиновых кислот также могут содержать один или более нуклеотидных аналогов или одну или более замен. Нуклеотидный аналог представляет собой нуклеотид, который содержит модификацию в любом из основного, сахарного или фосфатного фрагментов. Модификации в основном фрагменте включают, но не ограничиваются этим, природные и синтетические модификации A, C, G и T/U, а также разные пуриновые или пиримидиновые основания, такие как, например, псевдоуридин, урацил-5-ил, гипоксантин-9-ил (I) и 2-аминоаденин-9-ил. Модифицированные основания включают, но не ограничиваются этим, 5-метилцитозин.

(5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин,

5-пропинилурацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил),

4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин,

7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Определенные нуклеотидные аналоги, такие как, например, 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, включая, но не ограничиваясь этим, 2-аминопропиладенин,

5-пропинилурацил, 5-пропинилцитозин и 5-метилцитозин могут повышать стабильность образования двойной спирали. Часто модификации основания можно комбинировать, например, с модификацией сахара, такой как 2'-O-метоксиэтил, для обеспечения уникальных свойств, таких как повышенная стабильность двойной спирали.

Нуклеотидные аналоги также могут включать модификации в сахарном фрагменте. Модификации в сахарном фрагменте включают, но не ограничиваются этим, природные модификации рибозы и дезоксирибозы, а также синтетические модификации. Сахарные модификации включают, но не ограничиваются этим, следующие модификации в 2' позиции: OH; F; O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил; или O-алкил-O-алкил, где алкил, алкенил, и алкинил могут представлять собой замещенный или незамещенный C_1-10алкил или C_2-10алкенил и C_2-10алкинил. Типовые 2' сахарные модификации также включают, но не ограничиваются этим, -O[(CH₂)_nO]_mCH₃, -O(CH₂)_nOCH₃, -O(CH₂)_nNH₂, -O(CH₂)_nCH₃, -O(CH₂)_n-ONH₂ и -O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂, где n и m равны от 1 до около 10.

Другие модификации в 2' позиции включают, но не ограничиваются этим, C_1-10алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, O-алкарил или O-аралкил, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, РНК-расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида или группу для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида, и другие заместители, имеющие аналогичные свойства. Аналогичные модификации можно проводить в других позициях в сахаре, в частности, в 3' позиции сахара в 3' концевом нуклеотиде или в 2'-5' связанных олигонуклеотидах и в 5' позиции 5' концевого нуклеотиды. Модифицированные сахара также включают те, которые содержат модификации в соединительном кислороде кольца, например, CH₂ и S. нуклеотидные сахарные аналоги также могут содержать сахарные миметики, такие как соединения циклобутила, на месте пентофуранозильного сахара.

Нуклеотидные аналоги также могут быть модифицированы в фосфатном фрагменте. Модифицированные фосфатные фрагменты включают, но не ограничиваются этим, те, которые можно модифицировать так, чтобы связь между двумя нуклеотидами содержала тиофосфат, хиральный тиофосфат, дитиофосфат, фосфотриэфир, аминоалкилфосфотриэфир, метил- и другие алкильные фосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонат и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты. Эта фосфатная или модифицированная фосфатная связь между двумя нуклеотидами может быть обусловлена 3'-5' связью или 2'-5' связью и может включать инвертированную полярность, такую как от 3'-5' к 5'-3' или от 2'-5' к 5'-2'. Также включены различные формы солей, смешанных солей и свободных кислот.

Нуклеотидные замены включают молекулы, имеющие аналогичные функциональные свойства с нуклеотидами, но которые не содержат фосфатный фрагмент, такие как пептидная нуклеиновая кислота (ПНК). Нуклеотидные заменители включают молекулы, которые распознают нуклеиновые кислоты Уотсон-Криковским или Хугстеновским образом, но которые связаны друг с другом посредством фрагмента, отличного от фосфатного фрагмента. Нуклеотидные заменители способны принимать конформацию структуры типа двойной спирали при взаимодействии с соответствующей целевой нуклеиновой кислотой.

Нуклеотидные заменители также включают нуклеотиды и нуклеотидные аналоги с замещенными фосфатными фрагментами или сахарными фрагментами. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные заменители могут не содержать стандартный атом фосфора. Заменителями фосфата могут быть, например, межнуклеозидные связи на основе короткоцепочечного алкила или циклоалкила, межнуклеозидные связи на основе сложного гетероатома и алкила или циклоалкила или одна или более короткоцепочечных гетероатомных или гетероциклических межнуклеозидных связей. Они включают компоненты, имеющие морфолино-связи (частично образованные из сахарной части нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метилен-формацетильные и тиоформацетильные остовы; алкен-содержащие остовы; сульфаматные остовы; метиленимино- и метиленгидразино-остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие, имеющие смешанные N-, O-, S- и CH₂-составляющие.

Также следует понимать, что в нуклеотидном заменителе как сахарный, так и фосфатный компоненты нуклеотида могут быть замещены, например, связью амидного типа (аминоэтилглицин) (ПНК).

Также возможна связь других типов молекул (конъюгаты) с нуклеотидами или нуклеотидными аналогами для повышения, например, клеточного поглощения. Конъюгаты могут быть химически связаны с нуклеотидами или нуклеотидными аналогами. Такие конъюгаты включают, например, липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент, холевую кислоту, тиоэфир, такой как гексил-S-тритилтиол, тиохолестерин, алифатическую цепь, такую как остатки додекандиола или ундецила, фосфолипид, такой как дигексадецил-рац-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-3-H-фосфонат, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, адамантан-уксусную кислоту, пальмитиловый фрагмент или фрагмент октадециламина или гексиламинокарбонилоксихолестерина.

В данном раскрытии также предложены векторы, содержащие любую одну или более из молекул нуклеиновых кислот, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления векторы содержат одну или более из молекул нуклеиновых кислот, раскрытых в данном документе, и гетерологичную нуклеиновую кислоту. Векторы могут быть вирусными или невирусными векторами, способными переносить молекулу нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой плазмиду или космиду (например, кольцевую двух цепочечную ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК). В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления вектор может автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую он внесен (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). В некоторых вариантах осуществления вектор (например, не-эписомальные векторы млекопитающих) может интегрироваться в геном клетки-хозяина после внесения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Кроме того, конкретные векторы могут управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном документе «рекомбинантными экспрессионными векторами» или «экспрессионными векторами». Такие векторы также могут быть нацеливающими векторами (т. е. экзогенными донорными последовательностями).

В некоторых вариантах осуществления раскрытые в данном документе белки, кодируемые различными генетическими вариантами, экспрессируют посредством вставки молекул нуклеиновых кислот, кодирующих раскрытые генетические варианты, в экспрессионные векторы так, чтобы гены были функционально связаны с последовательностями регуляции экспрессии, такими как последовательности регуляции транскрипции и трансляции. Экспрессионные векторы включают, но не ограничиваются этим, плазмиды, космиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (ААВ), растительные вирусы, такие как вирус мозаики цветной капусты и вирус табачной мозаики, дрожжевые искусственные хромосомы (ДИХ), эписомы вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) и другие экспрессионные векторы, известные в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот, содержащие раскрытые генетические варианты, могут быть лигированы в вектор так, чтобы последовательности регуляции транскрипции и трансляции в векторах выполняли свою предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции генетического варианта. Экспрессионный вектор и последовательности регуляции экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимыми с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Последовательности нуклеиновых кислот, содержащие раскрытые генетические варианты, могут быть вставлены в отдельные векторы или в один экспрессионный вектор в качестве вариантной генетической информации. Последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую раскрытые генетические варианты, можно вставлять в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигирования комплементраных рестрикционных сайтов в нуклеиновой кислоте, содержащей раскрытые генетические варианты, и вектора, или лигирование тупых концов, в случае отсутствия рестрикционных сайтов).

Кроме последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей раскрытые генетические варианты, рекомбинантные экспрессионные векторы могут нести регуляторные последовательности, которые управляют экспрессией генетического варианта в клетке-хозяине. Конструкция экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, необходимый уровень экспрессии белка и т. д. Необходимые регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих могут включать, например, вирусные элементы, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусных ДКП, цитомегаловируса (CMV) (такие как промотор/энхансер CMV), вируса обезьян 40 (SV40) (такие как промотор/энхансер SV40), аденовируса, (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP)), полиомы, и сильные промоторы млекопитающих, такие как промоторы нативного иммуноглобулина и актина. Также хорошо известны способы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или грибных клетках (например, дрожжевых клетках).

Промотор может быть, например, конститутивно активным промотором, кондициональным промотором, индуцибельным промотором, временно-ограниченным промотором (например, регулируемым развитием промотором) или пространственно-ограниченным промотором (например, клеточноспецифическим или тканеспецифическим промотором). Примеры промоторов можно найти, например, в WO 2013/176772.

Примеры индуцибельных промоторов включают, например, химически регулируемые промоторы и физически регулируемые промоторы. Химически регулируемые промоторы включают, например, регулируемые спиртами промоторы (например, промотор гена алкогольдегидрогеназы (alcA)), тетрациклин-регулируемые промоторы (например, тетрациклин-чувствительный промотор, последовательность оператора тетрациклина (tetO), промотор tet-On или промотор tet-Off), регулируемые стероидами промоторы (например, крысиный глюкокортикоидный рецептор, промотор эстрогенового рецептора или промотор экдизонового рецептора) или металл-регулируемые промоторы (например, промотор металлопротеина). Физически регулируемые промоторы включают, например, температурно-регулируемые промоторы (например, промотор теплового шока) и свето-регулируемые промоторы (например, свето-индуцибельный промотор или свето-репрессируемый промотор).

Тканеспецифические промоторы могут представлять собой, например, нейрон-специфические промоторы, глия-специфические промоторы, клеточноспецифические промоторы мышц, клеточноспецифические промоторы сердца, клеточноспецифические промоторы почек, клеточноспецифические промоторы костной ткани, клеточноспецифические промоторы эндотелия или иммунные клеточноспецифические промоторы (например, B-клеточный промотор или T-клеточный промотор).

Регулируемые развитием промоторы включают, например, промоторы, активные только в течение эмбриональной стадии развития или только во взрослой клетке.

Кроме последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей раскрытые генетические варианты и регуляторные последовательности, рекомбинантные экспрессионные векторы могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селективных маркеров. Ген селективного маркера может облегчать отбор клеток-хозяев, в которые был внесен вектор (смотрите, например, патенты США 4399216; 4634665; и 5179017). Например, ген селективного маркера может придавать устойчивость к лекарственным препаратам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был внесен вектор. Типовые гены селективных маркеров включают, но не ограничиваются этим, ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в dhfr-клетках-хозяевах с отбором по метотрексату/амплификацией), ген neo (для отбора по G418) и ген глутаматсинтетазы (GS).

Дополнительные векторы описаны, например, в предварительной заявке США № 62/367973, поданной 28 июля 2016 г., которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

В данном раскрытии также предложены композиции, содержащие любую одну или более из выделенных молекул нуклеиновых кислот, молекул геномной ДНК, молекул кДНК или молекул мРНК, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию.

В данном раскрытии также предложены вариантные полипептиды SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид SIGIRR является усеченным. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид SIGIRR является усеченным в позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид SIGIRR усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержит серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид SIGIRR усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержит некоторое количество аминокислот в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид SIGIRR усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержит следующую аминокислотную последовательность в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. Ser-Arg-Ser-Trp-Ser-Gly-Val-Gly-Ala-Thr-Ser-Ser-Ser-Trp-Thr-Thr-Ala-Thr-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Trp (SEQ ID NO:11). В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид SIGIRR имеет по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид SIGIRR содержит или состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления усеченный белок SIGIRR содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9 или аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9, и содержит серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В данном раскрытии также предложены фрагменты любых из полипептидов, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления фрагменты содержат по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 55, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 65, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 75, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 85, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 95, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 150 или по меньшей мере около 200 смежных аминокислотных остатков кодируемого полипептида (такого как полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9). В этом отношении более длинные фрагменты предпочтительнее более коротких. В некоторых вариантах осуществления фрагменты содержат по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 55, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 65, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 75, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 85, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 95 или по меньшей мере около 100 смежных аминокислотных остатков кодируемого полипептида. В этом отношении более длинные фрагменты предпочтительнее более коротких.

В данном раскрытии также предложены димеры, содержащие выделенный полипептид, содержащий вариантный полипептид SIGIRR, причем полипептид выбран из любых полипептидов, раскрытых в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления раскрытые в данном документе выделенные полипептиды связаны или слиты с гетерологичными полипептидами или гетерологичными молекулами или метками, многочисленные примеры которых раскрыты в другом месте данного документа. Например, белки могут быть слиты с гетерологичным полипептидом, обеспечивающим повышение или снижение стабильности. Слитый домен гетерологичного полипептида может располагаться в N-конце, C-конце или внутри полипептида. Партнер по слиянию может, например, способствовать обеспечению Т-хелперных эпитопов (иммунологический партнер по слиянию) или может способствовать экспрессии белка (энхансер экспрессии) с более высоким выходом, чем в случае нативного рекомбинантного полипептида. Определенные партнеры по слиянию являются как иммунологическими, так и усиливающими экспрессию партнерами по слиянию. Другие партнеры по слиянию могут быть выбраны для повышения растворимости полипептида или для облегчения нацеливания полипептида не необходимые внутриклеточные компартменты. Некоторые партнеры по слиянию включают аффинные тэги, которые облегчают очистку полипептида.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок напрямую слит с гетерологичной молекулой или слит с гетерологичной молекулой посредством линкера, такого как пептидный линкер. Подходящие последовательности пептидных линкеров можно выбирать, например, на основании следующих факторов: 1) способность принимать гибкую удлиненную конформацию; 2) устойчивость к образованию вторичной структуры, которая могла бы взаимодействовать с функциональными эпитопами на первом и втором полипептидах; и 3) отсутствие гидрофобных или заряженных остатков, которые могут вступать в реакцию с функциональными эпитопами полипептида. Например, последовательности пептидных линкеров могут содержать остатки Gly, Asn и Ser. Другие нейтральные аминокислоты, такие как Thr и Ala, также можно использовать в линкерной последовательности. Аминокислотные последовательности, которые можно применять в качестве линкеров, включают, например, раскрытые в, Maratea et al., Gene, 1985, 40, 39-46; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 8258-8262; и патентах США 4935233 и 4751180. Длина линкерной последовательности в общем случае может составлять, например, от 1 до около 50 аминокислот. Линкерные последовательности в общем случае не нужны, когда первый и второй полипептиды имеют области из заменимых N-концевых аминокислот, которые можно использовать для разделения функциональных доменов и предотвращения стерического влияния.

В некоторых вариантах осуществления полипептиды функционально связаны с доменом проникновения в клетки. Например, домен проникновения в клетки может быть получен из белка TAT ВИЧ-1, TLM-мотива проникновения в клетки из вируса гепатита B человека, MPG, Pep-1, VP22, пептида проникновения в клетки из вируса простого герпеса или последовательности пептида полиаргинина. Смотрите, например, WO 2014/089290. Домен проникновения в клетки может располагаться в N-конце, C-конце или в любом месте внутри белка.

В некоторых вариантах осуществления полипептиды функционально связаны с гетерологичным полипептидом для облегчения отслеживания или очистки, таким как флуоресцентный белок, тэг очистки или эпитопный тэг. Примеры флуоресцентных белков включают, но не ограничиваются этим, зеленые флуоресцентные белки (например, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreenl), желтые флуоресцентные белки (например, YFP, eYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellowl), синие флуоресцентные белки (например, eBFP, eBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), голубые флуоресцентные белки (например, eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan), красные флуоресцентные белки (например, mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), оранжевые флуоресцентные белки (например, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) и любой другой подходящий флуоресцентный белок. Примеры тэгов включают, но не ограничиваются этим, глутатион-S-трансферазу (GST), хитин-связывающий белок (CBP), мальтозосвязывающий белок, тиоредоксин (TRX), поли(NANP), тэг тандемной аффинной очистки (TAP), myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, гемагглютинин (HA), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, гистидин (His), белок-носитель биотина и карбоксила (BCCP) и кальмодулин. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная молекула представляет собой Fc-домен иммуноглобулина, пептидный тэг, домен трансдукции, поли(этиленгликоль), полисиаловую кислоту или гликолевую кислоту.

В некоторых вариантах осуществления выделенные полипептиды содержат неприродные или модифицированные аминокислоты или пептидные аналоги. Например, существуют многочисленные D-аминокислоты или аминокислоты, которые имеют отличный функциональный заместитель от аминокислот, встречающихся в природе. Раскрыты противоположные стереоизомеры встречающихся в природе пептидов, а также стереоизомеры пептидных аналогов. Эти аминокислоты легко могут быть включены в полипептидные цепи путем заряжения молекул тРНК выбранной аминокислотой и конструирования генетических конструкций, в которых используются, например, амбер-кодоны, для вставки аналога аминокислоты в пептидную цепь сайт-специфическим образом.

В некоторых вариантах осуществления выделенные полипептиды представляют собой пептидные миметики, которые могут быть созданы так, чтобы напоминать пептиды, но которые не соединены посредством природной пептидной связи. Например, связи для аминокислот и аминокислотных аналогов включают, но не ограничиваются этим, -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-, -CH=CH- (цис и транс), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- и -CHH₂SO-. Пептидные аналоги могут иметь более одного атома между атомами связи, такие как бета-аланин, гамма-аминомасляная кислота и т.п. Аминокислотные аналоги и пептидные аналоги часто имеют усиленные или необходимые свойства, такие как более экономное производство, большая химическая стабильность, усиленные фармакокинетические свойства (время полужизни, всасывание, действие, эффективности и т.д.), измененная специфичность (например, биологическая активность широкого спектра), сниженная антигенность и другие необходимые свойства.

В некоторых вариантах осуществления выделенные полипептиды содержат D-аминокислоты, которые можно использовать для создания более стабильных пептидов, поскольку D-аминокислоты не распознаются пептидазами. Систематическую замену одной или более аминокислот консенсусной последовательности D-аминокислотой того же типа (например, D-лизин вместо L-лизина) можно использовать для создания более стабильных пептидов. Остатки цистеина можно использовать для циклизации или соединения двух или более пептидов вместе. Это может быть целесообразно при ограничении пептидов конкретными конформациями (смотрите, например, Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 1992, 61, 387).

В данном раскрытии также предложены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любые из полипептидов, раскрытых в данном документе. Это включает все вырожденные последовательности, связанные с конкретной полипептидной последовательностью (все нуклеиновые кислоты, имеющие последовательность, которая кодирует одну конкретную полипептидную последовательность, а также нуклеиновые кислоты, включая вырожденные нуклеиновые кислоты, кодирующие раскрытые варианты и производные белковых последовательностей). Таким образом, хотя конкретная последовательность нуклеиновой кислоты может не быть выписана в данном документе, по факту каждая последовательность раскрыта и описана в данном документе посредством раскрытых полипептидных последовательностей.

Процент идентичности (или процент комплементарности) между конкретными участками нуклеотидных последовательностей в нуклеиновых кислотах или аминокислотных последовательностей в полипептидах можно рутинным образом определять, используя программы BLAST (basic local alignment search tools (средство поиска основного локального выравнивания)) и программы PowerBLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656) или используя программу Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.) с настройками по умолчанию, в которой используется алгоритм Смита и Уотермана (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489). В данном документе, если приводится ссылка на процент идентичности последовательностей, более высокие значения процента идентичности последовательностей предпочтительнее более низких.

В данном раскрытии также предложены композиции, содержащие любую одну или более из молекул нуклеиновых кислот и/или любой один или более из полипептидов, раскрытых в данном документе, и носитель и/или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления носитель повышает стабильность молекулы нуклеиновой кислоты и/или полипептида (например, продлевает период в заданных условиях хранения (например, при -20°C, 4°C или температуре окружающей среды), на протяжении которого продукты распада остаются ниже порогового значения, например, ниже 0,5% по массе исходных нуклеиновой кислоты или белка; или повышает стабильность in vivo). Примеры носителей включают, но не ограничиваются этим, микросферы поли(молочной кислоты) (ПМК), микросферы поли(D, L-молочной-ко-гликолевой кислоты) (ПМГК), липосомы, мицеллы, инверсные мицеллы, липидные кохелаты и липидные микротрубочки. Носитель может содержать забуференный солевой раствор, такой как ФСБ, ССРХ и т.д.

В данном раскрытии также предложены способы получения любых полипептидов или их фрагментов, раскрытых в данном документе. Такие полипептиды или их фрагменты можно получать любым подходящим способом. Например, полипептиды или их фрагменты можно получать из клеток-хозяев, содержащих молекулы нуклеиновых кислот (например, рекомбинантные экспрессионные векторы), кодирующие такие полипептиды или их фрагменты. Такие способы могут включать культивирование клетки-хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты (например, рекомбинантный экспрессионный вектор), кодирующую полипептид или его фрагмент, в условиях, достаточных для получения полипептида или его фрагмента, получая, таким образом, полипептид или его фрагмент. Нуклеиновая кислота может быть функционально связана с промотором, активным в клетке-хозяине, и культивирование можно проводить в условиях, в которых происходит экспрессия нуклеиновой кислоты. Такие способы могут дополнительно включать выделение экспрессируемого полипептида или его фрагмента. Выделение может дополнительно включать очистку полипептида или его фрагмента.

Примеры подходящих систем для белковой экспрессии включают клетки-хозяев, такие как, например, экспрессионные системы на основе бактериальных клеток (например, Escherichia coli, Lactococcus lactis), экспрессионные системы на основе дрожжевых клеток (например, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris), экспрессионные системы на основе клеток насекомых (например, для опосредованной бакуловирусом белковой экспрессии) и экспрессионные системы на основе клеток млекопитающих.

Примеры молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды или их фрагменты, более подробно раскрыты в другом месте данного документа. В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот являются кодон-оптимизированными для экспрессии в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот функционально связаны с промотором, активным в клетке-хозяине. Промотор может быть гетерологичным промотором (например, промотором, который не является встречающимся в природе промотором). Примеры промоторов, подходящих для Escherichia coli, включают, но не ограничиваются этим, промоторы арабинозы, lac, tac, и T7. Примеры промоторов, подходящих для Lactococcus lactis, включают, но не ограничиваются этим, промоторы P170 и низина. Примеры промоторов, подходящих для Saccharomyces cerevisiae, включают, но не ограничиваются этим, конститутивные промоторы, такие как промоторы алкогольдегидрогеназы (ADHI) или энолазы (ENO), или индуцибельные промоторы, такие как PHO, CUP1, GAL1 и G10. Примеры промоторов, подходящих для Pichia pastoris, включают, но не ограничиваются этим, промотор алкогольоксидаза I (AOX I), промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAP) и промотор глютатионзависимой формальдегиддегидрогеназы (FLDI). Примером промотора, подходящего для опосредованной бакуловирусом системы, является поздний вирусный сильный промотор полиэдрина.

В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот кодируют тэг в рамке с полипептидом или его фрагментом для облегчения очистки белка. Примеры тэгов раскрыты в другом месте данного документа. Такие тэги могут, например, связываться с лигандом-партнером (например, иммобилизованным на смоле) так, чтобы снабженный тэгом белок можно было отделять от всех других белков (например, белков клетки-хозяина). Аффинная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и эксклюзионная хроматография (ЭХ) являются примерами методов, которые можно использовать для улучшения чистоты экспрессируемого белка.

Также можно использовать другие способы для получения полипептидов или их фрагментов. Например, два или более пептидов или полипептидов можно связывать вместе с помощью методов белковой химии. Например, пептиды или полипептиды можно химически синтезировать, используя химию Fmoc (9-фторенилметилоксикарбонил) или Boc (трет-бутилоксикарбонил). Такие пептиды или полипептиды можно синтезировать с помощью стандартных химических реакций. Например, пептид или полипептид можно синтезировать и не отделять от смолы для синтеза, тогда как другой фрагмент пептида или белка можно синтезировать и впоследствии отделить от смолы, оголяя, таким образом, концевую группу, которая функционально заблокирована на другом фрагменте. С помощью реакций пептидной конденсации эти два фрагмента можно ковалентно соединить пептидной связью в карбоксильном и амино-конце соответственно. В альтернативном варианте пептид или полипептид можно независимо синтезировать in vivo, как описано в данном документе. После выделения эти независимые пептиды или полипептиды можно связывать для образования пептида или его фрагмента посредством аналогичных реакций пептидной конденсации.

В некоторых вариантах осуществления ферментативное лигирование клонированных или синтетических пептидных сегментов обеспечивает возможность соединения относительно коротких пептидных фрагментов для получения больших пептидных фрагментов, полипептидов или целых белковых доменов (Abrahmsen et al., Biochemistry, 1991, 30, 4151). В альтернативном варианте можно использовать нативное химическое лигирование синтетических пептидов, чтобы синтетически конструировать крупные пептиды или полипептиды из более коротких пептидных фрагментов. Этот способ может состоять из двухэтапной химической реакции (Dawson et al., Science, 1994, 266, 776-779). Первый этап может представлять собой хемоселективную реакцию незащищенного синтетического пептида-тиоэфира с другим незащищенным пептидным сегментом, содержащим амино-концевой остаток Cys, для получения тиоэфир-связанного промежуточного продукта в качестве исходного ковалентного продукта. Без изменения реакционных условий этот промежуточный продукт может подвергаться спонтанной быстрой внутримолекулярной реакции с образованием нативной пептидной связи в сайте лигирования.

В некоторых вариантах осуществления незащищенные пептидные сегменты могут быть химически связаны, при этом связь, образуемая между пептидными сегментами в результате химического лигирования, является неприродной (непептидной) связью (Schnolzer et al., Science, 1992, 256, 221).

В некоторых вариантах осуществления полипептиды могут иметь постэкспрессионные модификации, такие как, например, гликозилирование, ацетилирование и фосфорилирование, а также другие модификации, известные в данной области техники, как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе. Полипептид может представлять собой целый белок или его подпоследовательность.

В данном раскрытии также предложены способы получения любых раскрытых в данном документе полипептидов, включающие культивирование клетки-хозяина, содержащей рекомбинантные экспрессионные векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, содержащие полинуклеотид, способный кодировать один или более раскрытых в данном документе полипептидов, или его комплементарную цепь, получая, таким образом, полипептид.

В данном раскрытии также предложены клетки (например, рекомбинантные клетки-хозяева), содержащие любую одну или более молекул нуклеиновых кислот, включая векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, и/или любой один или более полипептидов, раскрытых в данном документе. Клетки могут быть in vitro, ex vivo или in vivo. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть связаны с промотором и другими регуляторными последовательностями так, чтобы происходила их экспрессия с выработкой кодируемого белка. дополнительно предложены линии таких клеток.

В некоторых вариантах осуществления клетка является тотипотентной клеткой или плюрипотентной клеткой (например, эмбриональной стволовой (ЭС) клеткой, такой как ЭС клетка грызуна, ЭС клетка мыши или ЭС клетка крысы). Тотипотентные клетки включают недифференцированные клетки, из которых можно получить любой тип клеток, а плюрипотентные клетки включают недифференцированные клетки, которые обладают способностью развиваться в более чем один тип дифференцированных клеток. Такие плюрипотентные и/или тотипотентные клетки могут представлять собой, например, ЭС клетки или ЭС-подобные клетки, такие как индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки. ЭС клетки включают эмбриональные тотипотентные или плюрипотентные клетки, которые способны обеспечивать вклад в любую ткань развивающегося эмбриона после внесения в эмбрион. ЭС клетки могут быть получены из внутренней клеточной массы бластоцисты и способны дифференцироваться в клетки любого из трех зародышевых листков позвоночных (эндодерма, эктодерма и мезодерма). В соответствии с данным раскрытием, эмбриональные стволовые клетки могут быть не человеческими эмбриональными стволовыми клетками.

В некоторых вариантах осуществления клетка является первичной соматической клеткой или же клеткой, которая не является первичной соматической клеткой. Соматические клетки могут включать любую клетку, которая не является гаметой, зародышевой клеткой, гаметоцитом или недифференцированной стволовой клеткой. В некоторых вариантах осуществления клетка также может быть первичной клеткой. Первичные клетки включают клетки или культуры клеток, которые были непосредственно выделены из организма, органа или ткани. Первичные клетки включают клетки, которые не являются ни трансформированными, ни иммортализованными. Первичные клетки включают любую клетку, полученную из организма, органа или ткани, которую ранее не пассировали в тканевой культуре или которую ранее пассировали в тканевой культуре, но которую невозможно бесконечно пассировать в тканевой культуре. Такие клетки могут быть выделены традиционными способами и включают, например, соматические клетки, гемопоэтические клетки, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки, фибробласты, мезенхимальные клетки, кератиноциты, меланоциты, моноциты, мононуклеарные клетки, адипоциты, преадипоциты, нейроны, глиальные клетки, гепатоциты, скелетные миобласты и гладкомышечные клетки. Например, первичные клетки могут быть получены из соединительных тканей, мышечных тканей, тканей нервной системы или эпителиальных тканей.

В некоторых вариантах осуществления клетки обычно не могут бесконечно пролиферировать, но вследствие мутации или изменения избежали нормального клеточного старения и вместо этого продолжают делиться. Такие мутации или изменения могут возникать природным образом или быть индуцированными намеренно. Примеры иммортализованных клеток включают, но не ограничиваются этим, клетки яичника китайского хомяка (CHO), человеческие эмбриональные клетки почек (например, клетки HEK 293) и мышиные эмбриональные фибробласты (например, клетки 3T3). Многочисленные типы иммортализованных клеток хорошо известны. Иммортализованные или первичные клетки включают клетки, которые обычно используют для культивирования или для экспрессии рекомбинантных генов или белков. В некоторых вариантах осуществления клетка является дифференцированной клеткой, такой как клетка печени (например, клетка печени человека).

Клетка может быть получена из любого источника. Например, клетка может быть эукариотической клеткой, клеткой животного, клеткой растения или клеткой гриба (например, дрожжей). Такие клетки могут представлять собой клетки рыб или клетки птиц, или же такие клетки могут представлять собой клетки млекопитающих, такие как клетки человека, клетки отличных от человека млекопитающих, клетки грызунов, клетки мышей или клетки крыс. Млекопитающие включают, но не ограничиваются этим, человека, отличных от человека приматов, мартышек, обезьян, кошек, собак, лошадей, быков, оленей, бизонов, овец, грызунов (например, мышей, крыс, хомяков, морских свинок), сельскохозяйственных животных (например, виды бычьих, такие как коровы, быки и т. д.; виды овечьих, такие как овцы, козы и т.д.; и виды свиных, такие как свиньи и боровы). Птицы включают, но не ограничиваются этим, кур, индеек, страусов, гусей, уток и т.д. Также включены домашние и сельскохозяйственные животные. Термин «отличное от человека животное» исключает человека.

Дополнительные клетки-хозяева описаны, например, в публикации заявки на патент США № US2018/0030114, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

Раскрытые в данном документе молекулы нуклеиновых кислот и полипептиды можно вносить в клетку любыми способами. Протоколы трансфекции, а также протоколы внесения нуклеиновых кислот или белков могут варьироваться. Неограничивающие методы трансфекции включают химические методы трансфекции с применением липосом, наночастиц, кальция, дендримеров и катионных полимеров, таких как ДЭАЭ-декстран или полиэтиленимин. Нехимические методы включают электропорацию, сонопорацию и оптическую трансфекцию. Трансфекция на основе применения частиц включает применение генной пушки или магнитную трансфекцию. Также для трансфекции можно использовать вирусные методы.

Внесение нуклеиновых кислот или белков в клетку также может быть опосредовано электропорацией, внутрицитоплазматическим введением, вирусной инфекцией, аденовирусом, аденоассоциированным вирусом, лентивирусом, ретровирусом, трансфекцией, липид-опосредованной трансфекцией или нуклеофекцией. Нуклеофекция представляет собой усовершенствованный метод электропорации, который позволяет обеспечивать доставку субстратов нуклеиновых кислот не только в цитоплазму, но также через ядерную мембрану и в ядро. Кроме того, применение нуклеофекции в раскрытых в данном документе способах, как правило, требует меньше клеток, чем обычная электропорация (например, только около 2 миллионов по сравнению с 7 миллионами при обычной электропорации). В некоторых вариантах осуществления нуклеофекцию проводят, используя систему LONZA^® NUCLEOFECTOR™.

Внесение нуклеиновых кислот или белков в клетку также можно осуществлять посредством микроинъекции. Микроинъекцию мРНК обычно проводят в цитоплазму (например, для доставки мРНК непосредственно к аппарату трансляции), тогда как микроинъекцию белка или ДНК обычно проводят в ядро. В альтернативном варианте микроинъекцию можно проводить посредством инъекции как в ядро, так и в цитоплазму: сначала иглу можно ввести в ядро и инъецировать первое количество, а при удалении иглы из клетки ввести второе количество в цитоплазму. Если в цитоплазму вводят белок нуклеазного агента, белок может содержать сигнал ядерной локализации, чтобы обеспечить доставку в ядро/пронуклеус.

Другие способы внесения нуклеиновых кислот или белков в клетку могут включать, например, векторную доставку, опосредованную частицами доставку, опосредованную экзосомами доставку, опосредованную липидными наночастицами доставку, опосредованную проникающим в клетки пептидом доставку или опосредованную имплантируемым устройством доставку. Способы введение нуклеиновых кислот или белков субъекту для модификации клеток in vivo раскрыты в другом месте данного документа. Внесение нуклеиновых кислот и белков в клетки также можно осуществлять посредством гидродинамической доставки (ГДД).

Другие способы внесения нуклеиновых кислот или белков в клетку могут включать, например, векторную доставку, опосредованную частицами доставку, опосредованную экзосомами доставку, опосредованную липидными наночастицами доставку, опосредованную проникающим в клетки пептидом доставку или опосредованную имплантируемым устройством доставку. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту или белок можно вносить в клетку в носителе, таком как микросфера на основе поли(молочной кислоты) (ПМА), микросфера на основе поли(D, L-молочной-ко-гликолевой кислоты) (ПМГА), липосома, мицелла, инверсная мицелла, липидный кохелат или липидная микротрубочка.

В данном раскрытии также предложены зонды и праймеры. Примеры зондов и праймеров раскрыты, например, выше. В данном раскрытии предложены зонды и праймеры, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизируется с любой из раскрытых в данном документе молекул нуклеиновых кислот. Например, зонд или праймер может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с любой из описанных в данном документе молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют вариантный белок SIGIRR, который усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, или которая гибридизируется с комплементарной цепью молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный белок SIGIRR в соответствии с SEQ ID NO:9, или которая гибридизируется с комплементарной цепью этой молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный полипептид SIGIRR, который усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержит серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, или которая гибридизируется с комплементарной цепью этой молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный полипептид SIGIRR, который усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержит некоторое количество аминокислот в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9, или которая гибридизируется с комплементарной цепью этой молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный полипептид SIGIRR, который усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержит следующую аминокислотную последовательность в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9: Ser-Arg-Ser-Trp-Ser-Gly-Val-Gly-Ala-Thr-Ser-Ser-Ser-Trp-Thr-Thr-Ala-Thr-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Trp (SEQ ID NO:11), или которая гибридизируется с комплементарной цепью этой молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный полипептид SIGIRR, который имеет по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO:9, или которая гибридизируется с комплементарной цепью этой молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный полипептид SIGIRR, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO:9, или которая гибридизируется с комплементарной цепью этой молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер специфически гибридизируется с частью молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей кодон, который кодирует серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

Зонд или праймер может иметь любую подходящую длину, неограничивающие примеры которой включают по меньшей мере около 5, по меньшей мере около 8, по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 11, по меньшей мере около 12, по меньшей мере около 13, по меньшей мере около 14, по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 16, по меньшей мере около 17, по меньшей мере около 18, по меньшей мере около 19, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 21, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 23, по меньшей мере около 24 или по меньшей мере около 25 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления зонд или праймер имеет длину по меньшей мере около 18 нуклеотидов. Зонд или праймер может иметь длину, составляющую от около 10 до около 35, от около 10 до около 30, от около 10 до около 25, от около 12 до около 30, от около 12 до около 28, от около 12 до около 24, от около 15 до около 30, от около 15 до около 25, от около 18 до около 30, от около 18 до около 25, от около 18 до около 24 или от около 18 до около 22 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления зонд или праймер имеет длину, составляющую от около 18 до около 30 нуклеотидов.

В данном раскрытии также предложены специфические в отношении изменения зонды и специфические в отношении изменения праймеры. Специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный белок SIGIRR, который усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, или с ее комплементарной цепью. В контексте данного раскрытия «специфически гибридизируется» означает, что зонд или праймер (например, специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер) не гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR дикого типа. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд специфически гибридизируется с кодоном нуклеиновой кислоты, который кодирует серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, или его комплементарной цепью. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения праймер или пара праймеров специфически гибридизируются с областью(ями) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный белок SIGIRR, так, что кодон, который кодирует серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, оказывается включенным в любой транскрипт, получаемый из него. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер специфически гибридизируется с частью молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей кодон, который кодирует серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой геномной ДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, или с ее комплементарной цепью. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой геномной ДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой геномной ДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий следующую аминокислотную последовательность в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. Ser-Arg-Ser-Trp-Ser-Gly-Val-Gly-Ala-Thr-Ser-Ser-Ser-Trp-Thr-Thr-Ala-Thr-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Trp (SEQ ID NO:11). В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой геномной ДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, имеющий по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой геномной ДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, имеющий SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер специфически гибридизируется с частью геномной ДНК, содержащей кодон, который кодирует серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой мРНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой мРНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой мРНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий следующую аминокислотную последовательность в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. Ser-Arg-Ser-Trp-Ser-Gly-Val-Gly-Ala-Thr-Ser-Ser-Ser-Trp-Thr-Thr-Ala-Thr-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Trp (SEQ ID NO:11). В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой мРНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, имеющий по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой мРНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, имеющий SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер специфически гибридизируется с частью молекулы мРНК, содержащей кодон, который кодирует серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой мРНК, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей гуанин в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой мРНК, которая содержит кодоны CUA и AGC в позициях, соответствующих позициям 553-555 и 556-558, соответственно, в соответствии с SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой мРНК, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой мРНК, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO:4.

В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой кДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой кДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой кДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий следующую аминокислотную последовательность в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. Ser-Arg-Ser-Trp-Ser-Gly-Val-Gly-Ala-Thr-Ser-Ser-Ser-Trp-Thr-Thr-Ala-Thr-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Trp (SEQ ID NO:11). В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой кДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, имеющий по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой кДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, имеющий SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер специфически гибридизируется с частью молекулы кДНК, содержащей кодон, который кодирует серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой кДНК, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей гуанин в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой кДНК, которая содержит кодоны CUA и AGC в позициях, соответствующих позициям 553-555 и 556-558, соответственно, в соответствии с SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой кДНК, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной и/или гибридизируется, или специфически гибридизируется с молекулой кДНК, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO:6.

Длина, описанная выше в связи с зондом или праймером согласно раскрытию, применима с соответствующими изменениями также для специфического в отношении изменения зонда или специфического в отношении изменения праймера согласно раскрытию.

В данном раскрытии также предложена пара специфических в отношении изменения праймеров, содержащая два из специфических в отношении изменения праймеров, описанных выше.

В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер (например, специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер) содержит ДНК. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер (например, специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер) содержит РНК. В некоторых вариантах осуществления зонд или праймер (например, специфический в отношении изменения зонд или специфический в отношении изменения праймер) гибридизируется с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный белок SIGIRR, в жестких условиях, таких как условия высокой жесткости.

В некоторых вариантах осуществления зонд содержит метку. В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой флуоресцентную метку, радиоактивную метку или биотин. В некоторых вариантах осуществления длина зонда описана выше. В альтернативном варианте, в некоторых вариантах осуществления, зонд содержит или состоит из по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 55, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 65, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 75, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 85, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 95 или по меньшей мере около 100 нуклеотидов. Зонд (например, аллель-специфический зонд) можно использовать, например, для обнаружения любой из раскрытых в данном документе молекул нуклеиновых кислот. В предпочтительных вариантах осуществления зонд имеет длину по меньшей мере около 18 нуклеотидов. Зонд может иметь длину, составляющую от около 10 до около 35, от около 10 до около 30, от около 10 до около 25, от около 12 до около 30, от около 12 до около 28, от около 12 до около 24, от около 15 до около 30, от около 15 до около 25, от около 18 до около 30, от около 18 до около 25, от около 18 до около 24 или от около 18 до около 22 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления зонд имеет длину, составляющую от около 18 до около 30 нуклеотидов.

В данном раскрытии также предложены подложки, содержащие субстрат, к которому присоединен любой один или более из раскрытых в данном документе зондов. Твердые подложки представляют собой твердофазные субстраты или подложки, с которыми могут связываться молекулы, такие как любые раскрытые в данном документе зонды. Формой твердой подложки является матрица. Другой формой твердой подложки является матричный детектор. Матричный детектор представляет собой твердую подложку, с которой было сопряжено некоторое количество разных зондов в виде матрицы, решетки или в другом упорядочении.

Твердофазные субстраты для применения в твердых подложках могут включать любой твердый материал, с которым могут быть сопряжены молекулы. Это подразумевает такие материалы, как акриламид, агароза, целлюлоза, нитроцеллюлоза, стекло, полистирол, полиэтиленвинилацетат, полипропилен, полиметакрилат, полиэтилен, полиэтиленоксид, полисиликаты, поликарбонаты, тефлон, фторуглероды, нейлон, силиконовый каучук, полиангидриды, полигликолевая кислота, полимолочная кислота, сложные полиортоэфиры, полипропилфумарат, коллаген, гликозаминогликаны и полиаминокислоты. Твердофазные субстраты могут иметь любую удобную форму, включая тонкую пленку, мембрану, бутылки, планшеты, волокна, шерстяные волокна, формованные полимеры, частицы, гранулы, микрочастицы или их комбинацию. Твердофазные субстраты и твердые подложки могут быть пористыми и непористыми. Одной из форм твердофазного субстрата является микротитровальный планшет, например, стандартного 96-луночного типа. В некоторых вариантах осуществления можно использовать многолуночный стеклянный слайд, который обычно содержит одну матрицу на лунку. Это позволяет осуществлять лучший контроль воспроизводимости анализа, повышать производительность и обработку образца, и облегчает автоматизацию. В некоторых вариантах осуществления подложка представляет собой микромассив.

Любые из раскрытых в данном документе полипептидов могут дополнительно содержать одну или более замен (таких как консервативные аминокислотные замены), вставок или делеций. Вставки включают, например, амино- или карбокси-концевые слияния, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Способы создания замен в предопределенных сайтах в ДНК, имеющей известную последовательность, хорошо известны, например, это мутагенез с праймером M13 и ПЦР-мутагенез. Аминокислотные замены, как правило, проводят в одном остатке, но могут проводиться сразу в некотором числе разных локаций; вставки, как правило, имеют порядок от 1 до 10 аминокислотных остатков; а делеции находятся в диапазоне от 1 до 30 остатков. Делеции или вставки можно осуществлять в смежных парах, т.е. делецию 2 остатков или вставку 2 остатков. Замены, делеции, вставки или любую их комбинацию можно комбинировать для получения конечной конструкции. В некоторых вариантах осуществления мутации не вытесняют последовательность за рамку считывания и не создают комплементарные области, которые могут приводить к образованию вторичной структуры мРНК.

В данном раскрытии также предложены наборы для создания композиций и применения способов, описанных в данном документе. Описанные в данном документе наборы могут содержать компоненты для проведения анализа или анализов для обнаружения одного или более генетических вариантов в образце субъекта.

В некоторых вариантах осуществления в наборах для идентификации вариантов SIGIRR используются композиции и способы, описанные выше. В некоторых вариантах осуществления базовый набор может содержать контейнер, содержащий по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров или зондов, таких как специфические в отношении изменения зонды или специфические в отношении изменения праймеры, для локуса в любой из раскрытых в данном документе молекул нуклеиновых кислот (таких как, например, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:6). Набор может, необязательно, содержать инструкции по применению. Набор также может содержать другие необязательные компоненты набора, такие как, например, один или более аллельных лэддеров, направленных на каждый из амплифицируемых локусов, достаточное количество фермента для амплификации, буфер для амплификации для облегчения амплификации, раствор двухвалентного катиона для улучшения активности фермента, дНТФ для удлинения цепей во время амплификации, загрузочный раствор для подготовки амплифицированного материала для электрофореза, геномную ДНК в качестве матричного контроля, размерный маркер для гарантии, что материалы перемещаются как положено в среде для разделения, и протокол и руководство для обучения пользователя и ограничения числа ошибок при применении. Количества различных реагентов в наборах также можно варьировать в зависимости от ряда факторов, таких как оптимальная чувствительность способа. В объем этих принципов входит предоставление тестовых наборов для использования в ручных применениях или тестовых наборов для использования с автоматическими устройствами для приготовления образцов, установками для проведения реакций, детекторами и анализаторами.

В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы геномной ДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, или ее комплементарной цепи. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы геномной ДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы геномной ДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий следующую аминокислотную позицию в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. Ser-Arg-Ser-Trp-Ser-Gly-Val-Gly-Ala-Thr-Ser-Ser-Ser-Trp-Thr-Thr-Ala-Thr-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Trp (SEQ ID NO:11). В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы геномной ДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, имеющий по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы геномной ДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, имеющий SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы мРНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы мРНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы мРНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий следующую аминокислотную позицию в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. Ser-Arg-Ser-Trp-Ser-Gly-Val-Gly-Ala-Thr-Ser-Ser-Ser-Trp-Thr-Thr-Ala-Thr-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Trp (SEQ ID NO:11). В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы мРНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, имеющий по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы мРНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, имеющий SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы мРНК, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей гуанин в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы мРНК, которая содержит кодоны CUA и AGC в позициях, соответствующих позициям 553-555 и 556-558, соответственно, в соответствии с SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы мРНК, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы мРНК, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO:4.

В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы кДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы кДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы кДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий следующую аминокислотную позицию в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. Ser-Arg-Ser-Trp-Ser-Gly-Val-Gly-Ala-Thr-Ser-Ser-Ser-Trp-Thr-Thr-Ala-Thr-Ser-Cys-Arg-Ala-Leu-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Trp (SEQ ID NO:11). В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы кДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, имеющий по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы кДНК, кодирующей вариантный белок SIGIRR, имеющий SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы кДНК, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей гуанин в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы кДНК, которая содержит кодоны CTA и AGC в позициях, соответствующих позициям 553-555 и 556-558, соответственно, в соответствии с SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы кДНК, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат по меньшей мере одну пару олигонуклеотидных праймеров (например, специфических в отношении изменения праймеров) для амплификации или по меньшей мере один меченный олигонуклеотидный зонд (например, специфический в отношении изменения зонд) для обнаружения молекулы кДНК, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO:6.

В некоторых вариантах осуществления любые из раскрытых в данном документе наборов могут дополнительно содержать любое одно или более из: нуклеотидного лэддера, протокола, фермента (такого как фермент, используемый для амплификации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР)), дНТФ, буфера, соли или солей и контрольного образца нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления любые из раскрытых в данном документе наборов могут дополнительно содержать любое одно или более из: пригодной для обнаружения метки, продуктов и реагентов, необходимых для проведения реакции отжига, и инструкций.

В некоторых вариантах осуществления раскрытые в данном документе наборы могут содержать праймер или зонд, или специфический в отношении изменения праймер или специфический в отношении изменения зонд, содержащий 3' концевой нуклеотид, который гибридизируется непосредственно с гуанином в позиции, соответствующей позиции 9962 в SEQ ID NO:2, или в позиции, соответствующей позиции 557 в SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:6.

Специалистам в данной области техники понятно, что применяемые методики обнаружения в общем случае не являются ограничивающими. Точнее, в объем раскрытых способов и наборов входит широкий ряд средств обнаружения при условии, что они позволяют определять наличие или отсутствие ампликона.

В некоторых аспектах наборы могут содержать один или более праймеров или зондов, раскрытых в данном документе. Например, набор может содержать один или более зондов, которые гибридизируются с одним или более из раскрытых генетических вариантов.

В некоторых аспектах набор может содержать одну из раскрытых клеток или клеточных линий. В некоторых аспектах набор может содержать материалы, необходимые для создания трансгенной клетки или клеточной линии. Например, в некоторых аспектах набор может содержать клетку и вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую один или более из раскрытых генетических вариантов. Набор может дополнительно содержать среду для клеточной культуры.

В данном раскрытии также предложены способы обнаружения наличия геномной ДНК, мРНК, кДНК и/или полипептида вариантного SIGIRR в биологическом образце от субъекта-человека. Следует понимать, что генные последовательности в популяции, а также мРНК и белки, кодируемые такими генами, могут варьироваться вследствие полиморфизма, такого как однонуклеотидный полиморфизм. Последовательности, приведенные в данном документе для геномной ДНК, мРНК, кДНК и полипептида SIGIRR, являются всего лишь типовыми последовательностями. Также возможны другие последовательности геномной ДНК, мРНК, кДНК и полипептида SIGIRR.

Биологический образец может быть получен из любой клетки, ткани или биологической жидкости от субъекта. Образец может содержать любую клинически релевантную ткань, такую как образец костного мозга, биопсия опухоли, тонкоигольный аспират, или образец жидкости организма, такой как кровь, зубодесневая жидкость, плазма, сыворотка, лимфа, асцитная жидкость, кистозная жидкость или моча. В некоторых случаях образец содержит ротовой мазок. Образец, используемый в раскрытых в данном документе способах, будет варьироваться в зависимости от формата анализа, природы способа обнаружения, а также тканей, клеток или экстрактов, которые используются как образец. Биологический образец можно по-разному обрабатывать в зависимости от применяемого анализа. Например, при обнаружении молекулы нуклеиновой кислоты вариантного SIGIRR можно использовать предварительную обработку, предназначенную для выделения или обогащения образца в отношении геномной ДНК. В этих целях можно использовать ряд известных техник. При обнаружении уровня мРНК вариантного SIGIRR можно использовать разные техники для обогащения биологического образца мРНК. Можно использовать различные способы для обнаружения наличия или уровня мРНК или наличия конкретного вариантного локуса геномной ДНК.

В некоторых вариантах осуществления в данном раскрытии предложены способы обнаружения наличия или отсутствия вариантного белка SIGIRR, включающие секвенирование по меньшей мере части белка в биологическом образце для определения, содержит ли белок аминокислотную последовательность, кодирующую усеченный белок SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления в данном раскрытии предложены способы обнаружения наличия или отсутствия вариантного белка SIGIRR, включающие секвенирование по меньшей мере части белка в биологическом образце для определения, содержит ли белок аминокислотную последовательность, кодирующую белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления в данном раскрытии предложены способы обнаружения наличия или отсутствия вариантного белка SIGIRR, включающие секвенирование по меньшей мере части белка в биологическом образце для определения, содержит ли белок аминокислотную последовательность, кодирующую белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления в данном раскрытии предложены способы обнаружения наличия или отсутствия молекулы нуклеиновой кислоты вариантного SIGIRR, включающие секвенирование по меньшей мере части нуклеиновой кислоты в биологическом образце для определения, содержит ли нуклеиновая кислота последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую усеченный белок SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления в данном раскрытии предложены способы обнаружения наличия или отсутствия молекулы нуклеиновой кислоты вариантного SIGIRR, включающие секвенирование по меньшей мере части нуклеиновой кислоты в биологическом образце для определения, содержит ли нуклеиновая кислота последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления в данном раскрытии предложены способы обнаружения наличия или отсутствия молекулы нуклеиновой кислоты вариантного SIGIRR, включающие секвенирование по меньшей мере части нуклеиновой кислоты в биологическом образце для определения, содержит ли нуклеиновая кислота последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. Любую их раскрытых в данном документе вариантных молекул нуклеиновых кислот можно обнаруживать, используя любые из описанных в данном документе зондов и праймеров.

В некоторых вариантах осуществления способы обнаружения наличия или отсутствия связанной с воспалительных заболеванием кишечника молекулы нуклеиновой кислоты вариантного SIGIRR или связанной с воспалительных заболеванием кишечника с началом в раннем возрасте молекулы нуклеиновой кислоты вариантного SIGIRR (например, геномной ДНК, мРНК или кДНК) у субъекта, включающие: проведение анализа биологического образца, полученного от субъекта, который позволяет определить, содержит ли молекула нуклеиновой кислоты в биологическом образце любые из раскрытых в данном документе последовательностей нуклеиновых кислот вариантного SIGIRR (например, молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует усеченный белок SIGIRR, молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии SEQ ID NO:9). В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит клетку или клеточный лизат. Такие способы могут дополнительно включать, например, получение биологического образца от субъекта, содержащего геномную ДНК или мРНК SIGIRR, и, в случае мРНК, необязательно, обратное транскрибирование мРНК в кДНК, и проведение анализа биологического образца, который позволяет определить, кодирует ли позиция геномной ДНК, мРНК или кДНК SIGIRR усеченный белок SIGIRR. Такие способы могут дополнительно включать, например, получение биологического образца от субъекта, содержащего геномную ДНК или мРНК SIGIRR, и, в случае мРНК, необязательно, обратное транскрибирование мРНК в кДНК, и проведение анализа биологического образца, который позволяет определить, кодирует ли позиция геномной ДНК, мРНК или кДНК SIGIRR белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии SEQ ID NO:9, проведение анализа биологического образца, который позволяет определить, кодирует ли позиция геномной ДНК, мРНК или кДНК SIGIRR белок SIGIRR, усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии SEQ ID NO:9 и содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии SEQ ID NO:9. Такие методы анализа могут включать, например, определение идентичности этих позиций конкретной молекулы нуклеиновой кислоты SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.

В некоторых вариантах осуществления анализ включает: секвенирование по меньшей мере части последовательности геномной ДНК SIGIRR молекулы нуклеиновой кислоты в биологическом образце от субъекта, причем секвенируемая часть включает позицию, соответствующую позиции, кодирующей серин в позиции 186 в белке SIGIRR в соответствии с SEQ ID NO:9; секвенирование по меньшей мере части последовательности мРНК SIGIRR молекулы нуклеиновой кислоты в биологическом образце от субъекта, причем секвенируемая часть включает позицию, соответствующую позиции, кодирующей серин в позиции 186 в белке SIGIRR в соответствии с SEQ ID NO:9; или секвенирование по меньшей мере части последовательности кДНК SIGIRR молекулы нуклеиновой кислоты в биологическом образце от субъекта, причем секвенируемая часть включает позицию, соответствующую позиции, кодирующей серин в позиции 186 в белке SIGIRR в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления анализ включает: a) приведение биологического образца в контакт с праймером, гибридизирующимся с: i) частью последовательности геномной ДНК SIGIRR, которая находится вблизи позиции геномной последовательности SIGIRR в позиции, соответствующей позиции, кодирующей серин в позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; ii) частью последовательности мРНК SIGIRR, которая находится вблизи позиции последовательности мРНК SIGIRR в позиции, соответствующей позиции, кодирующей серин в позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; или iii) частью последовательности кДНК SIGIRR, которая находится вблизи позиции последовательности кДНК SIGIRR в позиции, соответствующей позиции, кодирующей серин в позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; b) удлинение праймера по меньшей мере через: i) позицию последовательности геномной ДНК SIGIRR, соответствующую нуклеотидным позициям за пределами кодона, кодирующего серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; ii) позицию последовательности мРНК SIGIRR, соответствующую нуклеотидным позициям за пределами кодона, кодирующего серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; или iii) позицию последовательности кДНК SIGIRR, соответствующую нуклеотидным позициям за пределами кодона, кодирующего серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; и c) определение, содержит ли продукт удлинения праймера нуклеотиды, кодирующие серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления проводят анализ только геномной ДНК SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления проводят анализ только мРНК SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления проводят анализ только кДНК SIGIRR, полученной из мРНК SIGIRR.

В некоторых вариантах осуществления анализ включает: a) приведение биологического образца в контакт со специфическим в отношении изменения праймером, гибридизирующимся с i) частью последовательности геномной ДНК SIGIRR, содержащей нуклеотиды, кодирующие серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; ii) частью последовательности мРНК SIGIRR, содержащей нуклеотиды, кодирующие серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; или iii) частью последовательности кДНК SIGIRR, содержащей нуклеотиды, кодирующие серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; b) удлинение праймера, используя метод специфической в отношении изменения полимеразной цепной реакции; и c) определение, произошло ли удлинение. Методы специфической в отношении изменения полимеразной цепной реакции можно использовать для обнаружения мутаций, таких как делеции в последовательности нуклеиновой кислоты. Специфические в отношении изменения праймеры используют, поскольку ДНК-полимераза не обеспечивает удлинение при наличии несовпадения с матрицей. В распоряжении специалистов в данной области техники имеется ряд вариаций базового метода специфической в отношении изменения полимеразной цепной реакции.

Специфический в отношении изменения праймер может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, или комплементарной цепи к последовательности нуклеиновой кислоты. Например, специфический в отношении изменения праймер может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO:9, или к комплементарной цепи к этой последовательности нуклеиновой кислоты. Специфический в отношении изменения праймер предпочтительно специфически гибридизируется с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный белок SIGIRR, когда последовательность нуклеиновой кислоты кодирует серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления анализ включает приведение биологического образца в контакт с праймером или зондом, который специфически гибридизируется с последовательностью геномной ДНК, последовательностью мРНК или последовательностью кДНК вариантного SIGIRR, но не с соответствующей последовательностью SIGIRR дикого типа, в жестких условиях, и определение, произошла ли гибридизация.

В некоторых вариантах осуществления анализ включает секвенирование РНК (РНК-секвенирование). В некоторых вариантах осуществления анализ также включает обратное транскрибирование мРНК в кДНК посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР).

В некоторых вариантах осуществления в способах используют зонды и праймеры достаточной нуклеотидной длины, чтобы связывать целевую последовательность нуклеиновой кислоты и специфически обнаруживать и/или идентифицировать полинуклеотид, содержащий геномную ДНК, мРНК или кДНК вариантного SIGIRR. Гибридизационные условия или реакционные условия могут быть определены оператором для достижения этого результата. Нуклеотидная длина может представлять собой любую длину, достаточную для применения в выбранном способе обнаружения, включая любой анализ, описанный или проиллюстрированный в данном документе. В общем случае, например, используют зонды или праймеры, имеющие около 8, около 10, около 11, около 12, около 14, около 15, около 16, около 18, около 20, около 22, около 24, около 26, около 28, около 30, около 40, около 50, около 75, около 100, около 200, около 300, около 400, около 500, около 600 или около 700 нуклеотидов или более, или от около 11 до около 20, от около 20 до около 30, от около 30 до около 40, от около 40 до около 50, от около 50 до около 100, от около 100 до около 200, от около 200 до около 300, от около 300 до около 400, от около 400 до около 500, от около 500 до около 600, от около 600 до около 700 или от около 700 до около 800 или более нуклеотидов в длину. В предпочтительных вариантах осуществления зонд или праймер имеет длину по меньшей мере около 18 нуклеотидов. Зонд или праймер может иметь длину, составляющую от около 10 до около 35, от около 10 до около 30, от около 10 до около 25, от около 12 до около 30, от около 12 до около 28, от около 12 до около 24, от около 15 до около 30, от около 15 до около 25, от около 18 до около 30, от около 18 до около 25, от около 18 до около 24 или от около 18 до около 22 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления зонд или праймер имеет длину, составляющую от около 18 до около 30 нуклеотидов.

Такие зонды и праймеры могут специфически гибридизироваться с целевой последовательностью в условиях гибридизации высокой жесткости. Зонды и праймеры могут иметь полную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты из смежных нуклеотидов с целевой последовательностью, хотя с помощью традиционных способов можно конструировать зонды, отличающиеся от последовательности целевой нуклеиновой кислоты, но которые сохраняют способность специфически обнаруживать и/или идентифицировать последовательность целевой нуклеиновой кислоты. Соответственно, зонды и праймеры могут иметь около 80%, около 85%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или 100% идентичности или комплементарности последовательности с целевой молекулой нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления специфические праймеры можно использовать, чтобы амплифицировать локус вариантного SIGIRR и/или мРНК или кДНК вариантного SIGIRR, чтобы получить ампликон, который можно использовать в качестве специфического зонда, или который можно обнаруживать сам по себе для идентификации локуса вариантного SIGIRR или для определения уровня специфических мРНК или кДНК SIGIRR в биологическом образце. Локус вариантного SIGIRR можно использовать для обозначения последовательности геномной нуклеиновой кислоты, включающей позиции, соответствующие позициям, кодирующим серин в позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. Когда зонд гибридизируют с молекулой нуклеиновой кислоты в биологическом образце в условиях, которые обеспечивают связывание зонда с молекулой нуклеиновой кислоты, это связывание может быть обнаружено и обеспечивать показание наличия локуса вариантного SIGIRR или наличия уровня мРНК или кДНК вариантного SIGIRR в биологическом образце. Такая идентификация связанного зонда была описана. Специфический зонд может содержать последовательность, которая является на по меньшей мере около 80%, от около 80% до около 85%, от около 85% до около 90%, от около 90% до около 95% и от около 95% до около 100% идентичной (или комплементарной) конкретной области гена вариантного SIGIRR. Специфический зонд может содержать последовательность, которая является на по меньшей мере около 80%, от около 80% до около 85%, от около 85% до около 90%, от около 90% до около 95% и от около 95% до около 100% идентичной (или комплементарной) конкретной области мРНК вариантного SIGIRR. Специфический зонд может содержать последовательность, которая является на по меньшей мере около 80%, от около 80% до около 85%, от около 85% до около 90%, от около 90% до около 95% и от около 95% до около 100% идентичной (или комплементарной) конкретной области кДНК вариантного SIGIRR.

В некоторых вариантах осуществления, чтобы определить, содержит ли комплементарная цепь нуклеиновой кислоты биологического образца последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариантный белок SIGIRR (например, усеченный белок SIGIRR или вариантный белок SIGIRR, содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9), биологический образец можно подвергать амплификации нуклеиновой кислоты, используя пару праймеров, которая содержит первый праймер, полученный из 5' фланкирующей последовательности, смежной с позициями, кодирующими серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, и второй праймер, полученный из 3' фланкирующей последовательности, смежной с позициями, кодирующими серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, для получения ампликона, являющегося диагностическим в отношении наличия нуклеотидов в позициях, кодирующих серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления длина ампликона может варьироваться от комбинированной длины пар праймеров плюс одна пара нуклеотидных оснований до любой длины ампликона, получаемой с помощью протокола амплификации ДНК. Это расстояние может варьироваться от одной пары нуклеотидных оснований до ограничения реакции амплификации или до около двадцати тысяч пар нуклеотидных оснований. Необязательно, пара праймеров фланкирует область, включающую позиции, кодирующие серин в позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, и по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более нуклеотидов с каждой стороны позиций, кодирующих серин в позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. Аналогичные ампликоны можно создавать из последовательностей мРНК и/или кДНК.

Типовые способы получения и применения зондов и праймеров описаны, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989 (hereinafter, “Sambrook et al., 1989”); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (с периодическими обновлениями) (далее по тексту “Ausubel et al., 1992”); и Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990). Пары ПЦР-праймеров могут быть получены из известной последовательности, например, с помощью компьютерных программ, предназначенных для этих целей, таких как инструмент анализа ПЦР-праймеров в Vector NTI, версия 10 (Informax Inc., Bethesda Md.); PrimerSelect (DNASTAR Inc., Madison, Wis.); и Primer3 (Version 0.4.0.COPYRGT., 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Кроме того, последовательность можно изучать визуально и идентифицировать праймеры вручную, используя известные руководства.

Любой способ гибридизации или амплификации, или секвенирования нуклеиновых кислот можно использовать для специфического обнаружения наличия генного локуса вариантного SIGIRR и/или уровня мРНК или кДНК, полученной из мРНК, вариантного SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты можно использовать в качестве праймера для амплификации области нуклеиновой кислоты SIGIRR или же молекулу нуклеиновой кислоты можно использовать в качестве зонда, который специфически гибридизируется, например, в жестких условиях, с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей генный локус вариантного SIGIRR, или молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей мРНК или кДНК, полученную из мРНК, вариантного SIGIRR.

В данной области техники доступен ряд методик, включая, например, секвенирование нуклеиновых кислот, гибридизацию нуклеиновых кислот и амплификацию нуклеиновых кислот. Иллюстративные примеры методик секвенирования нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваются этим, секвенирование с терминатором синтеза цепи (по Сэнгеру) и секвенирование с меченным красителем терминатором.

Другие способы включают способы гибридизации нуклеиновых кислот, отличные от секвенирования, включая применение меченных праймеров и зондов, направленных против очищенной ДНК, амплифицированной ДНК и фиксированных клеточных препаратов (флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)). В некоторых способах целевую нуклеиновую кислоту можно амплифицировать до обнаружения или одновременно с ним. Иллюстративные примеры методик амплификации нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваются этим, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), лигазную цепную реакцию (ЛЦР), амплификацию с замещением цепей (АЗЦ) и амплификацию на основании последовательности нуклеиновой кислоты (АОПНК). Другие способы включают, но не ограничиваются этим, лигазную цепную реакцию, амплификацию с замещением цепей и термофильную АЗЦ (тАЗЦ).

Для обнаружения как неамплифицированных, так и амплифицированных полинуклеотидов можно применять любой способ, включая, например, анализ защиты гибридизации (АЗГ), количественную оценку процесса амплификации в режиме реального времени и определение количества целевой последовательности, изначально присутствующего в образце, в основе которого не лежит амплификация в режиме реального времени.

Также предложены способы идентификации нуклеиновых кислот, которые необязательно требуют амплификации последовательности и которые основаны, например, на известных способах саузерн-блот гибридизации (ДНК:ДНК), гибридизации in situ (ISH) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) хромосомного материала. Саузерн-блоттинг можно применять для обнаружения конкретных последовательностей нуклеиновых кислот. В таких способах нуклеиновую кислоту, которую экстрагируют из образца, фрагментируют, электрофоретически разделяют на матричном геле и переносят на мембранный фильтр. Связанную с фильтром нуклеиновую кислоту подвергают гибридизации с меченым зондом, комплементарным представляющей интерес последовательности. Проводят обнаружение гибридизированного зонда, связанного с фильтром. В любом из таких способов процесс может включать гибридизацию с использованием любого из зондов, описанных или проиллюстрированных в данном документе.

В способах гибридизации можно применять жесткие условия так, чтобы зонд или праймер специфически гибридизировался со своей мишенью. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный праймер или зонд будет гибридизироваться в жестких условиях со своей целевой последовательностью (например, генным локусом вариантного SIGIRR, мРНК вариантного SIGIRR или кДНК вариантного SIGIRR) в заметно большей степени, чем с другими последовательностями (например, соответствующим локусом SIGIRR дикого типа, мРНК дикого типа или кДНК дикого типа), например, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза или более превышающей фон, включая более чем 10-кратное превышение фона. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный праймер или зонд будет гибридизироваться в жестких условиях со своей целевой последовательностью в заметно большей степени, чем с другими последовательностями, по меньшей мере в 2 раза. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный праймер или зонд будет гибридизироваться в жестких условиях со своей целевой последовательностью в заметно большей степени, чем с другими последовательностями, по меньшей мере в 3 раза. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный праймер или зонд будет гибридизироваться в жестких условиях со своей целевой последовательностью в заметно большей степени, чем с другими последовательностями, по меньшей мере в 4 раза. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный праймер или зонд будет гибридизироваться в жестких условиях со своей целевой последовательностью в заметно большей степени, чем с другими последовательностями, более чем в 10 раза превышающей фон. Условия жесткости зависят от последовательности и будут разниться в разных обстоятельствах. Регулируя условия жесткости гибридизации и/или промывки, можно идентифицировать целевые последовательности, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование). В альтернативном варианте, условия жесткости можно регулировать так, чтобы допустить некоторое несовпадение в последовательностях так, чтобы можно было обнаруживать идентичность меньшей степени (гетерологичное зондирование).

Соответствующие условия жесткости, которые стимулируют гибридизацию ДНК, например, 6X хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при около 45°C с последующей промывкой 2X SSC при 50°C, являются известными и описаны в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Как правило, жесткие условия для гибридизации и обнаружения являются такими, при которых концентрация соли составляет менее чем около 1,5 М ионов Na, как правило, это концентрация от около 0,01 до 1,0 М ионов Na (или других солей) при pH 7,0-8,3 и температуре, составляющей по меньшей мере 30°C для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере около 60°C для более длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов). Жесткие условия также можно обеспечить путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Типовые условия низкой жесткости включают гибридизацию с буферным раствором из 30-35% формамида, 1 М NaCl, 1% ДСН (додецилсульфат натрия) при 37°C и промывку в 1X - 2X SSC (20X SSC=3,0 М NaCl/0,3 М тринатрийцитрат) при 50-55°C. Типовые условия умеренной жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М NaCl, 1% ДСН при 37°C и промывку в 0,5X - 1X SSC при 55-60°C. Типовые условия высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М NaCl, 1% ДСН при 37°C и промывку в 0,1X SSC при 60-65°C. Необязательно, промывочные буферы могут содержать от около 0,1% до около 1% ДСН. Длительность гибридизации в общем случае составляет менее 24 часов, обычно от около 4 до около 12 часов. Длительность промывки должна составлять по меньшей мере отрезок времени, достаточный для достижения равновесия.

В реакциях гибридизации специфичность, как правило, является функцией промывок после гибридизации, при этом важными факторами являются ионная сила и температура конечного промывочного раствора. В случае гибридов ДНК-ДНК T_m можно аппроксимировать из уравнения из Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 1984, 138, 267-284: T_m=81,5°C+16,6 (log М) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% форм.) - 500/L; где M - молярность одновалентных катионов, %GC - процентное содержание нуклеотидов гуанозина и цитозина в ДНК, % форм. - процентное содержание формамида в гибридизационном растворе, а L - длина гибрида в парах оснований. T_m представляет собой температуру (при определенных ионной силе и pH), при которой 50% комплементарной целевой последовательности гибридизируется с идеально совпадающим зондом. T_m снижается на около 1°C для каждого 1% несовпадения; таким образом, T_m, гибридизацию и/или условия промывки можно корректировать для гибридизации последовательностей с необходимой идентичностью. Например, если проводится поиск последовательностей с ≥ 90% идентичности, T_m можно снизить на 10°C. В общем случае условия жесткости выбирают так, чтобы температура была на около 5°C ниже, чем температура плавления (T_m) для конкретной последовательности и ее комплементарной цепи при определенных ионной силе и pH. При этом в условиях очень высокой жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 1°C, 2°C, 3°C или 4°C ниже, чем температура плавления (T_m); в условиях умеренной жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 6°C, 7°C, 8°C, 9°C или 10°C ниже, чем температура плавления (T_m); в условиях низкой жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 11°C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C или 20°C ниже, чем температура плавления (T_m). Используя уравнение, композиции для гибридизации и промывки, а также необходимую T_m, специалистам в данной области техники понятно, что в данном случае заведомо описаны вариации жесткости растворов для гибридизации и/или промывки. Если необходимая степень несовпадения приводит к T_m менее 45°C (водный раствор) или 32°C (раствор формамида), оптимально повысить концентрацию SSC так, чтобы можно было использовать более высокую температуру.

Также предложены способы для обнаружения наличия или количественной оценки уровней полипептида вариантного SIGIRR в биологическом образце, включающие, например, секвенирование белка и иммуноанализ. В некоторых вариантах осуществления способ обнаружения наличия вариантного белка SIGIRR (например, SEQ D NO:9) у субъекта-человека включает проведение анализа биологического образца от субъекта-человека, который позволяет обнаруживать наличие вариантного белка SIGIRR (например, SEQ D NO:4) в биологическом образце.

Иллюстративные неограничивающие примеры техник белкового секвенирования включают, но не ограничиваются этим, масс-спектрометрию и расщепление по Эдману. Иллюстративные примеры методов иммуноанализа включают, но не ограничиваются этим, иммунопреципитацию, вестерн-блоттинг, иммуногистохимию, ИФА, иммуноцитохимию, проточную цитометрию и иммуно-ПЦР. Поликлональные или моноклональные антитела, помеченные с возможностью обнаружения с помощью разных известных методик (например, калориметрических, флуоресцентных, хемилюминесцентных или радиоактивных), подходят для применения в иммуноанализе. что касается иммуноанализа, вариантный белок SIGIRR имеет отличный размер по сравнению с белком SIGIRR дикого типа и, следовательно, соответствует отличной молекулярной масса в белковом геле. Таким образом, используя одно антитело, можно отличить белок SIGIRR дикого типа от вариантного белка SIGIRR, например, в анализе вестерн-блоттинга.

Симптомы воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте включают, но не ограничиваются этим, диарею, высокую температуру, слабость, боль в области живота, спазмы в животе, тошноту, рвоту, наличие крови в стуле, анемию, снижение аппетита и непреднамеренную потерю массы, или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления способы включают обнаружение наличия геномной ДНК, мРНК или кДНК, полученной из мРНК, вариантного SIGIRR, полученных из биологического образца, полученного от субъекта. Следует понимать, что генные последовательности в популяции, а также мРНК и белки, кодируемые такими генами, могут варьироваться вследствие полиморфизма, такого как однонуклеотидный полиморфизм (ОНП). Последовательности, приведенные в данном документе для геномной ДНК, мРНК, кДНК и полипептида SIGIRR, являются всего лишь типовыми последовательностями, но также возможны другие подобные последовательности, включая дополнительные аллели SIGIRR.

В некоторых вариантах осуществления этап обнаружения включает секвенирование по меньшей мере части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует усеченный белок SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления этап обнаружения включает секвенирование по меньшей мере части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует усеченный SIGIRR, причем секвенируемая молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит позицию, соответствующую позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. Секвенировать можно любые молекулы нуклеиновых кислот, раскрытые в данном документе (например, геномную ДНК, мРНК или кДНК). В некоторых вариантах осуществления этап обнаружения включает секвенирование всей молекулы нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления этап обнаружения включает: амплификацию по меньшей мере части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SIGIRR; мечение молекулы нуклеиновой кислоты пригодной для обнаружения меткой; приведение меченной нуклеиновой кислоты в контакт с подложкой, содержащей зонд, причем зонд содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется в жестких условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей усеченный белок SIGIRR; и обнаружение пригодной для обнаружения метки. В некоторых вариантах осуществления этап обнаружения включает: амплификацию по меньшей мере части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SIGIRR, причем амплифицированная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит позицию, соответствующую позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; мечение молекулы нуклеиновой кислоты пригодной для обнаружения меткой; приведение меченной нуклеиновой кислоты в контакт с подложкой, содержащей зонд, причем зонд содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется в жестких условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аспарагиновую кислоту в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; и обнаружение пригодной для обнаружения метки. Амплифицировать можно любые раскрытые в данном документе молекулы нуклеиновых кислот. Например, можно амплифицировать любые из молекул геномной ДНК, кДНК или мРНК, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой мРНК, а способ дополнительно включает обратное транскрибирование мРНК в кДНК перед этапом амплификации.

В некоторых вариантах осуществления этап обнаружения включает: приведение молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SIGIRR, в контакт с зондом, содержащим пригодную для обнаружения метку, причем зонд содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется в жестких условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей усеченный белок SIGIRR, и обнаружение пригодной для обнаружения метки. В некоторых вариантах осуществления этап обнаружения включает: приведение молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SIGIRR, в контакт с зондом, содержащим пригодную для обнаружения метку, причем зонд содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется в жестких условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, которая содержит серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, и обнаружение пригодной для обнаружения метки. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты присутствует в клетке, полученной от субъекта-человека, а обнаружение проводят в соответствии с методом гибридизации in situ.

В некоторых вариантах осуществления этап обнаружения включает приведение молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SIGIRR, в контакт со специфическим в отношении изменения праймером и амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты с применением методов специфической к изменениям ПЦР. Специфический в отношении изменения праймер может представлять собой любой такой праймер, описанный в данном документе, и может быть специфическим в отношении вариантных белков SIGIRR, которые кодируют серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

Другие методы анализа, которые можно использовать в раскрытых в данном документе способах, включают, например, полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) или количественную ОТ-ПЦР (кОТ-ПЦР). Другие методы анализа, которые можно использовать в раскрытых в данном документе способах, включают, например, секвенирование РНК (РНК-секвенирование) с последующим обнаружением наличия и количества вариантной мРНК или кДНК в биологическом образце.

В данном раскрытии также предложены способы идентификации субъекта-человека, имеющего воспалительное заболевание кишечника или воспалительное заболевание кишечника с началом в раннем возрасте, или риск развития воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте. указанные способы в общем случае включают обнаружение в образце, полученном от субъекта, наличия или отсутствия вариантного белка SIGIRR; и/или наличия или отсутствия любой из описанных в данном документе молекул нуклеиновых кислот, кодирующих вариантный белок SIGIRR. Наличие усеченного белка SIGIRR указывает на то, что субъект имеет воспалительное заболевание кишечника или воспалительное заболевание кишечника с началом в раннем возрасте, или риск развития воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте. Наличие гуанина (вследствие делеции аденина) в позиции, соответствующей позиции 9962 в соответствии с SEQ ID NO:2 (например, геномной ДНК), или в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:4 (например, мРНК), или в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:6 (например, кДНК), что в каждом случае приводит к получению вариантного белка SIGIRR, усеченного по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащего серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, указывает на то, что субъект имеет воспалительное заболевание кишечника или воспалительное заболевание кишечника с началом в раннем возрасте, или риск развития воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте. Указанный способ можно проводить in vitro, in situ или in vivo.

В данном раскрытии также предложены способы идентификации субъекта-человека, имеющего воспалительное заболевание кишечника с началом в раннем возрасте или риск развития воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте, при этом способ включает обнаружение в образце, полученном от субъекта, наличия или отсутствия: белка SIGIRR, содержащего серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, и усеченного по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9; и/или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, содержащий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, и усеченный по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9; причем наличие усеченного белка SIGIRR и/или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей усеченный белок SIGIRR, указывает на то, что субъект имеет воспалительное заболевание кишечника с началом в раннем возрасте, или риск развития воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте. В некоторых вариантах осуществления усеченный белок SIGIRR содержит отличную аминокислоту по сравнению с белком SIGIRR дикого типа в любой из позиций, соответствующих позициям 186-209 и 211-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления усеченный белок SIGIRR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления обнаружение наличия или отсутствия усеченного белка SIGIRR в образцах проводят с помощью антитела, специфического в отношении усеченного SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое является специфическим в отношении усеченного SIGIRR, является специфическим в отношении: i) серина в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; или ii) эпитопа, созданного в белке SIGIRR вследствие мутации со сдвигом рамки, которая приводит к появлению серина в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления обнаружение дополнительно включает сравнение реакции антитела, специфического в отношении усеченного SIGIRR, с реакцией антитела, специфического в отношении SIGIRR дикого типа. В некоторых вариантах осуществления обнаружение наличия или отсутствия усеченного белка SIGIRR в указанном образце проводят с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). В некоторых вариантах осуществления обнаружение наличия или отсутствия указанной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный белок SIGIRR, в образце проводят путем определения, есть ли мутация со сдвигом рамки в молекуле нуклеиновой кислоты, создающая кодон, кодирующий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления секвенируемая часть молекулы нуклеиновой кислоты содержит некоторое количество позиций, охватывающих кодон, кодирующий позицию, соответствующую позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления способа этап обнаружения включает секвенирование по меньшей мере части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления способа этап обнаружения включает секвенирование по меньшей мере части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует усеченный белок SIGIRR. Секвенируемая молекула нуклеиновой кислоты может кодировать аминокислотную последовательность, которая содержит позицию, соответствующую позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. Наличие гуанина (вследствие делеции аденина) в позиции, соответствующей позиции 9962 в соответствии с SEQ ID NO:2 (например, геномной ДНК), или в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:4 (например, мРНК), или в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:6 (например, кДНК), что в каждом случае приводит к получению вариантного белка SIGIRR, усеченного по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащего серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. Этап обнаружения может включать секвенирование молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей весь белок SIGIRR.

В некоторых вариантах осуществления способа этап обнаружения включает амплификацию по меньшей мере части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует усеченный белок SIGIRR, мечение молекулы нуклеиновой кислоты пригодной для обнаружения меткой, приведение меченой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт с подложкой, содержащей зонд, причем зонд содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизируется, в том числе, например, в жестких условиях, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей усеченный белок SIGIRR, и обнаружение пригодной для обнаружения метки. В некоторых вариантах осуществления способа этап обнаружения включает амплификацию по меньшей мере части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SIGIRR, мечение амплифицированной молекулы нуклеиновой кислоты пригодной для обнаружения меткой, приведение меченой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт с подложкой, содержащей зонд, причем зонд содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизируется, в том числе, например, в жестких условиях, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9 (или с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей гуанин (вследствие делеции аденина) в позиции, соответствующей позиции 9962 в соответствии с SEQ ID NO:2 (например, геномная ДНК), или в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:4 (например, мРНК), или в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:6 (например, кДНК), что в каждом случае приводит к получению вариантного белка SIGIRR, усеченного по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащего серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9), и обнаружение пригодной для обнаружения метки. Амплифицируемая молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит позицию, соответствующую позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. Если нуклеиновая кислота включает мРНК, способ может дополнительно включать обратное транскрибирование мРНК в кДНК перед этапом амплификации. В некоторых вариантах осуществления этап обнаружения включает приведение молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SIGIRR, в контакт с зондом, содержащим пригодную для обнаружения метку, и обнаружение пригодной для обнаружения метки. Зонд предпочтительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизируется, в том числе, например, в жестких условиях, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, которая содержит серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9 (или с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей гуанин (вследствие делеции аденина) в позиции, соответствующей позиции 9962 в соответствии с SEQ ID NO:2 (например, геномная ДНК), или в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:4 (например, мРНК), или в позиции, соответствующей позиции 557 в соответствии с SEQ ID NO:6 (например, кДНК), что в каждом случае приводит к получению вариантного белка SIGIRR, усеченного по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9, и содержащего серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9). Молекула нуклеиновой кислоты может находиться внутри клетки, полученной от субъекта-человека.

В некоторых вариантах осуществления этап обнаружения включает: амплификацию по меньшей мере части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SIGIRR, причем амплифицированная молекула нуклеиновой кислоты включает кодон, кодирующий аминокислоту в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; мечение молекулы нуклеиновой кислоты пригодной для обнаружения меткой; приведение меченной молекулы нуклеиновой кислоты в контакт с подложкой, содержащей зонд, причем зонд содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизируется в жестких условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей кодон, кодирующий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; и обнаружение пригодной для обнаружения метки.

В данном раскрытии также предложены способы диагностирования воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте или выявления риска развития воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте у субъекта-человека, включающие: обнаружение усеченного белка SIGIRR в образце, полученном от субъекта-человека; и диагностирование у субъекта-человека воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте, если субъект имеет один или более симптомов воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте, или диагностирование субъекта-человека как подверженного риску развития воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте, если субъект не имеет один или более симптомов воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте. В некоторых вариантах осуществления субъект-человек нуждается в таком диагностировании. В данном раскрытии также предложены способы диагностирования воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте или выявления риска развития воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте у субъекта-человека, включающие: обнаружение вариантного белка SIGIRR, такого как белок, содержащий SEQ ID NO:9, в образце, полученном от субъекта-человека; и диагностирование у субъекта-человека воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте, если субъект имеет один или более симптомов воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте, или диагностирование субъекта-человека как подверженного риску развития воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте, если субъект не имеет один или более симптомов воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте. В некоторых вариантах осуществления субъект-человек нуждается в таком диагностировании. В некоторых вариантах осуществления субъект-человек может иметь родственников, у которых было диагностировано воспалительное заболевание кишечника или воспалительное заболевание кишечника с началом в раннем возрасте.

В данном раскрытии также предложены способы диагностирования воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте или выявления риска воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте у субъекта-человека, включающие: обнаружение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SIGIRR, в образце, полученном от субъекта-человека, причем белок SIGIRR содержит серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, и усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9; и/или обнаружение белка SIGIRR, в образце, полученном от субъекта-человека, причем белок SIGIRR содержит серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9, и усечен по позиции, соответствующей позиции 215 в соответствии с SEQ ID NO:9; и диагностирование у субъекта-человека воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте, если субъект имеет один или более симптомов воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте, или диагностирование субъекта-человека как подверженного риску воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте, если субъект не имеет один или более симптомов воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте. В некоторых вариантах осуществления усеченный белок SIGIRR содержит отличную аминокислоту по сравнению с белком SIGIRR дикого типа в любой из позиций, соответствующих позициям 186-209 и 211-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления усеченный белок SIGIRR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 в позициях, соответствующих позициям 186-215 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления обнаружение усеченного белка SIGIRR проводят с помощью антитела, специфического в отношении усеченного SIGIRR. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое является специфическим в отношении усеченного SIGIRR, является специфическим в отношении: i) серина в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; или ii) эпитопа, созданного в белке SIGIRR вследствие мутации со сдвигом рамки, которая приводит к появлению серина в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления обнаружение дополнительно включает сравнение реакции антитела, специфического в отношении усеченного SIGIRR, с реакцией антитела, специфического в отношении SIGIRR дикого типа. В некоторых вариантах осуществления обнаружение усеченного белка SIGIRR проводят с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). В некоторых вариантах осуществления обнаружение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный усеченный белок SIGIRR, проводят путем обнаружения, есть ли мутация со сдвигом рамки в указанной молекуле нуклеиновой кислоты, создающая кодон, кодирующий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления секвенируемая часть молекулы нуклеиновой кислоты содержит некоторое количество позиций, охватывающих кодон, кодирующий позицию, соответствующую позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления этап обнаружения включает: амплификацию по меньшей мере части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок SIGIRR, причем амплифицированная молекула нуклеиновой кислоты включает кодон, кодирующий аминокислоту в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; мечение молекулы нуклеиновой кислоты пригодной для обнаружения меткой; приведение меченой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт с подложкой, содержащей зонд, причем зонд содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизируется в жестких условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей кодон, кодирующий серин в позиции, соответствующей позиции 186 в соответствии с SEQ ID NO:9; и обнаружение пригодной для обнаружения метки.

В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе субъект-человек, от которого получен образец (например, субъект-человек, которого диагностируют или лечат), не является взрослым. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе субъект-человек, от которого получен образец, имеет возраст 18 лет или меньше. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе субъект-человек, от которого получен образец, имеет возраст 15 лет или меньше. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе субъект-человек, от которого получен образец, имеет возраст 13 лет или меньше. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе субъект-человек, от которого получен образец, имеет возраст 10 лет или меньше. В некоторых вариантах осуществления субъект-человек, который имеет возраст 6 лет или менее, может иметь воспалительное заболевание кишечника с очень ранним началом. В некоторых вариантах осуществления субъект-человек не имеет некротизирующий энтероколит.

В некоторых вариантах осуществления любые из описанных в данном документе способов могут дополнительно включать лечение субъекта агентом, эффективным для лечения воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте. В некоторых вариантах осуществления указанные способы дополнительно включают лечение субъекта агентом, эффективным для лечения воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте, при обнаружении изменения у субъекта и диагностировании у субъекта воспалительного заболевания кишечника или воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте.

В данном раскрытии также предложено применение любых раскрытых в данном документе молекул геномной ДНК, мРНК, кДНК, полипептидов вариантного SIGIRR и гибридизацию раскрытых в данном документе молекул нуклеиновых кислот при диагностике воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте или диагностике риска развития воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте.

Все патентные документы, веб-сайты, другие публикации, номера доступа и т.п., цитируемые выше или ниже, в полном объеме и во всех целях включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждый отдельный источник был бы специально и отдельно указан как включенный посредством ссылки. Если в разное время к номеру доступа были привязаны разные версии последовательности, подразумевается версия, привязанная к номеру доступа на момент действительной даты подачи этой заявки. Действительная дата подачи означает более раннюю из фактической даты подачи или даты подачи приоритетной заявки, ссылающуюся на номер доступа, в случае применимости. Аналогично, если разные версии публикации, веб-сайта и т.п. опубликованы в разное время, подразумевается самая последняя опубликованная версия на момент действительной даты подачи заявки, если не указано иное. Любой признак, этап, элемент, вариант осуществления или аспект данного раскрытия можно применять в комбинации с любым другим признаком, этапом, элементом, вариантом осуществления или аспектом, если специально не указано иное. Хотя данное изобретение было описано в некоторых подробностях посредством иллюстраций и примеров в целях ясности и понимания, следует понимать, что практически можно осуществлять определенные изменения и модификации, входящие в объем прилагаемой формулы изобретения.

Приведенные в данном документе нуклеотидные и аминокислотные последовательности показаны с помощью стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований и однобуквенного кода для аминокислот. Нуклеотидные последовательности соответствуют стандартной конвенции с началом в 5' конце последовательности и продолжением (т.е. слева направо в каждой линии) до 3' конца. Показана только одна цепь каждой нуклеотидной последовательности, но подразумевается, что комплементарная цепь включена при любом упоминании приведенной цепи. Аминокислотные последовательности соответствуют стандартной конвенции с началом в амино-конце последовательности и продолжением (т.е. слева направо в каждой линии) до карбокси-конца.

Следующие примеры приведены для более подробного описания вариантов осуществления. Они предназначены для иллюстрации, но не ограничения заявляемых вариантов осуществления.

Примеры

Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как получать и оценивать соединения, композиции, изделия, устройства и/или способы, заявленные в данном документе, и предназначены исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема того, что авторы изобретения считают объектом изобретения. Были предприняты меры, чтобы гарантировать точность в отношении чисел (например, количества, температуры и т.д.), но следует учитывать возможность некоторых погрешностей и отклонений. Если не указано иное, доли представляют собой массовые доли, температура выражена в °C или равна окружающей температуре, а давление равно атмосферному или близко к нему.

Пример 1: Набор пациентов и фенотипирование

Проводили полногеномное секвенирование и тройной анализ вариантов для 13-летнего пациента с ВЗК-РВ, его матери с ВЗК и его не имеющего заболевания отца. Эта семья была определена для генетической оценки ВЗК-РВ у пациента.

Пример 2: Геномные образцы

Геномную ДНК экстрагировали из образцов периферической крови и перевозили в генетический центр Regeneron (RGC, Regeneron Genetics Center) для полноэкзомного секвенирования, и хранили в автоматизированных биобанках при -80°C. Проводили флуоресцентную количественную оценку для того, чтобы убедиться в соответствующем качестве и количестве ДНК в целях секвенирования.

1 мкг ДНК разрезали до средней длины фрагментов 150 пар оснований (Covaris LE220) и готовили для захвата экзома с помощью специального набора реагентов от Kapa Biosystems. Захват образцов проводили, используя разработанные для экзома схемы NimbleGen SeqCap VCRome 2.1 или Integrated DNA Technologies xGen. Образцы снабжали штрих-кодом, объединяли и мультиплексировали для секвенирования, используя 75 п.о. секвенирование спаренных концов на Illumina HiSeq 2500 с химией v4. Захваченные фрагменты секвенировали до достижения минимум 85% охвата целевых оснований при охвате 20x или более. После секвенирования данные обрабатывали, используя облачный технологический процесс, разработанный RGC, в котором используются DNAnexus и AWS для работы стандартных инструментов для получения и анализа данных типа образец-уровень. Вкратце, генерировали данные секвенирования и демультиплексировали, используя программное обеспечение Illumina's CASAVA. Риды последовательностей картировали и выравнивали относительно референсной сборки человеческого генома GRCh37/hg19, используя BWA-mem. После выравнивания дублирующиеся риды помечали и снабжали флажком, используя инструменты Picard, а инделы повторно выравнивали, используя GATK, для улучшения качества определения вариантов. ОНП- и ИНДЕЛ-варианты и генотипы определяли, используя GATK's HaplotypeCaller, и применяли перекалибровку оценки качества вариантов (VQSR, Variant Quality Score Recalibration) от GATK, чтобы обозначить общие оценки качества вариантов. Статистику секвенирования и метрику качества данных получали для каждого образца, чтобы оценить эффективность захвата, эффективность выравнивания и определение вариантов.

Пример 3: Анализ геномных данных

К определенным вариантам применяли стандартные фильтры контроля качества для минимальной глубины рида (>10), качества генотипа (>30) и аллельного баланса (>20%). Проходящие варианты классифицировали и обозначали на основании их потенциальных функциональных эффектов (синонимичные, несинонимичные, сплайсинг-варианты, варианты со сдвигом рамки или без сдвига рамки), используя разработанную RGC технологическую схему обозначения и анализа. Фамильную взаимосвязь верифицировали с помощью метрики идентичности по происхождению из генетических данных, чтобы определить родство и взаимосвязь в группе, используя PRIMUS (Staples et al., Amer. J. Human Genet., 2014, 95, 553-564) и перекрестные ссылки с сообщенным происхождением для данной семьи.

Анализ вариантов на основе происхождения и сегрегацию проводили, чтобы идентифицировать кандидатные гены заболевания с аутосомно-доминантным профилем наследования с учетом известного семейного анамнеза. Общие варианты для больного пробанда и его больной матери, но не общие с не имеющим заболевания отцом, впоследствии обозначали и фильтровали по наблюдаемой частоте в популяционных контрольных базах данных, таких как dbSNP, 1000 Genomes Project, NHLBI Exome Sequencing Project, Exome Aggregation Consortium Database (ExAc), и внутренним базам данных RGC, чтобы отфильтровать стандартные полиморфизмы и высокочастотные вероятные доброкачественные варианты. Алгоритмы биоинформационного прогнозирования функциональных эффектов вариантов, такие как LRT, Poly-phen2, SIFT, CADD и Mutation Taster, наряду с оценками консервативности на основании выравнивания для множества видов (т.е. GERP, PhastCons, PhyloP) были включены как часть процесса обозначения вариантов и использовались для информирования о потенциальной вредоносности идентифицированных кандидатных вариантов.

В гене SIGIRR был идентифицирован редкий, обуславливающий усечение индел-вариант (SIGIRR: c.557delA; p.K186fs*31), сегрегирующий с воспалительным заболеванием кишечника с началом в раннем возрасте у 13-летнего пациента, которое было унаследовано от его имеющей ВЗК матери. На Фиг. 1 (панели A, B и C) проиллюстрирована идентификация обуславливающего усечение варианта в гене SIGIRR с доминантной сегрегацией в семье с болезнью Крона (БК). На панели A приведена таблица, описывающая обуславливающий усечение вариант SIGIRR в c.557delA/p.K186fs*31 с наследованием по материнской линии; сайт варианта имеет нейтральную оценку консервативности среди видов и по прогнозам нарушает функцию белка; этот вариант имеет частоту альтернирующей аллели 0,000471 в браузере ExAC. На панели B приведена генеалогия для больного ВЗК-РВ пациента (Utah81427), его имеющей болезнь Крона матери (Utah81428) и не имеющего заболевание отца (Utah81429); окрашенные символы обозначают имеющих БК индивидов, неокрашенные символы обозначают не имеющих заболевание индивидов; круги обозначают женщин, а квадраты обозначают мужчин. На панели C приведено визуальное подтверждение обуславливающего усечение варианта SIGIRR, сегрегирующего у имеющего БК Utah81427 и его имеющей БК матери, но отсутствующего у не имеющего заболевание отца.

Пример 4: Обнаружение

Наличие определенного генетического варианта у субъекта может указывать на то, что субъект имеет повышенный риск развития воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте. Образец, такой как образец крови, можно получить от субъекта. Нуклеиновые кислоты можно выделить из образца, используя обычные наборы для экстракции нуклеиновых кислот. После выделения нуклеиновой кислоты из образца, полученного от субъекта, нуклеиновую кислоту секвенируют для определения наличия генетического варианта в ней. Последовательность нуклеиновой кислоты можно сравнивать с контрольной последовательностью (последовательностью дикого типа). Обнаружение разницы между нуклеиновой кислотой, полученной из образца, полученного от субъекта, и контрольной последовательностью, указывает на наличие генетического варианта. Эти этапы можно проводить, как описано в примерах выше и в тексте данного раскрытия. Наличие одного или более генетических вариантов указывает на повышенный риск развития у субъекта воспалительного заболевания кишечника с началом в раннем возрасте.

Пример 5: Исследования

Материалы и методы

Клеточные линии и культуральные условия:

Трансформированные вирусом Эпштейна-Барр лимфобластные клеточные линии (ЛКЛ) создавали из клеток педиатрических пациентов с ВЗК при одобрении IRB (Institutional Review Board, институциональный наблюдательный совет) в Научном центре здоровья Университета Юты. Здоровые ЛКЛ приобретали у Американской коллекции типовых культур (ATCC; Manassas, VA). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco product ID: 12633), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (Gibco product ID: 10438026), 1X пенициллина-стрептомицина (Gibco product ID: 15140122) и 1X L-глутамина (Gibco product ID: 25030081).

Условия стимуляции:

ЛКЛ, полученные из клеток здоровых контролей, пациента с потерей функции SIGIRR и ЛКЛ от 4 пациентов с ВЗК-РВ, не имеющих SIGIRR с потерей функции, стимулировали 2 мг/мл ЛПС (InvivoGen, San Diego, CA) в течение 72 часов или 2 мг/мл αIgM/αCD40 (Affymetrix, Santa Clara, CA) в течение 16 часов. После стимуляции собирали клеточные культуральные супернатанты и использовали для количественной оценки секреции провоспалительных цитокинов, используя панель человеческих провоспалительных цитокинов для мезомасштабного исследования V-Plex (K15049D), и количественно оценивали, используя QuickPlex SQ 120 для мезомасштабного исследования, а после этого дополняли РНК-секвенированием.

Статистика:

Значимость определяли, используя 2-факторный дисперсионный анализ ANOVA, а СПС рассчитывали, используя результаты по 3 независимым экспериментам, используя GraphPad PRISM (La Jolla, CA)

Результаты:

Как проиллюстрировано на Фиг. 2, ЛКЛ, созданные из клеток пациента с SIGIRR с потерей функции, вырабатывали больше ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12p70 и ФНО-α, чем здоровые ЛКЛ или ЛКЛ от пациентов с ВЗК-РВ, не имеющих SIGIRR с потерей функции. Кроме того, нестимулированные ЛКЛ, созданные из клеток пациента с SIGIRR с потерей функции, секретировали повышенные уровни ИФН-γ, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12p70 и ФНО-α по сравнению со здоровыми ЛКЛ или некоторым ЛКЛ от пациентов с ВЗК-РВ, что указывает на то, что ЛКЛ с SIGIRR с потерей функции являются конститутивно активными и устойчивыми к стимуляции ЛПС. На Фиг. 2 синие столбики обозначают супернатанты, выделенные из нестимулированных клеток; красные столбики обозначают супернатанты, выделенные из стимулированных ЛПС клеток. «*» обозначает p < 0,05 по двухфакторному Anova; планки погрешностей указывают СПС по 3 независимым экспериментам.

Как проиллюстрировано на Фиг. 3, после стимуляции αIgM/αCD40, ЛКЛ, созданные из клеток пациента с SIGIRR с потерей функции, вырабатывали больше ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12p70 и ФНО-α, чем здоровые ЛКЛ или некоторые ЛКЛ от пациентов с ВЗК-РВ, не имеющих SIGIRR с потерей функции. Кроме того, нестимулированные ЛКЛ, созданные из клеток пациента с SIGIRR с потерей функции, секретировали повышенные уровни ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 и ФНО-α по сравнению со здоровыми ЛКЛ или некоторыми ЛКЛ от пациентов с ВЗК-РВ, что указывает на то, что ЛКЛ с SIGIRR с потерей функции являются конститутивно активными и устойчивыми к стимуляции анти-IgM/анти-CD40. На Фиг. 3 синие столбики обозначают супернатанты, выделенные из нестимулированных клеток; красные столбики обозначают супернатанты, выделенные из стимулированных анти-IgM/анти-CD40 клеток. «*» обозначает p<0,05 по двухфакторному Anova; планки погрешностей указывают СПС по 3 независимым экспериментам.

В нестимулированных клетках наблюдали повышающую регуляцию ключевых иммунных стимуляторов, включая ИЛ-1β, ИЛ-8 и ИЛ-6 в ЛКЛ пациента с ВЗК-РВ с усеченным (c.557delA; p.K186fs*31) SIGIRR по сравнению с ЛКЛ, созданными из здоровых контрольных клеток, и с ЛКЛ, созданными из клеток пациентов с ВЗК-РВ, не имеющих вариантов SIGIRR с потерей функции (ПФ). Это наблюдение подтверждает уникальную воспалительную сигнатуру у пациентов с ВЗК, несущих варианты SIGIRR с потерей функции. Кроме того, согласно наблюдениям, ЛКЛ пациентов с ВЗК-РВ с SIGIRR являются устойчивыми к стимуляции ИЛ-1β или ТПР, что подтверждает конститутивную активацию этих провоспалительных путей в отсутствие SIGIRR.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<120> ВАРИАНТЫ БЕЛКА, РОДСТВЕННОГО РЕЦЕПТОРУ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1

И СОДЕРЖАЩЕГО ОДИНОЧНЫЙ ДОМЕН ИММУНОГЛОБУЛИНА (SIGIRR),

И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 189238.00602

<150> 62/554,857

<151> 2017-09-06

<160> 16

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 11739

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> геномная последовательность SIGIRR дикого типа

<400> 1

actgcggggc ggggccgcac ctgctgccgc tgccggggct acgccgccgc cggggctgtt 60

gccgctgcgc acctggctca ggtgagctgc cccgcccccg cccggcgcga gccccaggtc 120

ctggcagcag gtgagtggcg gtcgccatca gacccgcgaa ggtgagtgga ggtcgcagtc 180

ctcccagagc cgctgcaggc ctggagtcgg ggcccggggc gctgcttgtc cctgggcgcg 240

gtctctcagg aaatggctcg gggccgggga ggttcccgcg tcgcccggaa gcccgagctc 300

gcccgcgtcc tggccctttc cagggctggg ggaagggagg aaagtgggcg aagggggcgg 360

gggccaccct ttcctctgcc cgacgtggtc agcggctttt tggtgaccct cgcgcagaac 420

agagcggggc taggagcgcc gaggcgcgca gggatcccac ctcggtcgcc caagcctgga 480

tcccagctcg aggcttcctg aggcgccgag ggcggaccaa gagtcaggct ggggcccgag 540

ctcgcccggc gccgggtgga gcttccgcca tccgcgcgcc tctgccccgg ccgagcgccc 600

cgagccgcac ccccgtgccc gcctcccgcg cgcgtcctcg ttctccgccc tcctcacttg 660

gagggcgccc agggcgcagg tgggcgcggg gtaggggagc gaaccagagc ccctcggcct 720

gcggggccgc agccttttac ccacgttcct gcttcaggac aggcgctggg ggcccagcgc 780

gcacggggag cggaggggcg gcgcgtccga gctgagcggg agtcgcccgc agggtgctgg 840

gtgctgagcg tcgaacccac cgggcagggg cggccgcgga ccgaggacgc tggctgggtc 900

tgagggcggg aggagctggc gctttctaag aacctcaagg tgcccagcag agtgcggtgg 960

gcagtgcgag gcgaccaggg ccaggcttgg actgagattc tgggcgcctc ggaagagctg 1020

tgcgggcgag ggtcggagac tttgtgggtg ttcatgctca ccctggacgg tggacctggg 1080

ggctcggggg tgcaggacgt tagcagagag agggaaggag agggtgccaa gccagccctg 1140

agagatggtg acgctgagac cgggtgcaca gagcagccgc cgagccgggg cttcacagtt 1200

ggcggctgac cccagggcct gtgctggagg ccctgctcct gcttcctgcg ggggtgccct 1260

gggccctgct gtgcctgctt cctgacctgc agtgtgggga gaaccttctt gaggggcttc 1320

caaggaccca cttcaaggag gggctggtac caggctctgt gggggaaggg gtgctgtctt 1380

tgggaccctg agcccaaggc ccaccatcac ccaaggctga gtaccgggac aaaggaaggt 1440

cctagcaggg ctgggactca gtcagacaag tacctgtaga aagcctgctg ctgagagggt 1500

gctcagccag ggccgggagg ctggatggca gccctccaca atgaagccct gcccccatgt 1560

ggctgagggc agggccaggg tccaaaggag acccttgtct gattctgtgg gcaataccag 1620

ccaccggtca ctgggtcccc agtcccaggt caacctgggg agtgtcagtt tggtgacaac 1680

aggagatgcc atctgcccct catctgctct gagccaggag cctcggccac ctgtgtttgc 1740

tccttatttg gaaaaggggg cgctgccctc ccaccccagc ctgaagggaa ggtccacaag 1800

atgccatagt cccttgtaac tgctcaccca tcgggggagc tatgtctggg agagggacgg 1860

ggagagggcg gaagagttct gctggagccc cattgttgac cgggagtttc tgaaggccct 1920

gttccccggg gtcagaggtc aaagacacat gggggagcaa accggcccct tggctcctga 1980

gtgtgagctc tagtagcgtc tggaaggcat gccgcgcggt ccccggtcct ccttgtatgt 2040

gtgcagggtg gccctggcgg gggtctcctg gctggaggac cccccatgca ttacccctgg 2100

aacctgcccc tttgagcacc ccccacccca caacacacac gcacacacac aaacgcacgc 2160

acacgcacat actgcacaca cattgcacac acgcagacac actgcacaca cacacacaca 2220

cacacacaca cacacacaca cacacacgct gcacagagga aagtgccgtg cctgggtggg 2280

ttggggcggg ctccagagga aggagccgct tgactcagag ctacaggaag agccggggca 2340

ggcggggtga gaaccaccaa ctgcccgtcc tcccgcccgc ctagggaagg ggtgggtgcc 2400

tgggtggggt ttagggttag gagaggatgt gactgcaagg ccaggaagct acagggaaag 2460

ttctgatcaa aatacacaaa gacacaagcc aggtccccac cgcgcttggc gatgcatcca 2520

tagcagcctt ggtgctgtgg acactccctg gggcccagcg aaggggagag tttgctccca 2580

aaggcgcacc aatgaccaac atttgccccc cggaggaaag aactggaacc aggtgactgc 2640

cttccccgct gctctgagtg agcctgtgtc agggcctggc tgagaggagg cccacggcgc 2700

ccaagaccca tatgcatgtg tgtgcatgtg tgtgtgagac agagcgaggg gcagcaggag 2760

gctgtgtcgc atcagcggcc aagggtgggt gtcaggtgca gtgtgtgtgc tgtggggtgc 2820

ctgtggtcct aggctctgtg acaagcgttg caatgggtgt tgtatatact caacagttgt 2880

gtgaggggtc tgcagcctaa gctgtgtgca gtggtaatgg gaggtgtgtg tggtaggaag 2940

tgtgctgtgt aggaggtgca agtgtgcaca cgggctgaga ctgaagctct gtgcaggtgc 3000

acatgggcca gagggctgtg tgtatgtgat gtgtgcaggg gaggaggggc agaggagagg 3060

gtgcagggga agttagggag gggagggggt acaaggaaag gtgtgcaggg gagagggtgc 3120

agggaaaggt ggggagggga gagggtgcag gggaaggtag gcagaggaga gggtgcaggg 3180

gagagggtgc aggggaaggt gtgcagggaa aggtggggag gggagagggt gcaggggaag 3240

gtaggcagag gagagggtgc aggggaaggt gtgcagggga gagggtgcag ggaaaggtgg 3300

ggaggggaga gggtgcaggg gaaggtaggc agaggagagg gtgcagggga aggtgtgcag 3360

ggaaaggtgg ggagggagag ggtgcagggg aaggtaggca gaggagagag tgcaggggaa 3420

ggtgtgcagg ggagagggtg cagggaaagg tggggagggg agagggtgca ggggaaggta 3480

ggcagacgag agtacaggga aaggtaggga ggagagaagg tgcaggagga ggcaggcaga 3540

agagagggtg caggggaagg tggggagggg agagggtgca gggggaggca ggcagaggag 3600

agggttcagg ggagagggtg caggggaagg tgggcagggg aaggtgggga gtggagagcg 3660

tgcaggggga ggcaggcaga ggagagggtg caggggaagg tgcgtagggg agagggagca 3720

ggggagaggg tgcgggaaga gggtgcaggg gagggtttgc agggagaggg tgcaggggag 3780

agggtgcaag gagaggcagg cagcggagag ggtgcagagg agggtttgca ggggagggca 3840

cctgctttct tgctgtgctc gtatcctggc agtctgccct tgacttccag aaggctctga 3900

ggctgctttt ggagggagga ctttgaggtc tgagcttggg gcggtcacgg aagcactgca 3960

ggagatgcca ggggttctgc tgggctggcg gtgtgacctc ccgggcttgc tgtgaggggt 4020

tggtttcctg ggaagtgtgt gctttaagga ccctcagtgg gtggttcccc tgggtcaagg 4080

actttccttg gagtgtcctc caccgcaaag gacttcttca aggaccccct ggccatcccc 4140

catgggtgtg tgcctcatgc tgtatcggtt cccgaggaaa ctgccaaaca gtcaaacctg 4200

gggcctctgg ctgtgcttca cccatggaga gggaataggt ggcaggctaa gaggactgtc 4260

cctgccactg cctctggggc cttagcgggg aggaatcctg agggagctgg ggtgcagaaa 4320

cttaggcttg atccccacat ccccacttcc actgtgtccc tgcagcaggg aggggagtag 4380

acagtcagtg cctgttggat aaacagggtg accctgtggc atccagtgag gagaggcccc 4440

tggggccctg ggctgccaag gaagaggctc tgggcttctc cctgcagcca cctcactgag 4500

gagctttggg agacttgagg tgtgtgtggc tgctgctacg ggctgggaaa ggacatggga 4560

cccgagacct ccatccccac cgggcgctgt tcaccctccg gcctcacaac cgcagggcga 4620

ggctaagctg agggttcccg aggtgtttcc cgaggtgttt cgaggtgtct gtgctcacgt 4680

gcactcctga ctgtaaccag acgtgggcca gagctgggca ccccccctcg actgcatcca 4740

gacatggtta gagctgggca cccccccccc ccgactgtat ccagacatgg tcagagctga 4800

gcacccctcc ccgactgtat ccagacatgt tcagagctgg gcaccccccc ccgactgtat 4860

ccagacatgt tcagagctgg gcaccccccc ccgactgtat ccagacatgg tcagagctgg 4920

gcaccccccc ccgactgtat ccagacatgg tcagagctgg gcaccccccg actgcatcca 4980

gacatggtca gagctgagca cccccccccg cccgactgta tccagacatg gtcagagctg 5040

ggcacccccc gactgcatcc agacatggtc agagctgggc acccccctcc ccgactgcat 5100

tcagacatgg tcagagctgg gcacccccgc cgactgcatc cagacatggt cagagttggg 5160

cacccccccc ccgactgtat ccagacatgg tcagagctgg gcaccccccg actgcatcca 5220

gacatggtca gagctgggca cccctccccg actgtatcca gacatggtca gagctgggca 5280

cccccccccg actgtatcca gacatggtca gagctgggca cctccccccg actgtatcca 5340

gacatggtca gagctgggca cctcccccga ctgcatccag acatggtcag agctgggcac 5400

cccccccgac tgcatccaga catggtcaga gctgggcacc cccccccccc actgtatcca 5460

gacatggtca gagctgggca cccccctccc cgactgcatc cagacatggt cagagctgag 5520

cacccccccc ccccgactgt atccagacat ggtcagagct gggcaccccc ctccccgact 5580

gtatccagac atggtcagag ctgagccccc cccccgcccg actgtatcca gacatggtca 5640

gagctgggca ccccccgact gcatccagac atggtcagag ctgagcaccc ctccccgact 5700

gcatccagac atggtcagag ctgggcaccc ccccccccca ccgactgtat ccagacatgg 5760

tcagagctgg gcaaccccca ccgactgtat ccagacatgg tcagagctgg gcaccccccg 5820

actgcatcca gacatggtca gagctgggca ccccccgccg actgtatcca gacatggtca 5880

gagctgggca cccccctccc cgactgcatc cagacatggt cagagctggg cacccccctc 5940

cccgactgca tccagacatg gtcagagctg ggcacccctc cccgactgta tccagacatg 6000

gtcagagctg ggcacccccc tccccgactg tatccagaca tggtcagagc tgggcacccc 6060

cgccgactgt atccagacat ggtcagagct gggcaccccc cgactgcatc cagacatggt 6120

cagagctggg cacccctccc cgactgtatc cagacatggt cagagctggg cacccccccc 6180

ccccgactgt atccagacat ggtcagagct gagcacccct ccccgactgt atccagacat 6240

gttcagagct gggcaccccc ccccccgact gtatccagac atggtcagag ctgggcaccc 6300

ccctccccga ctgcatccag acatggtcag agctgagcac cccccccgcc cgactgcatc 6360

cagacatggt cagagctggg caccccccga ctgcatccag acatggtcag agctgggcac 6420

ccccctcccc gactgcattc agacatggtc agagctgggc acccccctcc ccgactgcat 6480

ccagacatgg tcagagctgg gcacccccgc cgactgtatc cagacatggt cagagctggg 6540

cacccccctc cccgactgta tccagacatg gtcagagctg ggcacccccg ccgactgtat 6600

ccagacatgg tcagagctgg gcacccccct ccccgactgc atccagacat gttcagagct 6660

gggcaccccc ccccgactgt atccagacat ggtcagagct gggcaccccc cgactgcatc 6720

cagacatggt cagagctggg caaccccctc cctgactgca tccagacatg gtcagagctg 6780

ggcacccccc ccggctgtat ccagacatgg tcagagctgg gcaccccccc cccccgactg 6840

catccagaca tggtcagagc taagcaaagc cccccgccga ctgtatccag acatggtcag 6900

agctgggcac ccccacccca actgcatcca gacatggtca gagctgagca ccccccaccg 6960

actgtatcca gacatggtca gagctgggca tctcccatgg tgtaggttac atcactcaca 7020

cccctgcccc aaggccaggc tgtgtctctg gcactgcagc accccctgca gtggcagctc 7080

tgttgaaggg gacagccagg agtgaggcca actgccatgt cgggagacag ggtcccacct 7140

agtgttcgtc cactgcaccc tggggccgtc atggtggccc cagggccggt ggaggtgatc 7200

ctggacttga tggcccctcc ccgtggtcct gggctgcgtg aagtggtgcc cattctggcc 7260

acgtgtgagg ggctcaaaga gacaccctgc tggcctccga gaactctgcc agcatccatg 7320

cggctgctca gggtcgcatc tggtcagggc cagtgctgtc tgtggccggc agttactggt 7380

taactcatcc tgttcctgtt taacttgttc cctggggatg gcggcagcct ctgacctgtc 7440

caggtgccct gtccagctga ctgcaaggac agagaggagt cctgcccagc tcttggatca 7500

gtctgctggc cgaggagccc ggtggagcca ggggtgaccc tggagcccag cctgccccga 7560

ggaggccccg gctcagagcc atgccaggta ggcaggtcag agagggatgg gcttgaattc 7620

cccactccca cctcctgccc ctcaggctgg ctccacattg tgcatcctgc tcttatccca 7680

ggcactctgc ctggccacat gccgggggta caaaggcccc tgctcacccc tcccactggg 7740

cccttggccc tgaaaccagg gcgagtggtg aggatgagcc ctgcaccctc tcctgcccca 7800

gaccaggctc atgagggtca gtaaagccca ggaatgctag gagtgggcac tgctggggcc 7860

cacagcaggg tgtggccgat gtgagctggc aggagaccat accctactga gaagatggtg 7920

gtttgacctc ccgctagggc tcatcaccct gatgtaaaga tgaacaagtt caggcctcag 7980

gtggtgggga gggcttgcct gtggccagga gcagagggcc ccaagacccc caaggcagga 8040

atgaggccaa ctgctccagg ctcccagctg tgcccatcca ggtggaaggt gctggcacac 8100

tgggcatctg ggtccccaaa cccactggtg cccacactct ctgcagattc cccagcagag 8160

gcaggccagg ctgaggggtg cagtgcccgg cccctcctat gagacaggca tcatggtgtc 8220

accaggggtg ggcaacaggt gcatctggga aatggggggc tggactcaca tcctgggtgg 8280

acaagcagcc agatggggct tgagcgtggg cctggggcag ctcaactgtg gccactgctc 8340

tctgtcccct cagcacaggg tgggcggaac acccaaagcc tggccactac tggggaaaga 8400

cgtgccaagt gctaagcctg tccccatggg actcgtggac agacatggtg tgactgccaa 8460

gccacacaga ggccttattt cttcctgcac cacggaccac tgtggaggtg gtggggccag 8520

gcaccctggc acagctgacc cactgtgtcc tctctcttca ggtgtctgtg atagggcccc 8580

tgacttcctc tccccgtctg aagaccaggt gctgaggcct gccttgggca gctcagtggc 8640

tctgaactgc acggcttggg tagtctctgg gccccactgc tccctgcctt cagtccagtg 8700

gctgaaagac gggcttccat tgggaattgg gggccactac agcctccacg agtactcctg 8760

gtaagagacc cgggtatcca gggtcagagt gacctctcag acatgccaag ggcagtggtc 8820

tccctgacct atgcctgggt ctgtaaccac ctggccagac atgtcacgag cagagtgcct 8880

ctgtggaccc agacggaggg tcagtaatgt cagggacaga cccttgggtc tgcatggccc 8940

ctgtaggcac acacctcgta actgcccagg gctacgggtg tcagcaaagt ctagggtctg 9000

aatgaacacc gaccagctgg ccaagtctgt gatcaaagga cctccaggcc ccagacccag 9060

gactgggacg gctgttctga aacaaatctg catcccctcc aggttcaggt cacttctctt 9120

ggcttaaggc ccaagaacca cccaggaggc ccaattctgc agcctccctg ggtgaaccca 9180

gacaggtggg gttcgggggt gtccactggt atccccagtc gaccctgacc ctggcttggt 9240

atccccaggg tcaaggccaa cctgtcagag gtgcttgtgt ccagtgtcct gggggtcaac 9300

gtgaccagca ctgaagtcta tggggccttc acctgctcca tccagaacat cagcttctcc 9360

tccttcactc ttcagagagc tggtgatggg ggttccccaa ggtggagggt agaaggggac 9420

ctagacctag tgaggcccag ggatcttgag gcttgggggc tgctggaggg gcagcggctc 9480

aggcaaccca tccgcaggcc ctacaagcca cgtggctgcg gtgctggcct ccctcctggt 9540

cctgctggcc ctgctgctgg ccgccctgct ctatgtcaag tgccgtctca acgtgctgct 9600

ctggtaccag gacgcgtatg gggaggtgga gataaacggt gcgtggggcc cgcgtgggcg 9660

cgaggagggg tcgccacggc ctccctgaga gtgcgctgct gagctcggct ttggaggcgt 9720

gcggcgggga ggggttagcc cccgggtgct ctgtgcggcc cggctggggt taaagtccgg 9780

ggcgggtctg cccctgtgca cgtgggagat ggttaggggt gttggggacc ccgagggctg 9840

gtgtgaggcc tcgggagcca tcggggtgac tggccgccgt ccgcagacgg gaagctctac 9900

gacgcctacg tctcctacag cgactgcccc gaggaccgca agttcgtgaa cttcatccta 9960

aagccgcagc tggagcggcg tcggggctac aagctcttcc tggacgaccg cgacctcctg 10020

ccgcgcgctg gtatcccggg ccccaccccg tgccccgccc acccggaggg cccgccccgc 10080

cccgccccat gctccgtccc acccggggcc ccacccccac catcgagctc cgcccccatc 10140

cccgcccacc cgaggccccg cctcaaaaac ccgcccaccc cgcaggcccc gcccctccct 10200

tagagctctg cgtccggcac cgcccctgag cctccggccc cgccctcccc cgcccccgcc 10260

cctgcgccgc cgacgcccgc cctcccgcag agccctccgc cgacctcttg gtgaacctga 10320

gccgctgccg acgcctcatc gtggtgcttt cggacgcctt cctgagccgg gcctggtgca 10380

gccacagctt ccggtgggtc ccgcgcgggg ttgggtgggc cccagcgtag cacccacccc 10440

cctgacggtc ccgccccgca gggagggcct gtgccggctg ctggagctca cccgcagacc 10500

catcttcatc accttcgagg gccagaggcg cgaccccgcg cacccggcgc tccgcctgct 10560

gcgccagcac cgccacctgg tgaccttgct gctctggagg cccggctccg tggtgcggag 10620

caggcgcggg agggtccggg gctagcggcg ggttagagat gggcggtgcc cgggctccag 10680

gctgggaccc ctccgtgggg agctctgcgg caccacgctt tgtgaatggg ccctgggggg 10740

aggttccgct gcctggggcc ccgatgcggg gagccgccct tgaggccccc ggagccacgg 10800

aatagctgtc gcagggcgtg gaacccgtgg gcagccgcag gtgtgctctt gggggccagg 10860

acgccagggg cttccgaggt gttcacacct gcaaaccgcc ccgacctggc ccccagactc 10920

cttcctccga tttttggaaa gaagtgcagc tggcgctgcc gcggaaggtg cagtacaggc 10980

ctgtggaagg agacccccag acgcagctgc aggacgacaa ggaccccatg ctgattcttc 11040

gaggccgagt ccctgagggc cgggccctgg actcagaggt ggacccggac cctgagggcg 11100

acctgggtat gcccgcccag ccccactccc caactggaga agctcagcac agggcggagt 11160

gggggcaggc acagggcaca gggcctggag gggctccagg tgttgaggac tcttcccggc 11220

accgggagcc cctgcacggc ctctgccctg gaggtgctcg gccctcggtc tgcctgggaa 11280

cttcctgggc ctcacaggcc atcacagcag ggggtgagca ggggcagccc ctggcagtgg 11340

gtctgggcca aggctgtggg tggccacctc aggcgtctcg gtctccccac cccaggtgtc 11400

cgggggcctg tctttggaga gccatcagct ccaccgcaca ccagtggggt ctcgctggga 11460

gagagccgga gcagcgaagt ggacgtctcg gatctcggct cgcgaaacta cagtgcccgc 11520

acagacttct actgcctggt gtccaaggat gatatgtagc tcccacccca gagtgcagga 11580

tcatagggac agcgggggcc agggcagcgg cgtcgctcct ctgctcaaca ggaccacaac 11640

ccctgccagc agccctggga ccctgccagc agccctggga aaaggctgtg gcctcagggc 11700

gcctcccagt gccagaaaat aaagtccttt tggattctg 11739

<210> 2

<211> 11738

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Геномная последовательность вариантного SIGIRR(c.557delA)

<400> 2