СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЦЕРВИКАЛЬНЫХ ДИСПЛАЗИЙ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии и диагностической медицины и может быть использовано для дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий.

Рак шейки матки (РШМ) занимает одну из лидирующих позиций в структуре онкологической заболеваемости среди женщин [1]. Особенностью этого заболевания является хорошо изученная стадийность его развития. Она обеспечивает возможность своевременной диагностики и лечения так называемых предраковых изменений цервикального эпителия, или дисплазий.

Диагностика цервикальных дисплазий начинается с гинекологического обследования. Кольпоскопия - осмотр и ревизия состояния слизистой оболочки шейки матки, влагалища и вульвы при увеличении микроскопа в 7-30 раз и применении диагностических тестов (реакция эпителия на воздействие 3% уксусной кислоты, раствора Люголя и др.). С помощью кольпоскопии можно обнаружить изменения цервикального эпителия, но трудно определить их характер, особенно на начальных этапах развития РШМ. Решающее значение имеют результаты исследований состояния образца клеток цервикального эпителия врачом клинической диагностики - цитологом. Для проведения такого исследования врач - гинеколог должен получить материал, который проходит подготовку (фиксация, окрашивание клеток) либо с участием лаборанта (традиционная цитология), либо с помощью автоматизированных запатентованных технологий (жидкостная цитология), готовый препарат исследуется цитологом путем стандартной микроскопии. Качество цитологического исследования определяется квалификацией всех специалистов, участвующих в процессе, поэтому «человеческий фактор» существенно влияет на диагностическую ценность этого метода.

К дополнительным методам, широко вошедшим в клиническую практику, относится детекция генетического материала вируса папилломы человека (ВПЧ) в материале цервикального мазка. При этом клиническое значение имеет не только факт инфицирования, но и серотип и онкогенный потенциал вируса, активность инфекционного процесса («вирусная нагрузка»), длительность персистенции вирусной инфекции.

Инфекция ВПЧ является лишь одним из этиологических факторов развития РШМ, но не диагностическим критерием заболевания, что накладывает принципиальные ограничения на диагностический потенциал этого метода.

Объективные ограничения перечисленных методов определяют необходимость разработки новых подходов. В частности, идентификация молекулярных маркеров злокачественной трансформации клеток цервикального эпителия и разработка надежных технологий анализа таких маркеров позволили бы создать новые, объективные и экономичные, методы ранней диагностики цервикальных дисплазий и РШМ.

МикроРНК (миРНК) - это короткие (20-24 нуклеотида) молекулы РНК, которые участвуют в процессе пост-транскрипционной регуляции работы генов. В клетках человека описано несколько тысяч различных микроРНК, функциональная активность которых обеспечивают контроль трансляции клеточного генома. Для клеток каждой ткани характерен определенный набор (профиль) молекул микроРНК, который формируется тремя-четырьмя сотнями «мажорных» молекул. Злокачественная трансформация сопровождается характерными изменениями этого профиля. Анализ таких изменений в клетках эпителия цервикального канала имеет диагностический потенциал, как показано сотнями научных публикаций [2-4], включая публикации авторов заявки [5-7]. Но для создания новой диагностической технологии необходимо определить молекулы микроРНК, экспрессионные изменения которых достоверно связаны с процессом неопластической трансформации, и разработать метод анализа таких изменений и способ клинической интерпретации результатов.

Известен способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий, основанный на исследовании материала цитологического мазка с выделением РНК, анализом двух молекул микроРНК (miR-126, miR-375) с помощью метода обратной транскрипции (ОТ), последующей полимеразной цепной реакции (ПЦР) ОТ-ПЦР и расчетом соотношения относительной концентрации этих молекул. Диагностическая чувствительность способа - 70%, специфичность - 72%. [6].

Техническим результатом изобретения является повышение точности, чувствительности и специфичности способа.

Указанный технический результат достигается в способе дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий, включающем исследование цитологического мазка путем выделения РНК, анализ двух молекул микроРНК методом обратной транскрипции (ОТ) и последующей количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), расчет соотношения относительных концентрации этих молекул, в котором методом ОТ - ПЦР исследуют две молекулы микроРНК: miR-451-5p и miR-200a-3p, вычисляют соотношение их относительных концентраций и при соотношении miR-451- 5p/miR-200a-3p < 1,7 диагностируют нормальный цервикальный эпителий или легкую степень цервикальной дисплазии, при miR-451-5p / miR-200a-3p >1,7 - тяжелую степень дисплазии или рак шейки матки.

Способ иллюстрируется фиг. 1,2, где:

На фиг.1 - кривая ROC-анализа;

На фиг.2 - образец исследованного цитологического мазка заявляемым способом.

Как показали проведенные исследования, развитие дисплазии тяжелой степени эпителия цервикального канала сопровождается активацией экспрессии miR-145-5p и угнетением экспрессии miR-200a-3p.

Чувствительность диагностического теста, основанного на индивидуальной оценке изменений экспрессии этих молекул, не является достаточной, в то время как расчет соотношения концентраций молекул с реципрокным (разнонаправленным) характером патологических изменений позволяет уверенно дифференцировать клинические значимые различия: «NILM+LSIL» vs. «HSIL+CC» (NILM - Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy / цитограмма без особенностей; LSIL - Low Squamous Interepithelial Lesions / дисплазия легкой степени; HSIL - High Squamous Interepithelial Lesions / дисплазия тяжелой степени; CC - cervical cancer / рак шейки матки).

Для оценки показателей диагностической значимости параметра miR-451-5p/miR-200a-3p был использован биологический материал 24 женщин, проходивших диспансерное обследование. Соскоб цервикального эпителия был получен традиционным методом с целью последующего проведения цитологического исследования. В каждом случае было приготовлено три препарата (цитологических стекла); нанесенный на стекла материал был высушен, фиксирован, окрашен (гематоксилин-эозин). Оценка препаратов была проведена двумя опытными врачами - цитологами. В исследование были включены препараты, оценка которых не вызвала сомнений или расхождений мнений двух специалистов: дисплазия легкой степени / LSIL - Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy (n=12); и дисплазия тяжелой степени / HSIL - High Squamous Intraepithelial Lesion (n=12). В последствии пациенткам второй группы было проведено хирургическое лечение (диатермоконизация) и гистологическое исследование операционного материала, в ходе которого цитологический диагноз был подтвержден.

Один из трех цитологических препаратов был использован для выделения РНК в соответствии с описанным ниже протоколом путем последовательного лизиса биологического материала, адсорбции нуклеиновых кислот на поверхности СПМЧ в присутствии изопропанола, последовательной отмывки этанолом, ацетоном. В заключении СПМЧ высушивали и проводили элюцию нуклеиновых кислот с поверхности частиц в 30 мкл буфера для элюции. Анализ относительной концентрации двух молекул микроРНК (miR-451a-5p и miR-200a-3p) провели путем последовательных реакций обратной транскрипции и ПЦР согласно ниже описанному протоколу. В каждом случае ПЦР проводили в двух технических повторах, результаты которых усредняли. Подсчет значения параметра miR- 451а-5р /200а-3р для каждого образца (пациентки) провели по формуле 2(CtmiR45ia-ctmiR200a) *jqq Принимая пороговым значением параметра miR451/200 = 1.7, для каждого включенного в исследование образца был определен диагноз: дисплазия легкой степени (LSIL) или отсутствие патологических изменений (п=12), и дисплазия тяжелой степени (HSIL) с высоким риском развития рака шейки матки (п=12). В двух из 24 случаев диагнозы, поставленные традиционными методами, не совпали с результатами оценки параметра miR451/200. На основе полученных данных был проведен расчет основных параметров диагностической значимости метода: чувствительность 92%; специфичность 92% (табл.1).

При этом площадь под кривой (фиг.1) после проведения ROC (receiver operation curve) анализа составила 0.96.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

1. Выделяют РНК из цитологического препарата (стекла с фиксированным и окрашенным материалом цервикального эпителия).

Клеточный материал аккуратно растворяют на стекле лизис-буфером (600 мкл), содержащим гуанидинтиоцианат (5М), цитрата натрия (1М), лаурилсаркозинат натрия (10%-ный) и переносят в чистую пробирку, добавляют 10 мкл суперпарамагнитных наночастиц (СПМЧ) размером 4-10 мкм, покрытых диоксидом кремния, на поверхности которых сорбируется РНК. Смесь инкубируют на шейкере при 65°С в течение 15 минут. Добавляют изопропанол (600 мкл), инкубируют при комнатной температуре в течение 5 минут, затем концентрируют СПМЧ с помощью магнитного штатива и удаляют супернатант. Частицы с адсорбированной РНК промывают дважды 70%-ным этанолом (500 мкл), ацетоном (300 мкл) и высушивают. Для элюирования РНК частицы инкубируют в буфере для элюции Трис-НС (110 mМ), рН 8,9 (300 мкл) в течение 5 минут на шейкере при 65°С. После диссоциации РНК от частиц, СПМП концентрируют с помощью магнитного штатива, а раствор РНК переносят в чистую пробирку.

2. На втором этапе производят количественную оценку 2 молекул микроРНК: miR-145-5p и miR-200a-3p.

Реакцию обратной транскрипции (ОТ) и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят на CFX96 Touch™ (Bio-Rad, США).

Реакцию ОТ проводят в объеме 20 мкл. Реакционная смесь содержит фермент обратную транскриптазу (100 у.е.) и соответствующий буфер (любого производителя), праймер для обратной транскрипции (50 nМ) и образец ранее выделенной РНК (4 мкл). Последовательность праймера для обратной транскрипции miR-451а-5р: 5'-АAC GGT ТТС GAC GAA ТАС TGC TAG AGT TGC TAG CAG AGC CCT TAA AAC ТСA -3'; для miR-200a-3p: 5'-AGA CAG TGC GAC GAA TAC TGC TAG AGT TGC TAG CAG AGC CCT TAA АСА TCG-3'. Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют 45 минут при 25°С, с последующим нагревом при 85°С в течение 5 мин для инактивации обратной транскриптазы.

Количественную ПЦР проводят в объеме 20 мкл. Реакционная смесь содержит 2х мастер микс для ПЦР (любого производителя), праймеры для ПЦР (300 пМ), FAM-меченный зонд (200 пМ) и реакционную смесь после ОТ (4 мкл). Последовательности олигонуклеотидов для ПЦР анализа miR- 451а-5Ь: ПЦР-прямой праймер 5'- САА CGG ТТТ CGA CGA АТА С-3’, ПЦР- обратный праймер 5'- GGAAACCGTTACCATTACTG-3зонд 5'- FAM AGA GTT GCT AGC AGA GCC СТТ АА BQH1-3’. Последовательности олигонуклеотидов для ПЦР анализа miR-200a-3p: ПЦР-прямой праймер 5'-AGA CAG TGC GAC GAA ТАС-3’; ПЦР-обратный праймер 5'-CGC ACT GTC TGG TAA CG-3’; зонд 5'- FAM- AGA GTT GCT AGC AGA GCC СТТ AA- BQH1-3’. Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 95°С - 10 мин, 40 циклов: денатурация при 95°С - 10 сек, отжиг праймеров и элонгация: 60°С - 60 сек. Детекцию сигнала амплификации проводят по каналу FAM. Реакцию ОТ-ПЦР для каждого образца повторяют независимо дважды и усредняют, вычисляют соотношение относительных концентраций двух молекул микроРНК по формуле:

miR-451-5p / miR-200a-3p = 2(^ctmiR451a-^ctmiR200a> *100, где: ctmiR-451 -5р - концентрация miR-451 -5р; ctmiR-200a-3p - концентрация miR-200a-3p.

Полученное значение отношения «miR-45 l-5p/miR-200a-3p» сравнивают с пороговым значением 1.7. Если полученное значение меньше порогового, то профиль экспрессии и соотношения экспрессионной активности маркерных молекул микроРНК (miR-451а-5р и miR-200a-3p) соответствуют параметрам нормального цервикального эпителия или легкой степени дисплазии. Если полученное значение больше порогового или равно ему, результат расценивается как соответствующий состоянию тяжелой дисплазии цервикального эпителия или РШМ.

Способ подтверждается следующим клиническим примером.

У пациентки Б. в рамках диспансерного обследования был взят мазок цервикального эпителия с целью проведения цитологического исследования. Жалоб на момент обращения к врачу не было, осмотр шейки матки в зеркалах патологии не выявил. Заключение цитологического исследования материала цервикальных мазков: клетки плоского эпителия с атипией неясного генеза (Atypical Squamous Cell of Undetermined Significance / ASCUS). Результат пересмотра препаратов в альтернативной лаборатории: дисплазия легкой степени тяжести (Light Squamous Intraepithelial Lesion / LSIL). Так, полученные результаты цитологического исследования оказались недостаточно информативны для определения тактики ведения пациентки.

Материал цитологического препарата был использован для выделения РНК в соответствии с ранее описанным протоколом путем последовательного лизиса биологического материала, адсорбции нуклеиновых кислот на поверхности СПМЧ в присутствии изопропанола, последовательной отмывки этанолом, ацетоном. В заключении СПМЧ высушивали и проводили элюцию нуклеиновых кислот с поверхности частиц в 30 мкл буфера для элюции. Анализ относительной концентрации двух молекул микроРНК (miR-451а-5р и miR-200a-3p) провели путем последовательных реакций обратной транскрипции и ПЦР согласно ранее описанному протоколу. В ходе анализа каждой молекулы была проведена реакция обратной транскрипции, затем была ПЦР в двух технических повторах, результаты которых усредняли. Подсчет значения параметра miR451/200 по формуле 2^{(CtmiR451a-CtmiR200a)}*100=2.8, что выше порогового значения 1.7 На основе проведенного исследования состояние цервикального эпителия было оценено как дисплазия тяжелой степени (High Squamous Intraepithelial Lesion / HSIL). Таким образом, диагноз был подтвержден в результате повторного исследования, проведенного через 3 месяца, пациентке рекомендовано оперативное лечение.

На Фиг. 2. представлен репрезентативный фрагмент цитологического препарата пациентки Б. (фото, разрешение Х40) и в табл. 2 - пример расчета параметра miR-451a-5p / miR-200c-3p (табл.2)

Заявляемый способ позволяет повысить диагностическую значимость: обладает высокой чувствительностью - 92%, специфичностью - 92%, диагностической точностью - 91.67%.

Источники информации:

1. А.Д. Каприн, В.В. Старинский Г. В. П. Злокачественные Новообразования В России 2018 (Заболеваемость И Смертность )//Федеральная Служба Государственной Статистики.

2. Kawai S., Fujii Т., Kukimoto I., Yamada H., Yamamoto N., Kuroda M., Otani S., Ichikawa R., Nishio E., Torii Y., Iwata A. Identification of miRNAs in cervical mucus as a novel diagnostic marker for cervical neoplasia//Scientific Reports. Cep. 8. - 2018.- N1.- C. 7070.

3. Gao C., Zhou C., Zhuang J., Liu L., Liu C., Li H., Liu G., Wei J., Sun C. MicroRNA expression in cervical cancer: Novel diagnostic and prognostic biomarkers//Joumal of Cellular Biochemistry. Cep. 119. -2018.-N8,- C. 7080-7090.

4. Pardini B., De Maria D., Francavilla A., Di Gaetano C., Ronco G., Naccarati A. MicroRNAs as markers of progression in cervical cancer: a systematic review//BMC Cancer. Cep. 18. - 2018.- N1.- C. 696.

5. Князева M.C., Присяжная T.C., Забегина Л.М., Смирнова О.А., Михетько А.А., Берлев И.В., Малек А.В. Прогностическое значение анализа микроРНК в клетках цервикального эпителия при дисплазии легкой степени//Опухоли женской репродуктивной системы. Сер. 4. - 2020.- N16.- С. 59-68.

6. Архангельская П.А., Самсонов Р.Б., Штам Т.А., Князева М.С., Иванов М.К., Колесников Н.Н., Титов С.Е., Бахидзе Е.В., Берлев И.В., Михетько А.А., Воробьев С.Л.,

7. Малек А.В. Оценка экспрессии 4 микроРНК в цитологических препаратах в качестве дополнительного метода диагностики рака шеики матки/Юпухоли женской репродуктивной системы. Сер. 3. - 2017.- N13.- С. 63-72.

8 Ivanov М.К., Titov S.E., Dzyubenko V.V., Glushkov S.A., Krasilnikov S.E., Mansurova A.S., Malek A.V., Berlev I.V., Prisyazhnaya T.S., Kuleshova S.V., Hodkevich A.A., Lancuhaj Y.A., Dimitriadi T.A., Agletdinov E.F. Detection of Cervical Lesions and Cancer in Air-Dried Cytologic Smears by Combined Analysis of mRNA and miRNA Expression Levels//The Journal of Molecular Diagnostics. Cep. 23. - 2021.- N5,- C. 541-554.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий. Из цитологического мазка выделяют РНК. Методом ОТ-ПЦР исследуют две молекулы микроРНК: miR-451-5р и miR-200а-3р. Вычисляют соотношение их относительных концентраций. При соотношении miR-451-5p/miR-200a-3p<1,7 диагностируют нормальный цервикальный эпителий или легкую степень цервикальной дисплазии. При miR-451-5р/miR-200a-3p≥1,7 диагностируют тяжелую степень дисплазии с высоким риском развития рака шейки матки. Способ обеспечивает повышение точности, чувствительности и специфичности дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий за счет расчета соотношения относительных концентраций miR-451-5р и miR-200а-3р. 2 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий, включающий исследование цитологического мазка путем выделения РНК, анализ двух молекул микроРНК методом обратной транскрипции (ОТ) и последующей количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), расчет соотношения относительных концентраций этих молекул, отличающийся тем, что методом ОТ-ПЦР исследуют две молекулы микроРНК: miR-451-5р и miR-200а-3р, вычисляют соотношение их относительных концентраций и при соотношении miR-451-5p/miR-200a-3p<1,7 диагностируют нормальный цервикальный эпителий или легкую степень цервикальной дисплазии, при miR-451-5р/miR-200a-3p≥1,7 - тяжелую степень дисплазии с высоким риском развития рака шейки матки.