Способ микроклонального размножения картофеля в культуре in vitro Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, биотехнологии и семеноводству картофеля на этапе ускоренного размножения оздоровленного исходного материала в культуре in vitro.

Являясь вегетативно размножаемой культурой, восприимчивой к значительному числу вирусных болезней, картофель требует специальных условий для репродуцирования в процессе семеноводства. Для получения качественного посадочного материала в селекционно-семеноводческих программах используют микроклональное размножение. Работу выполняют в стерильных условиях на агаризованных питательных средах или без соблюдения асептики на жидких средах с минеральными элементами питания. Первый способ более предпочтителен, т.к. позволяет обеспечить растения комплексом органических и неорганических минеральных веществ. Размножение и культивирование картофеля in vitro проводят на среде с макро- и микроэлементами по прописи Мурасиге-Скуга и витаминами по Уайту. Известен способ микроклонального размножения, в котором к уже указанным компонентам добавляют 7000 мг/л агара, 1-1,2 мг/л тиамина, 2,1-4 мг/л аскорбиновой кислоты, 374-390 мг/л хелата железа, 81000-85000 мг/л сахарозы, 1-1,5 мг/л аденина, 1-2 мг/л кинетина, 0,5-1,5 мг/л индолилуксусной кислоты [патент RU №2637361 (13) С1, МПК А01Н 4/00 (2006.01), 04.12.2017 (аналог)]. К недостаткам указанного способа относятся: узкая генетическая специализация (разработан для сорта Алена), содержание витаминов и гормонов варьирует в несколько раз, высокое содержание сахарозы, приводящее к нарушению роста растений других генотипов (образование на микрочеренках микроклубней вместо побегов).

Наиболее близким к предлагаемому способу является культивирование на среде Мурасиге-Скуга в модификации ФГБНУ ФИЦ картофеля имени А. Г. Лорха [Анисимов Б. В. Новые технологии производства оздоровленного исходного материала в элитном семеноводстве картофеля: рекомендации //Б. В. Анисимов. - М.: ГУП «Агропресс», 2000. - 80 с. (прототип)]. Среди недостатков указанной технологии можно обозначить содержание фитогормонов, приводящее к формированию значительного объема каллусной ткани в базальной части черенка, высокая себестоимость приготовляемой среды.

Технической задачей заявляемого изобретения является ускорение и удешевление размножения оздоровленного исходного материала картофеля в культуре in vitro.

Технический результат - состав компонентов культуральной среды, обеспечивающей сокращение времени регенерации микрорастений, повышение коэффициента размножения, снижение себестоимости.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе клонального микроразмножения, стерилизации питательной среды и культивирования микрорастений черенкование и регенерация эксплантов осуществляется на среде Мурасиге и Скуга с уменьшенной вдвое концентрацией макро- и микроэлементов, содержанием сахарозы 15000 мг/л, 6500 мг/л агара, 0,02 мг/л кинетина, 0,5 мг/л индолилмасляной кислоты.

Опыты проводились в лаборатории селекции Центра селекции и семеноводства при ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ на 6 генотипах картофеля различного географического происхождения.

Способ культивирования микрорастений характеризуется тем, что источниками эксплантов для размножения служат линии из апикальных меристем или ростков из банка оздоровленных образцов. После клонирования в асептических условиях черенки, представляющие собой фрагмент стебля с одной почкой, высаживаются на стерильную агаризованную питательную среду (табл. 1).

Для культивирования микрочеренков используются пробирки биологические ПБ-16, которые закрываются ватными пробками. В пробирки разливается по 6 мл среды, и помещают в коробки стерилизационные КСКФ-18 для автоклавирования. Время стерилизационной выдержки 18 минут при температуре 120°С и давлении в камере 0,11 МПа. После клонирования пробирки с черенками размещают в фитотроне, где поддерживают температуру 22±2°С, относительную влажность воздуха 55-70%, освещении 5000 лк на протяжении 14 часов.

В процессе микроклонального размножения имеют значение скорость регенерации из микрочеренка нового растения, пригодного для следующего цикла, размер и количество междоузлий, определяющих коэффициент размножения. В ходе лабораторного эксперимента выращивали сорта картофеля Метеор, Гала, Гулливер, Розара, Ред Скарлетт, Фелокс. В таблице 2 показано время от высадки микрочеренков до формирования растений, пригодных для дальнейшего клонирования (доросших до ватной пробки).

Представленные данные свидетельствуют об отсутствии ингибирующего влияния предлагаемого состава на скорость роста микрочеренков. У четырех сортов установлено усиление ростовых процессов, причем у двух из них (Розара, Гала) срок культивирования сократился на 7 дней. Пример внешнего вида микрорастений, культивируемых на среде предлагаемого состава в сравнении с прототипом представлен на фиг. 1.

Установлено положительное влияние предлагаемого состава на количество междоузлий у микрорастений (табл. 3).

Размер междоузлий имеет значение в процессе клонирования. Слишком короткие или длинные междоузлия замедляют работу, что сказывается на производительности. Культивирование микрорастений на предлагаемой среде приводит к статистически значимому (р<0,000) увеличению длины междоузлий (табл. 4).

Приведенные данные показывают, что предлагаемый способ культивирования микрорастений картофеля позволяет сократить время между клонированиями на 3 дня, способствует увеличению количества и длины микрочеренков на 23 и 44,7 процентных пункта соответственно.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению стандартных микрорастений картофеля. Представляет собой культивирование микрочеренков картофеля на питательной среде с подобранным составом: макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге и Скуг уменьшают в два раза, вводят агар-агар 6500 мг/л, кинетин 0,02 мг/л, ИУК 0,5 мг/л, сахарозу 15000 мг/л, пиридоксин 1 мг/л, тиамин 0,2 мг/л, аскорбиновую кислоту 0,2 мг/л, гидролизат казеина 40 мг/л. Изобретение позволяет сократить время регенерации микрорастений, повысить коэффициент размножения. 1 ил., 4 табл.

Способ получения стандартных микрорастений картофеля основан на использовании полусинтетической композиции для микроклонального размножения в культуре in vitro, отличающийся от прописи по Мурасиге и Скуг уменьшенным вдвое количеством макро- и микроэлементов, содержанием агар-агара 6,5 г/л, кинетина 0,02 мг/л, ИУК 0,5 мг/л, сахарозы 15 г/л.