Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/686 C12Q1/6876 

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, а именно к иммунодиагностике, в частности к проблеме оценки иммунного статуса новорожденных. Диагностику проводят с использованием ДНК, выделенной из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови).

Иммунный статус - это комплексный показатель состояния иммунной системы, это количественная и качественная характеристика состояния функциональной активности органов иммунной системы и некоторых неспецифических механизмов противомикробной защиты.

Иммунодефицитные состояния характеризуются полным или частичным отсутствием Т- или В-клеток, а также натуральных киллеров или ослаблением функций этих клеток. В качестве суррогатных маркеров созревания Т- и В-клеток и функциональной активности соответствующих звеньев иммунной системы может служить содержание в периферической крови, соответственно, Т-рецепторных эксцизионных колец (T-cell receptor excision circles - TREC) и В-клеточных эксцизионных колец (kappa-deleting recombination excision circles - KREC), формирующихся в процессе V(D)J-реаранжировки.

Полное или частичное отсутствие (снижение уровня) Т- и/или В-клеток у новорожденных определяется при первичных иммунодефицитах, трисомиях 21 и 18 хромосом, различных цитогенетических мутациях, а также при недоношенности младенцев, в том числе при плановом кесаревом сечении (КС).

Первичные иммунодефициты (ПИД) представляют собой группу генетически детерминированных заболеваний, обусловленных нарушением одного или нескольких механизмов иммунной защиты. При этом возможны структурное или функциональное нарушение Т- и В-клеток адаптивного иммунитета, а также нарушение развития гуморального и клеточного компонентов системы врожденного иммунитета. На сегодняшний день известно более 250 форм генетически подтвержденных ПИД, среди которых выделяют заболевания с дефицитом Т-клеток, дефицитом В-клеток (преобладающая группа), комбинированным дефицитом Т- и В-клеток. Клиническая тяжесть колеблется от легкой до потенциально опасной для жизни. Учитывая, что симптомы ПИД обычно не являются специфичными, значимой проблемой данной группы заболеваний остается гиподиагностика - большинство пациентов с ПИД скрыты под маской других диагнозов (достаточно упомянуть проблему часто и длительно болеющих детей). Данное обстоятельство приводит к несвоевременному и неадекватному лечению, а у пациентов с тяжелыми формами ПИД к 100% летальности. К таким заболеваниям относится, например, Х-сцепленная агаммаглобулинемия (ХГБ). Снижение Т- и/или В-клеток показано для синдрома ДиДжорджи (делеция 22q11.2), телеангиэктазии атаксии, синдрома Неймегена, синдрома CHARGE. Тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИН), представляющий собой редкую группу первичных нарушений иммунодефицита с известными или неизвестными генетическими изменениями. Дети с ТКИН обычно выглядят здоровыми при рождении, но в конечном итоге у них развиваются тяжелые, угрожающие жизни инфекции со 100%-ной смертностью, преимущественно в течение первого года жизни. Ранняя диагностика и лечение ТКИН с помощью трансплантации гемопоэтических стволовых клеток имеет важное значение для предотвращения смерти и восстановления нормальной функциональной иммунной системы. Если лечение проводится в течение первых 3,5 месяцев жизни, до развития угрожающих жизни инфекций, для детей с ТКИН показана более 95% выживаемость. Напротив, у детей с ТКИН, которые получали лечение после 3,5 месяцев, выживаемость падает до 60-70%, что свидетельствует о важности ранней диагностики и лечения. По оценкам, до 50% младенцев умирают из-за того, что им не был поставлен достаточно ранний диагноз для применения жизненно важных методов лечения.

Врожденные аномалии, включая пороки сердца, желудочно-кишечные пороки развития, множественные врожденные пороки развития, а также преждевременные роды могут быть связаны с вторичной лимфопенией младенцев.

Отдельный интерес представляет снижение иммунного статуса, связанное с преждевременными родами. Недоношенные дети имеют функциональную недостаточность иммунной системы. Незрелость врожденной иммунной системы и высокая потребность в инвазивных медицинских процедурах в контексте преждевременных родов делают этих детей очень восприимчивыми к распространенным патогенам новорожденных [Sharma А.А., Jen R., Butler A., Lavoie P.M. The developing human preterm neonatal immune system: a case for more research in this area. Clin Immunol. 2012 Oct; 145(1):61-8. doi: 10.1016/j.clim.2012.08.006.].

Известно, что родоразрешение посредством КС связано с повышенным риском возникновения иммунных нарушений в более позднем возрасте, таких как аллергия, бронхиальная астма, диабет 1 типа, целиакия, злокачественные новообразования, иммунодефицитные состояния [Sevelsted A., Stokholm J., Bisgaard Н. Cesarean section and chronic immune disorders. Pediatrics. 2015; 135(1):e92-8. doi: 10.1542/peds.2014-0596.]. К вероятным причинам развития этих заболеваний могут относиться несвоевременная и пониженная активация иммунной системы новорожденного, в том числе за счет более короткого гестационного возраста при КС по сравнению с естественными родами [Cho С.Е., Norman М. Cesarean section and development of the immune system in the offspring. Am J Obstet Gynecol. 2013;208(4):249-54. doi: 10.1016/j.ajog.2012.08.009.], чтоприводит уменьшению пула долгоживущих лимфоцитов и, в свою очередь, может иметь клинические последствия на более поздней стадии, особенно когда растущий индивид подвергается воздействию инфекционных агентов и антигенов. В связи с вышесказанным обращает на себя внимание, что, хотя клинически обоснованная частота КС не превышает 20%, мировой показатель КС увеличился в четыре раза менее чем за два десятилетия, что делает его наиболее распространенной хирургической процедурой, выполняемой у женщин детородного возраста без медицинских показаний [Schlinzig Т., Johansson S., Stephansson О., Hammarstrom L., Cnattingius S., Norman M. Surge of immune cell formation at birth differs by mode of delivery and infant characteristics-A population-based cohort study. PLoS One. 2017;12(9):e0184748. doi: 10.1371/journal.pone.0184748.].

Современная стратегия развития скрининга новорожденных связана с максимально ранним, в идеале сразу после рождения, выявлением иммунодефицитов, связанных с нарушением пролиферации Т- и В-клеток. В случае генетически обусловленных заболеваний, таких как ПИД, отсутствие функциональных Т- и/или В-лимфоцитов служит диагностическим критерием, в случае преждевременных родов и КС оценка содержания Т-и/или В-лимфоцитов может служить прогностическим маркером, и в том, и в другом случае выявление и оценка уровня TREC и KREC может применяться для скрининга новорожденных. Таким образом, этот анализ дает ценную диагностическую и прогностическую информацию в отношении широкого спектра заболеваний, связанных с нарушением Т- и/или В-клеточного звена иммунитета, что позволяет выявлять пациентов для углубленного обследования и своевременного назначения адекватной терапии.

Известен метод оценки количества TREC с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), использовавшийся для выявления недавно вышедших из тимуса клеток у ВИЧ-инфицированных лиц, а также для диагностики иммунодефицитов [Douek DC, McFarland RD, Keiser PH, Gage EA, Massey JM, Haynes BF, Polis MA, Haase AT, Feinberg MB, Sullivan JL, Jamieson BD, Zack JA, Picker LJ, Koup RA. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 1998; 396(6712):690-695; Amariglio N, Lev A, Simon A, Rosenthal E, Spirer Z, et al. Molecular assessment of thymus capabilities in the evaluation of T-cell immunodeficiency. Pediatr Res. 2010. 67(2): 211-216.]. Количественный анализ TREC применяли для диагностики новорожденных с ПИД при использовании выделения ДНК из сухих пятен крови [Douek DC, Vescio RA, Betts MR, Brenchley JM, Hill BJ, Zhang L, Berenson JR, Collins RH, Koup RA. Assessment of thymic output in adults after haematopoietic stem-cell transplantation and prediction of T-cell reconstitution. Lancet. 2000; 355(9218):1875-81.; Baker MW, Grossman WJ, Laessig RH, Hoffman GL, Brokopp CD, Kurtycz DF, Cogley MF, Litsheim TJ, Katcher ML, Routes JM. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol. 2009; 124(3):522-7]. Однако, методы, анализирующие состояние иммунной системы только по TREC, очевидно ограничены, так как учитывают только Т-клетки, но не В-клетки.

Известен метод использования количественного анализа TREC и BREC для определения репликативной истории субпопуляции Т-клеток или В-клеток [van Dongen J.J.M. Replicative history of T-and B-cell subsets. EP 1849877 Al. Application number: 06075943.8 31.10.2007. Bulletin 2007/44. Printed by Jouve, 75001 PARIS (FR). Date of filing: 24.04.2006], способ ограничен моноплексным осуществлением анализа, за счет чего снижена точность и сопоставимость получаемых результатов анализа.

Известен метод дуплексного количественного анализа TREC и KREC для оценки количества наивных Т-лимфоцитов и наивных В-лимфоцитов [Borte S., Fasth A., Wang N., Janzi M., Winiarski J., Sack U., Pan-Hammarstrom Q., Borte M., Hammarstrom L. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 2012 Mar 15;119(11):2552-5. doi: 10.1182/blood-2011-08-371021], но предложенный метод ограничен низкими уровнями отсечения, а также применением исключительно с использованием конкретных аналитических приборов ABI 7500 и ViiA7 (Applied Biosystems).

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению и выбранным за прототип является метод, предложенный в работе российских иммунологов: Гордукова М. А., Продеус А.П., Филипенко М. Л., Корсунский И. А. Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки днк молекул tree, krec и количества геном эквивалентов днк. (Пат. №2587540, 20.06.2016, Бюл. №17. Заявка: 2015132823/15, 06.08.2015). Согласно методу, выделяют ДНК из анализируемого образца крови. Затем производят одновременную амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA с использованием набора праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC, IL17RA, регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции и определяют в режиме реального времени абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых не менее чем в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций. По результатам оценки их количества производят диагностику состояния иммунной системы пациента. Недостатком способа является использование одного нормировочного гена для нормирования данных. Недостатком способа нормирования данных с использованием одного эталонного гена является вариабельность результатов анализа, так как не существует идеального нормировочного гена, постоянного в независимости от ткани и состояния клеток в анализируемом образце. В связи с этим выбор эталонного гена является одним из самых ответственных этапов при проведении анализа. Наиболее оптимальным можно считать подход, при котором анализируется одновременно несколько эталонных генов. В то же время, согласно Висконсинскому протоколу, идентификация образцов с низким уровнем или отсутствующими TREC основана на оценке качества образца путем демонстрации амплифицируемости эталонного гена с помощью анализа, который проводится в отдельной реакции от анализа TREC [Baker M.W., Grossman W.J., Laessig R.H., Hoffman G.L., Brokopp CD., Kurtycz D.F., Cogley M.F., Litsheim T.J., Katcher M.L., Routes J.M. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol. 2009 Sep;124(3):522-7. doi: 10.1016/j.jaci.2009.04.007.].

Авторами предложен способ, согласно которому выделенную из крови или из капли сухой крови ДНК анализируют в два этапа.

На первом этапе выделенную ДНК используют для одновременной амплификации в одной емкости участков молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов GAPDH и HPRT. Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», анализ TREC и KREC проводят с нормализацией на эталонные гены, «нормировочный коэффициент» при этом вычисляется как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов. Абсолютное количество целевых молекул TREC, KREC и нормировочных генов в анализируемых образцах определяют с использованием калибровочных кривых, построенных при амплификации серии последовательных разведений стандартных образцов ДНК с известными концентрациями искомых продуктов (TREC, KREC) и эталонных генов (GAPDH, HPRT) или известным количеством клеток, по результатам определения TREC и KREC делают выводы о нормальном состояния иммунитета новорожденных и предварительные выводы об отсутствии и/или снижении количества TREC и/или KREC.

Для выявленных образцов с отсутствием или снижением уровня целевых молекул осуществляют подтверждение или опровержение полученного результата. Для этого проводят две мультиплексных постановки из одной навески экстрагированной ДНК: в одной (целевой) емкости проводят амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и одного эталонного нормировочного гена GAPDH, во второй (нормировочной) емкости проводят амплификацию участков молекул ДНК трех эталонных генов - GAPDH, HPRT и RPP30. При анализе результатов производят корреляционный пересчет данных, полученных для мультиплексной постановки эталонных генов, на данные, полученные для эталонного гена в целевой емкости, вводится «нормировочный коэффициент», вычисляемый как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов. Далее проводят расчет данных, полученных для молекул ДНК TREC, KREC.

Технический результат - повышение чувствительности и достоверности диагностики, снижение ложноположительных (отсутствие и/или низкие уровни молекул ДНК TREC, KREC) результатов, а значит и расширение возможностей метода.

На первом этапе проводится ПЦР в одной емкости с использованием следующих олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов:

На втором этапе проводится ПЦР в целевой емкости с использованием следующих олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов:

И ПЦР в нормировочной емкости с использованием следующих олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов:

Состав амплификационной смеси включает: по 8 пмоль/л прямого и обратного праймеров всех генов, по 3 пмоль/л меченных олигонуклеотидов всех генов, по 1 ммоль/л всех dNTP, 6-7,5 ммоль/л MgCl₂, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы или Hot-start Taq ДНК-полимеразы, буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)₂SO4, 0,1% (v/v) твин 20), 1,3 мкл 1% BSA, DMSO до 8% от конечного объема, 50 нг ДНК, вода без нуклеаз до конечного объема 50 мкл.

ПЦР проводят при следующих условиях: после денатурации при 95°С в течение 5 минут (15 минут при использовании Hot-start) устанавливали 5 циклов амплификации в режиме: 95°С - 20 сек, 60°С - 20 сек., 72°С - 40 сек., затем 40 циклов амплификации в режиме: 95°С - 15 сек; 55°С - 20 сек (осуществляется регистрация флуоресценции); 72°С - 30 сек.

Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по четырем каналам:

- по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК KREC в целевой емкости, о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК RPP30 в нормировочной емкости;

- по каналу для флуорофора R6G регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК TREC;

- по каналу для флуорофора ROX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК GAPDH;

- по каналу для флуорофора Су5 регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК HPRTR.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (устанавливается в середине линейного участка прироста флуоресценции положительного контроля в логарифмической шкале), что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат амплификации по каналу считается положительным, если кривая однократно пересекается с пороговой линией в области достоверного прироста флуоресценции, отрицательным в случае отсутствия пересечения кривой с пороговой линией (нет значения Ct), сомнительным во всех других случаях.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1-фиг. 5 представлены кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продукта реакции при анализе поэтапно разведенных образцов. А также чертежами, где на фиг. 6 представлен случай с выявлением низких уровней KREC при использовании первого варианта постановки и на фиг. 7 их выявление в достаточном количестве при использовании второго варианта постановки. А также чертежами, где на фиг. 8 представлен случай с выявлением низких уровней TREC при использовании первого варианта постановки и на фиг. 9 их выявление в достаточном количестве при использовании второго варианта постановки.

Таким образом, предложенный метод отличается от прототипа последовательностями олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зондов, использованием двух этапов анализа при выявлении низких уровней целевых молекул или их отсутствии, использованием двух эталонных генов для нормализации при мультиплексной амплификации в одной емкости и трех эталонных генов для нормализации при мультиплексной амплификации в двух (целевой и нормировочной) емкостях при анализе на втором этапе в случаях выявления низких уровней целевых молекул или их отсутствии на первом этапе анализа.

Ниже приведены примеры конкретного использования предложенного метода, являющиеся одним из возможных способов его реализации.

Пример 1.

Новорожденные: образцы пуповинной крови 157 детей. Для всей группы количество TREC в пуповинной крови детей находилось в диапазоне от 10762 до 121068 копий/105 лимфоцитов. Среднее значение TREC составило 29945±1412 копий/105 лимфоцитов. Концентрация KREC составила от 10550 до 89533 копий/10⁵ лимфоцитов, среднее 36199±1347 копий/10⁵ лимфоцитов.

Пример 2.

Проанализирована кровь 5 пациентов с диагнозом Х-сцепленная агаммаглобулинемия. Диагноз поставлен на основании клинических и лабораторных данных, а также результатов генетического исследования BTK-гена, выполненного в лаборатории молекулярной иммунологии НИИЭМ имени Пастера. Среди пациентов отмечается выраженное снижение KREC (норма 1,0* 10³-1,0* 10⁵ копий/мл) при содержании TREC в пределах нормальных значений (4* 10³-7* 10⁴ копий/мл).

Пример 3.

Обследованы ВИЧ-инфицированные лица в возрасте от 24 до 49 лет. Среднее количество TREC у ВИЧ-инфицированных с низкой вирусной нагрузкой составило 2539±510,5 копий/10⁵ лимфоцитов, KREC 6048±1629 KREC/10⁵ лимфоцитов. У больных с высокой вирусной нагрузкой среднее количество TREC составило 486,8±235,1 копий/10⁵ лимфоцитов, KREC 5125±2238 копий/10⁵ лимфоцитов. Не выявлено достоверных различий ни по концентрации TREC, ни по концентрации KREC между ВИЧ-инфицированными с низкой вирусной нагрузкой и условно здоровыми донорами. Количество TREC у здоровых доноров в 7,6 раз выше, чем у ВИЧ-инфицированных с высокой вирусной нагрузкой (р=0,0001). Между группой больных с низкой вирусной нагрузкой и с высокой вирусной нагрузкой показаны достоверные различия по концентрации TREC (р=0,025).

Пример 4.

Также в течение 2017-2019 гг. проведено более 280 исследований пациентов различных возрастных групп предложенным методом. Определены возрастные нормы содержания молекул TREC и KREC в периферической крови среди жителей Санкт-Петербурга и Ленинградской области.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-

исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и

благополучия человека», ул. Мира, 14, Санкт-Петербург, 197101,

Российская Федерация

<120> СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОЙ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ИММУНИТЕТА

НОВОРОЖДЕННЫХ И НАБОР ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО

МЕЧЕННЫХ ЗОНДОВ

<140> Текущая (данная) заявка регистрационный №2019142752/20(083228)

<141> 17.12.2019 г.

<160> 15

<210> 1

<211> 20

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Прямой праймер ПЦР

<400> 1

ccatgctgac acctctggtt 20

<210> 2

<211> 21

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Обратный праймер ПЦР

<400> 2

tcgtgagaac ggtgaatgaa g 21

<210> 3

<211> 23

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор

R6G, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель RTQ1

<400> 3

cacggtgatg cataggcacc tgc 23

<210> 4

<211> 27

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Прямой праймер ПЦР

<400> 4

tcccttagtg gcattatttg tatcact 27

<210> 5

<211> 24

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Обратный праймер ПЦР

<400> 5

aggagccagc tcttacccta gagt 24

<210> 6

<211> 21

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор

FAM, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель BHQ1/RTQ1

<400> 6

tctgcacggg cagcaggttg g 21

<210> 7

<211> 20

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Прямой праймер ПЦР

<400> 7

atcttccagg agtgagcgag 20

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Обратный праймер ПЦР

<400> 8

gactccacga cgtactcagc 20

<210> 9

<211> 22

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор

ROX, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель BHQ2/RTQ2

<400> 9

tccaaaatca agtggggcga tg 22

<210> 10

<211> 22

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Прямой праймер ПЦР

<400> 10

cttgctcgag atgtgatgaa gg 22

<210> 11

<211> 25

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Обратный праймер ПЦР

<400> 11

cagcaggtca gcaaagaatt tatag 25

<210> 12

<211> 30

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор

Cy5, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель RTQ2

<400> 12

atcacattgt agccctctgt gtgctcaagg 30

<210> 13

<211> 16

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Прямой праймер ПЦР

<400> 13

tttggacctg cgagcg 16

<210> 14

<211> 20

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Обратный праймер ПЦР

<400> 14

gagcggctgt ctccacaagt 20

<210> 15

<211> 23

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор

FAM, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель RTQ1

<400> 15

ttctgacctg aaggctctgc gcg 23

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, а именно к иммунодиагностике, в частности к проблеме оценки иммунного статуса новорожденных. Диагностику проводят с использованием ДНК, выделенной из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови). Диагностику проводят в два этапа с использованием олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченных зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов. Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», анализ TREC и KREC проводят с нормализацией на эталонные гены, абсолютное количество целевых молекул TREC, KREC и нормировочных генов в анализируемых образцах определяют с использованием калибровочных кривых, построенных при амплификации серии последовательных разведений стандартных образцов ДНК с известными концентрациями искомых продуктов (TREC, KREC) и эталонных генов (GAPDH, HPRT, RPP30) или известным количеством клеток, по результатам определения TREC и KREC делают выводы о состояния иммунитета новорожденных. На первом этапе выделенную ДНК используют для одновременной амплификации в одной емкости участков молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов GAPDH и HPRT. «Нормировочный коэффициент» при этом вычисляется как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов. При обнаружении по результатам проведения первого этапа отсутствия или низкого уровня целевых молекул ДНК TREC, KREC для выявленных образцов проводят второй этап, включающий две мультиплексных постановки из одной навески экстрагированной ДНК: в одной (целевой) емкости проводят амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и одного эталонного нормировочного гена GAPDH, во второй (нормировочной) емкости проводят амплификацию участков молекул ДНК трех эталонных генов - GAPDH, HPRT и RPP30. При анализе результатов производится корреляционный пересчет данных, полученных для мультиплексной постановки эталонных генов, на данные, полученные для эталонного гена в целевой емкости, после чего вводится «нормировочный коэффициент», вычисляемый как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов. Далее производится расчет данных, полученных для молекул ДНК TREC, KREC. Обеспечивается повышение чувствительности и достоверности диагностики, снижение ложноположительных (отсутствие и/или низкие уровни молекул ДНК TREC, KREC) результатов. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 пр.

1. Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных на основе определения количества Т- и В-клеток, для осуществления которого экстрагируют ДНК из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови), после чего в два этапа проводят полимеразную цепную реакцию для целевых молекул ДНК TREC, KREC и эталонных нормировочных генов с использованием набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченных зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов, а именно: TRECF1-ccatgctgacacctctggtt, TRECR1-tcgtgagaacggtgaatgaag, TREC-zond1-R6G-cacggtgatgcataggcacctgc-RTQ, KRECF1-tcccttagtggcattatttgtatcact, KRECR1-aggagccagctcttaccctagagt, KREC-zond1-FAM-tctgcacgggcagcaggttgg-RTQ1, GAPDH-FP-atcttccaggagtgagcgag, GAPDH-RP-gactccacgacgtactcagc, GAPDH-zond-ROX-tccaaaatcaagtggggcgatg-RTQ2, HPRTF-cttgctcgagatgtgatgaagg, HPRTR-cagcaggtcagcaaagaatttatag, HPRT-zond-Cy5-atcacattgtagccctctgtgtgctcaagg-RTQ2, RPP3 OF-tttggacctgcgagcg, RPP3 OR-gagcggctgtctccacaagt, RPP30-zond-FAM-ttctgacctgaaggctctgcgcg-RTQ1, при этом анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», анализ TREC и KREC проводят с нормализацией на эталонные гены, абсолютное количество целевых молекул TREC, KREC и нормировочных генов в анализируемых образцах определяют с использованием калибровочных кривых, построенных при амплификации серии последовательных разведений стандартных образцов ДНК с известными концентрациями искомых продуктов TREC, KREC и эталонных генов GAPDH, HPRT, RPP30 или известным количеством клеток, по результатам определения количества TREC и KREC в анализируемом образце проводят сравнение с нормальными уровнями TREC и KREC, показанными для расы, к которой принадлежит пациент, на основании чего делают выводы о состояния иммунитета новорожденных, то есть о нормальном иммунитете, если выявленные уровни TREC и KREC соответствуют норме, или о снижении иммунитета, если уровни TREC и/или KREC ниже нормы.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что диагностику осуществляют в два этапа, на первом из которых проводят одновременную амплификацию в одной емкости участков молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов, тем самым выявляя среди анализируемых образцов образцы с отсутствием или низким уровнем целевых молекул TREC и KREC, а на втором этапе для выявленных образцов осуществляют подтверждение или опровержение полученного результата, проводя из одной навески экстрагированной ДНК амплификацию в двух мультиплексных постановках: в одной (целевой) емкости проводится амплификация участков молекул ДНК TREC, KREC и одного эталонного нормировочного гена, в другой (нормировочной) емкости проводится амплификация участков молекул ДНК трех эталонных генов, один из которых тот же, что в целевой емкости.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на первом этапе в качестве эталонных нормировочных генов в единой емкости используют гены GAPDH и HPRT, на втором этапе в качестве эталонных нормировочных генов в целевой емкости используют ген GAPDH, а в нормировочной емкости используют гены GAPDH, HPRT и RPP30.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для нормализации целевого продукта на эталонный ген при наличии нескольких эталонных нормировочных генов на первом этапе вводят «нормировочный коэффициент», который вычисляют как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов, а на втором этапе при анализе результатов производят корреляционный пересчет данных, полученных для мультиплексной постановки эталонных генов в нормировочной емкости, на данные, полученные для эталонного гена в целевой емкости, после чего вводят «нормировочный коэффициент», вычисляемый как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов, а затем производят расчет данных, полученных для молекул ДНК TREC, KREC.

5. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов для проведения амплификации целевых молекул ДНК TREC, KREC и эталонных нормировочных генов GAPDH, HPRT и RPP30: TRECF1-ccatgctgacacctctggtt, TRECR1-tcgtgagaacggtgaatgaag, TREC-zond1-R6G-cacggtgatgcataggcacctgc-RTQ1, KRECF1-tcccttagtggcattatttgtatcact, KRECR1-aggagccagctcttaccctagagt, KREC-zond1-FAM-tctgcacgggcagcaggttgg-RTQ1, GAPDH-FP-atcttccaggagtgagcgag, GAPDH-RP-gactccacgacgtactcagc, GAPDH-zond-ROX-tccaaaatcaagtggggcgatg-RTQ2, HPRTF-cttgctcgagatgtgatgaagg, HPRTR-cagcaggtcagcaaagaatttatag, HPRT-zond-Cy5-atcacattgtagccctctgtgtgctcaagg-RTQ2, RPP3OF-tttggacctgcgagcg, RPP30R-gagcggctgtctccacaagt, RPP30-zond-FAM-ttctgacctgaaggctctgcgcg-RTQ1.