Способ анализа микроРНК в образцах биологического материала Российский патент 2022 года по МПК C12Q1/68 C12N15/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и диагностической медицины, является способом количественного анализа молекул микроРНК (миРНК), может быть использовано при разработке тест-систем для скрининга, диагностики или контроля эффекта терапии хронических заболеваний, включая онкологические. Способ применим для количественного анализа миРНК в биологическом материале, включая операционный материал, материал трепан- или тонкоигольной биопсии, соскобы эпителиев или материл жидкостной биопсии после выделения РНК любым доступным методом, обеспечивающим сохранность малых РНК молекул (<30 нуклеотидов). Способ основан на последовательном проведении двух реакций: обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разработанный оригинальный дизайн олигонуклеотидов (праймеров и зондов) обеспечивает исключительную аналитическую чувствительность технологии, и может, соответственно, обеспечивать высокие показатели диагностической чувствительности тест-систем, разработанных для медицинской диагностики.

МикроРНК/MicroRNA (миРНК/miRNA) - это короткие регуляторные молекулы РНК, образованные из 20 - 22 мономеров рибонуклеиновых кислот (adenine, A; cytosine, C; guanine, G; and uracil, U). Предшественники «зрелых» миРНК секретируются (транскрибируются) в клеточном ядре с помощью фермента РНК-полимеразы (Pol II), выводятся в цитоплазму, и после структурной модификации с участием специализированного белкового комплекса (Dicer, TRBP), превращаются в короткие одно-цепочечные функциональные молекулы, которые участвуют в пост-транскрипционном контроле экспрессии генома клетки. Комплементарное взаимодействие миРНК с участками матричных (информационных) молекул, так называемых мРНК (messenger RNA, mRNA), приводит к блокированию синтеза белка или к деградации мРНК. Этот феномен в англоязычной литературе называется «RNA interference» (РНК интерференция) [1]. В дополнение к основным механизмам регуляции экспрессии генома путем избирательного угнетения синтеза отдельных белковых молекул, описана способность миРНК взаимодействовать с участками ядерной ДНК и таким образом, изменять активность работы аппарата транскрипции [2]. В целом, миРНК - это класс некодирующих (non protein-coding) регуляторных молекул, которые вовлечены в контроль основных внутриклеточных процессов. К настоящему времени в клетках человека описано несколько тысяч молекул миРНК, которые представлены в соответствующих базах данных (например, miRbase: www.mirbase.org). Для клеток определенного типа характерен определенный набор, или т.н. «профиль» молекул миРНК, которые активно экспрессируются и функционируют в этих клетках. Результаты многочисленных исследований экспрессии молекул миРНК в клетках и тканях организма человека объединены в открытых базаx данных (например, https://ccb-web.cs.uni-saarland.de/tissueatlas/). Развитие патологических состояний, включая состояние неопластической трансформации, сопровождается характерными искажениями профиля экспрессии клеточных миРНК, что определяет возможность разработки методов диагностики на основе полуколичественного анализа этих молекул в биопсийном материале.

Практическое использование. Началом истории исследования миРНК и их роли в клеточной биологии можно считать дату присуждения Нобелевской премии по физиологии и медицине за открытие феномена РНК интерференции в 2006 году. Несколькими годами позднее, появились научные обзоры, объединяющие представления о роли молекул миРНК в развитии онкологических заболеваний [3]. За полтора десятка лет активных исследований роли этих молекул в развитии рака, стал очевидным диагностический потенциал миРНК, который подтверждается сотнями научных публикаций [4][5], описывающих способы диагностики или прогнозирования течения различных онкологических заболеваний путем количественной оценки специфических молекул миРНК или их комбинаций. По данным отчетов, которые регулярно публикуют Fortune Business Insights Pvt. Ltd., Global Market Vision и другие аналитические компании в 2019 году объем мирового рынка технологий анализа миРНК (miRNA market) составил более 200 миллионов долларов США. Этот рынок формируется лидирующими биотехнологическими компаниями, включая QIAGEN N.V. (Hilden, Germany), Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.), BioVendor (Brno, Czech Republic), Takara Bio Inc. (Shiga, Japan), Merck KGaA (Darmstadt, Germany), NanoString Technologies, Inc. (Washington, U.S.), Heim Biotek (Seongnam, South Korea), при этом >50% ресурсов тратится именно на разработку диагностических решений. При таком обилии научной информации и масштабе проводимых практических разработок, обращает на себя внимание лишь единичные примеры внедрения диагностических технологий, основанных на анализе миРНК, в практическую медицину, например, в онкологию. В мировой базе данных клинических исследований (ClinicalTrials.gov) зарегистрировано лишь 105 открытых исследований методов диагностики и/или прогнозирования течения онкологических заболеваний на основе анализа миРНК, но результаты этих исследований пока не опубликованы. На мировом рынке представлены единичные примеры коммерческих продуктов: ThyraMIR / Interpace diagnostics (технология глубокого секвенирования / deep sequencing); hsa-mir124-2 cervical carcinoma methylation test / Qiagen (технология ОТ-ПЦР / RT-PCR). При этом использование упомянутых тест-систем, основанных на количественном анализе миРНК, не входит в национальные клинические рекомендации развитых стран, включая федеральные клинические рекомендации и стандарты лечения РФ. Среди прочих причин, эта ситуация обусловлена отсутствием надежных и экономичных аналитических технологий.

Обратная транскрипция и последующая полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) является одним из возможных методов количественной оценки молекул микроРНК в составе биологических образцов. Основным преимуществом этой технологии перед другими (miRNA-arrays, miRNA-seq, Nanostring) является экономичность и возможность анализа одной или нескольких диагностически значимых миРНК (т.н. диагностического набора или панели), а не сотен миРНК молекул, не имеющих диагностической ценности. По этой причине именно ОТ-ПЦР имеет шансы войти в рутинную практику клинической диагностики. Эта технология предполагает два этапа: синтез молекулы ДНК, комплементарной детектируемой молекуле миРНК (обратная транскрипция, ОТ) и полимеразная цепная реакция (ПЦР), в которой происходит многократная амплификация комплементарной ДНК. Количество синтезированных в ходе ПЦР копий анализируемой молекулы (т.н. ампликонов) отражает исходную концентрацию этой молекулы в образце и может оценивается в режиме реального времени. Применение технологии ОТ-ПЦР для анализа коротких молекул миРНК, длина которых не превышает 20-22 нуклеотидов, является нетривиальной задачей. ДНК копия короткой миРНК не может быть амплифицирована в ходе ПЦР, т.к. ее размер сопоставим со стандартными размерами ПЦР праймеров. Для детекции миРНК с помощью ПЦР, необходимо не только синтезировать комплементарную ей ДНК (кДНК), но и каким-то образом увеличить размер этой молекулы. Длина кДНК должна быть достаточной для «посадки» двух ПЦР праймеров, т.е. иметь в составе 50 или более нуклеотидов. Существует несколько вариантов (технологий) обратной транскрипции миРНК и/или ее сочетаний с другими ферментативными реакциями, которые позволяют получить достаточно длинную (>50 нуклеотидов) молекулу кДНК, эффективность последующей амплификации которой может отражать концентрацию исходной миРНК.

Наиболее распространенной является технология, предполагающая использование праймера, у которого 3'-конец частично комплементарен детектируемой миРНК (обычно, на 6-8 нуклеотидов), а 5'-конец формирует так называемую «петлю» (stem-loop primer)[6]. Такой праймер связывает детектируемую молекулу миРНК за счет комплементарного участка, который достраивается (удлинняетая) в ходе реакции ОТ на основе миРНК (Фиг. 1А). Таким образом, формируется молекула кДНК, у которой 3'-конец полностью комплементарен детектируемой миРНК, а «петля» на 5'-конце «разворачивается» при нагревании так, что полученная молекула имеет достаточную длину для инициации реакции ПЦР.

Альтернативные методы «удлиннения» молекулы миРНК предполагают проведение дополнительных ферментативных реакций, например, лигирования (присоединения) универсального фрагмента ДНК, т.н. адаптера (Фиг. 1Б) [7], или синтеза поли-А [8] или поли-U [9] цепочки на 3'-конце молекулы миРНК (Фиг. 1В). Добавленный каким-либо способом к молекуле миРНК универсалюный участок является местом «посадки» универсального праймера для обратной транскрипции.

Полученная одним из трех описанных способов молекула кДНК может быть амплифицирована с помощью двух ПЦР праймеров. Но при этом один праймер повторяет последовательность детектируемой молекулы миРНК («обратный праймер» на Фиг. 1), т.е. он уникален или миРНК-специфичен; другой праймер соответствует «добавленному» участку. Эта особенность компрометрует специфичность детекции. Для повышения специфичности детекции миРНК, технология, основанная на «stem-loop primer», может быть дополнена ПЦР с использованием TaqMan зондов. Этот метод детекции предложенный в 2005 году [6] реализован в составе многих коммерческих наборов и активно используется до настоящего времени для решения исследовательских задач.

С учетом существования родственных миРНК молекул, последовательность которых может отличаться лишь двумя-тремя нуклеотидами, но диагностическое значение которых может быть разным, в течение последующих лет активно велись разработки методов, обеспечивающих более высокие аналитические характеристики технологии ОТ-ПЦР анализа миРНК. В целом, поиск был направлен на разработку таких технологий обратной транскрипции, которые бы формировали молекулу ДНК с двумя или более участками, комплементарными детектируемой молекуле миРНК. Такая структура кДНК обеспечивала бы возможность использования двух миРНК-специфичных ПЦР праймеров, что повышало бы специфичность анализа.

Например, в 2011 Kumar P. и соавторами [10] был предложен метод, который предполагал образование «циркулярных» молекул путем соединения (лигирования) концов молекул микроРНК. На основе таких циркулярных молекул с помощью коротких (длиной 8-10 нуклеотидов) миРНК-специфичных ОТ-праймеров синтезировались длинные кДНК, содержащие многократные повторы последовательности детектируемой молекулы миРНК (Фиг. 2А). Далее проводилась ПЦР с двумя миРНК-специфичными праймерами. Эта технология, после ряда оптимизаций, реализована в виде аналитичекого набора для исследовательских целей компонией SomaGenics (miR-ID® Technology). В 2017 году Androvich P. и соавторами [11] была разработана оригинальная технология обратной транскрипции миРНК с помощью относительно длинного праймера, который формирует петлю в середине молекулы, а два его конца комплементарно связывают концы детектируемой миРНК, располагаясь «навстречу» друг другу (Фиг. 2В). Реакция ОТ достраивает 3'-конец праймера, который становится комплементарным полноразмерной молекуле миРНК, при этом в процессе транскрипции происходит диссоциация 5'- конца ОТ-праймера от 5'-конца миРНК. Таким образом, образуется достаточно длинная молекула кДНК и оба конца этой молекулы имеют участки, комплементарные детектируемой миРНК. Данная технология также реализована в виде наборов для исследований (Two-tailed cDNA symthesis system) компанией BioVendor - Laboratorni medicina a.s. Основным общим преимуществом обеих технологий является формирование такого продукта обратной транскрипции, который может инициироватъ ПЦР с двумя миРНК-специфичными праймерами, что существенно повышает специфичность детекции. В обоих случаях детекция амлификации в проводится в режиме реального времени с помощью ДНК интеркалирующих красителей (SYBR green).

В целом, существование множества различных подходов к дизайну реакции обратной транскрипции миРНК отражает отсутствие оптимальной и универсальной технологии. Так, например, сравнительное исследование семи технологий ОТ-ПЦР анализа миРНК, реализованных в коммерческих наборах (miRCury (Exiqon), OpenArray (Life Technologies), TaqMan Cards (Life Technologies), TaqMan Cards preAmp (Life Technologies), miScript (Qiagen), qScript (Quanta BioSciences) and SmartChip (WaferGen) было проведено в 2014 [12] и показало крайне низкую воспроизводимость результатов: лишь для 3% молекул все методы показали сходные результаты анализа. Современное состояние развития технологий ОТ-ПЦР анализа микроРНК представлено в обзоре Diego Forero[13], который констатирует необходимость дальнейшего усовершенствования существующих методов.

АНАЛОГИ:

К настоящему времени множество технологий количественного анализа миРНК, включающие этап полимеразной цепной реакции, описано в оригинальных публикациях, некоторые оригинальные и коммерчески перспективные методы запатентованы (Таблица 1).

Таблица 1. Способы ОТ-ПЦР анализа миРНК (патенты). Дата N патента Название метода 27.12.2006 EP1735459A2 Methods for quantification of micrornas and small interfering RNAs 10.04.2008 WO2008040355A2 Methods for quantification of micrornas and small interfering RNAs 03.09.2007 US20090220969A1 Identifying and quantifying small RNAs 16.09.2010 WO2010103522A1 Method for detection of nucleic acid sequences 24.02.2015 US8962253B2 Methods and compositions for detection of small RNAs 23.06.2016 US20160177376A1 Detection method of micro-rna with high specificity

Многие технологии реализованы в коммерческих наборах (Таблица 2) и доступны для решения исследовательских задач.

Таблица 2. Коммерческие наборы для ОТ-ПЦР анализа миРНК и производители. Название набора Производитель miRNA Oligo chip 3D Gene miRNA qPCR assays Canopy Biosciences microRNA Assays Eurogentec miRCURY™ LNA™ Universal RT microRNA PCR Exiqon / Qiagen miProfile™ miRNA qPCR Arrays Genecopeia All-in-One™ miRNA qRT-PCR Qiagen qScript microRNA Quantabio SmartChip Takara OpenArray Thermo Fisher TaqMan miRNA Assays Thermo Fisher

Все перечисленные методы решают сходную задачу полуколичественного анализа микроРНК с помощью различных вариантов последовательных реакций ОТ и ПЦР, и могут рассматриваться как аналоги разработанной технологии.

ПРОТОТИП

Прототипом разработанной системы детекции послужил метод, предложенный в 2017 году Androvic P. и соавторами [11]. Метод предполагает использование двухфлангового (two-tailed) праймера для обратной транскрипции и последующую ПЦР с двумя миРНК-специфичными праймерами. Использование двух миРНК-специфичных ПЦР праймеров является оригинальной особенностью технологии-прототипа, эта особенность определяет высокую специфичность метода. Детекция амплификации проводилась с помощью интеркалирующего агента SYBR-green. Схема технологии представлена на Фиг. 2Б. Технология - прототип имеет два существенных ограничения. Во-первых, последовательности ОТ-праймера и обратного ПЦР-праймера предполагают наличие коротких комплементарных участков, взаимодействие этих участков определяет возможность инициации полимеразной цепной реакции и получение ложно позитивного результата анализа без предварительной реакции ОТ, т.е. нулевых концентрациях аналита (миРНК). Эта особенность ограничивает применение технологии в диапазоне низких концентраций миРНК. Во-вторых, прототип предполагает использование интеркалирующего агента (SYBR-green) для детекции амплификации в режиме реального времени. С учетом малого размера ампликона, детекция флуоресцентного сигнала становится возможной лишь после накопления необходимого числа продуктов ПЦР. Эта особенность приводит к относительно низкой чувствительности технологии. Так, инновационный дизайн ОТ-праймера обеспечил высокую специфичность технологии-прототипа, но при этом относительно низкая чувствительность метода и возможность получения ложно позитивных результатов ограничивает возможности его применения в целях медицинской диагностики.

Задачей изобретения являлось создание такой технологии количественного анализа молекул миРНК, которая сочетала бы высокие показатели аналитической специфичности, присущие технологии-прототипу, но обладала бы существенно более высокой аналитической чувствительностью.

Технический результат:

На основе прототипа, предложенного Androvic P. и соавторами [11], разработана новая технология ОТ-ПЦР анализа молекул микроРНК. Специфичность новой технологии аналогична специфичности прототипа, а чувствительность - существенно превышает чувствительность прототипа. Система анализа отдельной молекулы миРНК включает: праймер для двухфланговой обратной транскрипции, два миРНК-специфичных праймера для ПЦР и два зонда, модифицированных флуоресцентной меткой, гасителем. Пример олигонуклеотидных последовательностей для анализа молекулы has-miR-27а-3p представлены на Фиг. 3. Эта и аналогичные ей системы позволяют проводить количественную детекцию специфических молекул миРНК в широком диапазоне концентраций аналита (от 10 до 10¹⁰ молекул / реакцию). Аналитическая чувствительность разработанной технологии существенно превышает чувствительность технологии-прототипа, что определяет высокий потенциал ее применения для решения задач медицинской диагностики.

Определяющим отличительным признаком предлагаемого способа, как и его прототипа, по сравнению с аналогами является отсутствие необходимости проведения ферментативных реакций, предшествующих реакции обратной транскрипции и использование двухфлангового ОТ праймера, который обеспечивает связывание двух концов детектируемой молекулы, праймирование реакции ОТ и формирование кДНК молекулы, два фланга которой имеют участки полностью (3'-конец) или частично (5'-конец) комплементарные детектируемой миРНК. Такая структура кДНК определяет возможность дизайна и использования двух миРНК-специфичных праймеров для ПЦР, что обеспечивает высокую аналитическую специфичность технологии в относительно широком диапазоне концентраций аналита (миРНК).

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом является:

- модификация ПЦР праймера (обратного), который инициирует синтез ПЦР продукта на основе кДНК. В технологии - прототипе прямой праймер включает участок комплементарный 3'-концу ОТ-праймера (обычно 4-6 нуклеотидов). Взаимодействие ОТ-праймера с прямым ПЦР праймером инициирует ПЦР в случае отсутствия или низкой концентрации аналита, и, соответственно, отсутствия или низкой концентрации кДНК. Этот эффект наблюдается в виде «плато» линии графика зависимости значений порогового цикла (Ct) от концентрации аналита (миРНК). Разработанный способ предполагает использование укороченного (14-16 вместо 20 нуклеотидов) прямого ПЦР праймера, который «отжигается» на участке кДНК, который образовался в ходе реакции ОТ, но не на ОТ-праймере. Для достижения необходимой температуры отжига короткого праймера, производится замена двух или трех мононуклеотидов в его составе модифицированными мононуклеотидами с «закрытой» структурой кольца рибозы через дополнительное соединение кослорода 2' и углерода 4' (LNA, locked nucleic acid). Эта модификация позволяет обеспечить температуру отжига праймера 60C - 64C, исключить вероятность взаимодействия прямого ПЦР праймера и ОТ праймера, которая инициирует реакцию ПЦР и приводит к получению ложно-позитивных результатов при низких концентрациях или отсутствии детектируемой миРНК. На Фиг. 4А представлен график зависимости значений пороговых циклов (Ct) от концентрации аналита при использовании технологии - прототипа. Анализ проведен с использованием синтетического аналога молекулы miR-126, взаимодействие ОТ-праймера и прямого ПЦР праймера приводит к инициации ПЦР при низких или нулевых концентрациях аналита (миРНК) и проявляется как «плато» линии графика. Использование модифицированного ПЦР праймера исключает возможность его комплементарного взаимодействия с ОТ-праймером и повышает аналитическую чувствительность системы при работе с низкими концентрациями аналита (Фиг. 4Б).

- детекции процесса амплификации с помощью миРНК-специфичного зонда (или зондов). Зонд имеет длину 24-26 нуклеотидов, последовательность зонда идентична участку ОТ-праймера, 5'-конец зонда модифицирован флуоресцентной меткой (FAM, ROX или др.), 3'-конец зонда модифицирован соответствующим «гасителем», 3-4 нуклеотида в составе зонда имеют «закрытую» структуру кольца рибозы с дополнительным соединением кослорода 2' и углерода 4' (LNA, locked nucleic acid). Использование TaqMan и оригинальная структура зонда позволяют существенно повысить аналитическую чувствительность технологии (известна разница SYBR-green vs. TaqMan технологии [14]) в широком диапазоне концентраций аналита. На графике зависимости значений пороговых циклов (Ct) от концентрации аналита (Фиг. 5А vs Фиг. 5Б) эта особенность отражена более низкими значениями Ct при анализе идентичных разведений аналита, что приводит к «сдвигу» линии графика (анализ проведен с использованием синтетического аналога молекулы miR-126).

Использование технологии TaqMan обеспечивает возможность дальнейшей оптимизации метода. В частности,

- при необходимости повышения чувствительности возможно использование двух зондов, меченным одинаковой флуоресцентной меткой и комплементарных разным цепям ампликона (Фиг. 5Б). При этом возможно формирования участка комплементарности между двумя зондами, но, если этот участок не превышает 4-5 оснований, это не влияет на эффективность анализа.

- дополнительно к представленным особенностям, повышающим чувствительность разработанной технологии по сравнению с прототипом, использование зондов, с различной нуклеотидной последовательностью и меченных различными флуоресцентными метками, позволяет проводить мультиплексный анализ, т.е. одновременный анализ двух и более молекул. При этом рекомендуется проводить реакцию ОТ отдельно для каждой молекулы, а до 3-4 продуктов ОТ могут быть объединены для «мультиплексной» ПЦР с зондами для анализа разных миРНК, меченных разными флуоресцентными метками.

Таким образом, разработанная система количественного анализа сохраняет показатели аналитической специфичности прототипа, но имеет существенно более высокую аналитическую чувствительность. Совокупность этих характеристик позволяет использовать разработанный метод для создания диагностических тест-систем, экономичность которых может быть повышена путем одновременной детекции двух и более молекул миРНК с помощью зондов с разными метками (мультиплексирование). Такой подход особенно целесообразен при анализе миРНК, с реципрокным (разнонаправленным) характером опухоль-ассоциированных изменений экспрессионной активности.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, который заключается в следующем:

1. Дизайн ОТ-праймера

1.1. Формируется основа ОТ-праймера: олигонуклеотид (45-55 нт), имеющий участки комплементарности длиной 7-10 нт. (Фиг. 3: первый этап, голубой цвет последовательности), которые обеспечивают формирование «шпильки» и устойчивую пространственную структуру молекулы ОТ-праймера

1.2. Основа ОТ-праймера «достраивается» по флангам участками, комплементарными детектируемой молекуле (Фиг. 3: второй этап, желтый цвет последовательности), в общем случае 5'-конец ОТ-праймера дополняется 8(±2)-нуклеотидной последовательностью, комплементарной 5'-концу молекулы миРНК, а 3'-конец ОТ-праймера дополняется 6(±2)-нуклеотидной последовательностью, комплементарной 5'-концу молекулы миРНК. Ориентация «добавленных» участков обеспечивает их «отжиг» на детектируемой миРНК в направлении «навстречу» друг другу (Фиг. 3). Позиции «отжига» флангов ОТ-праймера на молекуле миРНК можно «сдвигать», но между ними должно оставаться не менее 4-5 нуклеотидов.

1.3. Полученный таким образом вариант ОТ-праймера необходимо in silico проверить на вероятность образования вторичных структур. Для этого можно использовать любые доступные аналитические программы (http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/; и др.). Структура с одной «шпилькой», формируемой комплементарными участками основы ОТ-праймера (2D структура ОТ-праймера, Фиг. 3), должна иметь вероятность формирования не ниже 95%.

2. Дизайн ПЦР праймеров

2.1. Проводится дизайн кДНК путем in silico «удлинения» 3'-конца ОТ-праймера фрагментом, комплементарным молекуле миРНК.

2.2. Формируется последовательность обратного праймера, комплементарная участку кДНК, полученному в результате ОТ (Фиг. 3: третий этап, зеленый цвет последовательности). Путем включения в последовательность праймера LNA-нуклеотидов, оптимизируется температура его «отжига», которая должна лежать в диапазоне 56-60°С.

2.3. Формируется последовательность прямого праймера, комплементарная 5'-концу ОТ-праймера (Фиг. 3: четвертый этап, зеленый цвет последовательности). При необходимости путем включения в последовательность праймера LNA-нуклеотидов, оптимизируется температура его «отжига», которая должна лежать в диапазоне 56-60°С.

2.4. В заключении, необходимо проверить вероятность взаимодействия ПЦР праймеров и формирования ими вторичных структур (димеров) с помощью любых доступных аналитических программ (например, PerlPrimer: https://sourceforge.net/projects/perlprimer/?source=typ_redirect). При этом следует помнить, что дизайн ПЦР праймеров предполагает вероятность комплементарного взаимодействия 5'-концами, которое не влияет на эффективность работы системы.

3. Дизайн зондов.

3.1. Дизайн одного зонда может предполагать его «отжиг» на основе ОТ-праймера, не «затрагивая» миРНК-специфичные участки. Такой зонд должен быть комплементарен ОТ-праймеру и иметь температуру отжига на 6-8°С выше температуры «отжига» ПЦР праймеров. «Расстояние» между зондом и ПЦР праймером при их «отжиге» на молекуле кДНК не должно быть меньше 4-5 нуклеотидов.

3.2. При необходимости повышения чувствительности метода, проводится дизайн второго зонда, комплементарного продукту первого цикла ПЦР. В этом случае для минимизации участка комплементарности двух зондов, их длина должна быть уменьшена, а необходимая температура «отжига» достигается путем включения в последовательность зондов LNA-нуклеотидов (Фиг. 3: третий и четвертый этап, красный цвет последовательностей).

3.3. 5'-конец зонда (зондов) модифицируется флуоресцентной меткой (например, FAM), FAM), 3'-конец модифицируется соответствующим гасителем (например, BHQ1).

4. Подготовка систем для анализа.

4.1. Синтез олигонуклеотидов проводится в соответствии с дизайном, очистка методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, перед использованием олигонуклеотиды разводятся водой до концентрации 100 μМ и хранятся при -20°С.

4.2. Проводится подготовка рабочих растворов олигонуклеотидов, необходимых для анализа специфических молекул миРНК, в следующих концентрациях: ОТ праймер - 1μМ, ПЦР праймеры - 6 μМ (каждый), зонд - 4μМ.

5. Выделение РНК.

Перед проведением анализа тотальная РНК выделяется из биологических образцов

любым методом, предполагающим минимальные потери малых молекул, включая технологии на основе магнитных частиц или спин-колонок.

6. Подготовка ферментных смесей.

Для проведения анализа могут быть использованы ферменты (обратная транскриптаза / ревертаза M-MuLVRH, 100 u/mkl и ДНК полимераза) любых производителей. Оптимальным является использование сбалансированных смесей для ОТ (обратной транскрипции), включающей фермент и 5х буфер и ПЦР (полимеразной цепной реакции), включающей фермент, буфер, MgCl₂, смесь dNTPs).

7. Обратная транскрипция

Реакция ОТ проводится в составе смеси: ОТ-праймер - 1 мкл; ОТ фермент - 1 мкл; 5х ОТ буфер - 4 мкл; РНК - от 0,1 нг до 500 нг; вода без РНКаз - до финального объема 20 мкл; при оптимальной для используемой ревертазы температуре, 45 мин.

8. Полимеразная цепная реакция

8.1 Реакция ПЦР проводится в составе смеси: 2Х ПЦР мастер микс - 10 мкл, ПЦР зонд - 1 мкл; ПЦР праймер прямой (FW) - 1 мкл; ПЦР праймер обратный (RV) - 1 мкл; реакционная смесь после реакции обратной транскрипции - 2 мкл, вода пригодная для ПЦР - до финального объема 20 мкл; условия проведения ПЦР: 95°С - 5 сек, (95°С - 5 сек / 60°С - 15 сек) - 40 циклов.

8.2 Амплификация регистрируется в режиме реального времени по каналу, соответствующему метке зонда. Значения пороговых циклов (Ct) определяются либо автоматически, либо при значении RFU=900.

9. Анализ полученных данных проводится любым методом, включая вычисление концентрации детектируемых молекул исходя из результатов анализа синтетических аналогов миРНК, методы нормализации (dCt) относительно референсных молекул, вычисления соотношений эффективности амплификации молекул с «реципрокным» характером патологических изменений экспрессионной активности и др.

Пример 1. Анализ относительной экспрессии миРНК-126 / миР-145 в материале цервикального мазка с целью диагностики дисплазии цервикального эпителия.

Диагностическое значение анализа этих молекул было показано ранее [15]. Причем при использовании «stem-loop» структуры праймера для обратной транскрипции, предложенный метод диагностики обеспечивал следующие показатели диагностической значимости: AUC - 0,72, чувствительность - 0,71, специфичность - 0,61.

С целью сравнительной оценки, новая технология была использована для анализа 56 образцов РНК, выделенных из материала цервикальных мазков. По результатам цитологического исследования 28 образцов были признаны нормальными (NILM, Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy), в 28 случаях был поставлен диагноз дисплазии тяжелой степени (HLIS, High-grade Squamous Intraepithelial Lesions). Тотальная РНК была выделена набором AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (Qiagen, США). Дизайн олигонуклеотидов и анализ были проведены согласно описанному способу. Значения пороговых циклов Ct определялись при RFU=900, затем был проведен расчет соотношений концентраций двух маркерных молекул (R миР-126/миР-145) по формуле R=2^{(CtmiR126-CtmiR145)}. На Фиг. 6 (слева) представлены результаты сравнения диагностического параметра R (миР-126/миР-145) в двух группах, Фиг. 6 (справа) представляет результаты ROC (receiver operation curve) анализа группы из 56 образцов. Так, разработанный метод количественной оценки экспрессии двух молекул миРНК и последующий расчет соотношения их концентраций показал статистически значимую разницу между сравниваемыми клиническими группами (норма, NILM vs. тяжелая дисплазия, HSIL), при этом показатели диагностической ценности метода (AUC - 0,95, чувствительность - 1, специфичность - 0,89) были существенно выше аналогичных показателей, полученных ранее с помощью аналогичной технологии («stem-loop» структура ОТ праймера и ПЦР с одним миРНК-специфичным и одним универсальным праймером).

Пример 2.

Анализ относительной экспрессии миРНК-29b, миРНК-375 и миРНК-451а в материале тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) щитовидной железы с целью дифференциальной диагностики фолликулярной аденомы и карциномы.

Диагностическое значение анализа этих молекул было показано ранее [16]. Причем при использовании прототипной «two-tailed» структуры праймера для обратной транскрипции, предложенный метод диагностики обеспечивал следующие показатели диагностической значимости для пары миРНК-29b/миРНК-451а: AUC - 0,81, чувствительность - 0,74, специфичность - 0,69, а для пары миРНК-375/миРНК-451а: AUC - 0,83, чувствительность - 0,79, специфичность - 0,71.

С целью сравнительной оценки, новая технология была использована для анализа 48 образцов РНК, выделенных из материала ТАБ узлов щитовидной железы. Все пациенты перенесли операцию (тироидэктомию) и по результатам гистологического исследования ткани узла в 23 случаях был поставлен диагноз фолликулярной аденомы (benign follicular adenoma) и в 25 случаях были поставлен диагноз фолликулярного рака (follicular cancer). Тотальная РНК была выделена из клеток, полученных в ходе ТАБ и подготовленных для исследования методом жидкостной цитологии, с помощью набора AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (Qiagen, США). Дизайн олигонуклеотидов и анализ были проведены согласно описанному способу. Значения пороговых циклов Ct определялись при RFU=900, затем был проведен расчет соотношений концентраций двух пар маркерных молекул (R миРНК-29b/миРНК-451а) и (R миРНК-375/миРНК-451а) по формуле R=2^{(CtmiR29b-CtmiR451a)} и R=2^{(CtmiR375-CtmiR451a)}, соответственно. На Фиг. 7 (слева) представлены результаты сравнения диагностического параметра R (миРНК-29b/миРНК-451а) в двух клинических группах (доброкачественная фолликулярная аденома, FA vs. фолликулярный рак, FTC). Фиг. 7 (справа) представляет результаты ROC (receiver operation curve) анализа группы из 48 образцов по двум диагностическим критериям R=2(CtmiR29b-CtmiR451a) и R=2(CtmiR375-CtmiR451a). Так, разработанный метод количественной оценки экспрессии трех молекул миРНК и последующий расчет соотношения концентраций в двух парах показал статистически значимую разницу между сравниваемыми клиническими группами (фолликулярная аденома, FA vs. фолликулярный рак, FTC), при этом показатели диагностической ценности метода (миРНК-29b/миРНК-451а: AUC - 0,87, чувствительность - 0,85, специфичность - 0,81; миРНК-375/миРНК-451а: AUC - 0,87, чувствительность - 0,82, специфичность - 0,86;) были существенно выше аналогичных показателей, полученных ранее с помощью протопитной технологии с использованием исходной структуры праймера (длинный, с участком «перекрытия» ОТ-праймера) и метода детекции амплификации (SYBR green).

Пример 3. Анализ относительной экспрессии миРНК-191, миРНК-10b, миРНК-31, миРНК-200с в материале пайпель биопсии эндометрия с целью диагностики эндометриоза.

Диагностическое значение анализа этих молекул было показано ранее [17]. Причем при использовании прототипной «two-tailed» структуры праймера для обратной транскрипции, предложенный метод диагностики обеспечивал следующие показатели диагностической значимости: для пары миРНК-191/миР-10b AUC - 0,75, чувствительность - 0,71, специфичность - 0,79; для миРНК-191/миР-31 AUC - 0,76, чувствительность - 0,73, специфичность - 0,79; для миРНК-191/миР-200с AUC - 0,74, чувствительность - 0,65, специфичность - 0,86.

С целью сравнительной оценки, новая технология была использована для анализа 53 образцов РНК, выделенных из материала пайпель биопсии эндометрия, полученного от здоровых женщин (n = 30) и пациенток с аденомиозом 2-3 степени (n = 23), диагноз которым был поставлен на основании клинических данных и данных трансвагинального ультразвукового исследования. Материал хранился не более суток в транспортной среде, исключающей деградацию РНК. Тотальная РНК была выделена из клеток эндометрия с помощью набора AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (Qiagen, США). Дизайн олигонуклеотидов и анализ были проведены согласно описанному способу. Значения пороговых циклов Ct определялись при RFU=900, затем был проведен расчет соотношений концентраций трех пар маркерных молекул миРНК-191/миР-10b, миРНК-191/миР-31, и миРНК-191/миР-200с по ранее представленной формуле R=2^{(CtmiRХ-CtmiRY)}. На Фиг. 8 (слева) представлены результаты сравнения диагностического параметра R (миРНК-191/миР-10b) в двух клинических группах (здоровые женщины vs. пациентки с аденомиозом). Фиг. 8 (справа) представляет результаты ROC (receiver operation curve) анализа группы из 53 образцов по трем диагностическим критериям R=2^{(миРНК-191/миР-10b)}, R=2^{(миРНК-191/миР-31)} и R=2^{(миРНК-191/миР-200с)}. Так, разработанный метод количественной оценки экспрессии четырех молекул миРНК и последующий расчет соотношения концентраций в трех парах показал статистически значимую разницу между сравниваемыми клиническими группами (здоровые женщины vs. пациентки с аденомиозом), при этом показатели диагностической ценности метода (миРНК-191/миР-10b: AUC - 0,82, чувствительность - 0,81, специфичность - 0,88; миРНК-191/миР-31: AUC - 0,84, чувствительность - 0,91, специфичность - 0,88; миРНК-191/миР-200с: AUC - 0,89, чувствительность - 0,94, специфичность - 0,89) были существенно выше аналогичных показателей, полученных ранее с помощью протопитной технологии с использованием исходной структуры праймера (длинный, с участком «перекрытия» ОТ-праймера) и метода детекции амплификации (SYBR green).

ЛИТЕРАТУРА:

1. Roberts T. C. The microRNA Machinery//Adv Exp Med Biol . Сер. 2015. - 2015.- N887.- С. 15-30.

2. Liu H., Lei C., He Q., Pan Z., Xiao D., Tao Y. Nuclear functions of mammalian MicroRNAs in gene regulation, immunity and cancer//Molecular Cancer. Сер. 17. - 2018.- N1.- С. 64.

3. Hayes J., Peruzzi P. P., Lawler S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy//Trends in Molecular Medicine. Сер. 20. - 2014.- N8.- С. 460-469.

4. Iorio M. V., Croce C. M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review//EMBO Molecular Medicine. Сер. 4. - 2012.- N3.- С. 143-159.

5. Siddiqua A., Kousar S., Jamil A., Tabassum R., Mehmood T., Shafiq N. MicroRNA: A Signature for Cancer Diagnostics//, in Current Cancer Treatment. IntechOpen.

6. Chen C. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR//Nucleic Acids Research. Сер. 33. - 2005.- N20.- С. e179-e179.

7. Benes V., Castoldi M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available//Methods. Сер. 50. - 2010.- N4.- С. 244-249.

8. Balcells I., Cirera S., Busk P. K. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers//BMC Biotechnology. Сер. 11. - 2011.- N1.- С. 70.

9. Mei Q., Li X., Meng Y., Wu Z., Guo M., Zhao Y., Fu X., Han W. A Facile and Specific Assay for Quantifying MicroRNA by an Optimized RT-qPCR Approach//PLoS ONE. (Gonzalez, P., Ed.) Сер. 7. - 2012.- N10.- С. e46890.

10. Kumar P., Johnston B. H., Kazakov S. A. miR-ID: A novel, circularization-based platform for detection of microRNAs//RNA. Сер. 17. - 2011.- N2.- С. 365-380.

11. Androvic P., Valihrach L., Elling J., Sjoback R., Kubista M. Two-tailed RT-qPCR: a novel method for highly accurate miRNA quantification//Nucleic Acids Research. Сер. 45. - 2017.- N15.- С. e144-e144.

12. Mestdagh P., Hartmann N., Baeriswyl L., Andreasen D., Bernard N., Chen C., Cheo D., D'Andrade P., DeMayo M., Dennis L., Derveaux S., Feng Y., Fulmer-Smentek S., Gerstmayer B., Gouffon J., Grimley C., Lader E., Lee K. Y., Luo S., Mouritzen P., Narayanan A., Patel S., Peiffer S., Rüberg S., Schroth G., Schuster D., Shaffer J. M., Shelton E. J., Silveria S., Ulmanella U., Veeramachaneni V., Staedtler F., Peters T., Guettouche T., Wong L., Vandesompele J. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study//Nature Methods. Сер. 11. - 2014.- N8.- С. 809-815.

13. Forero D. A., González-Giraldo Y., Castro-Vega L. J., Barreto G. E. qPCR-based methods for expression analysis of miRNAs//BioTechniques. Сер. 67. - 2019.- N4.- С. 192-199.

14. Soltany-Rezaee-Rad M., Sepehrizadeh Z., Mottaghi-Dastjerdi N., Yazdi M. T., Seyatesh N. Comparison of SYBR Green and TaqMan real-time PCR methods for quantitative detection of residual CHO host-cell DNA in biopharmaceuticals//Biologicals. Сер. 43. - 2015.- N2.- С. 130-135.

15. Архангельская П. А., Самсонов Р. Б., Штам Т. А., Князева М. С., Иванов М. К., Титов С. Е., Колесников Н. Н., Бахидзе Е. В., Берлев И. В., Михетько А. А., Воробьев С. Л., Малек А. В. Оценка экспрессии 4 микроРНК в цитологических препаратах в качестве дополнительного метода диагностики рака шейки матки//Опухоли женской репродуктивной системы. Сер. 13. - 2017.- N3.- С. 63-72.

16. Knyazeva M., Korobkina E., Karizky A., Sorokin M., Buzdin A., Vorobyev S., Malek A. Reciprocal Dysregulation of MiR-146b and MiR-451 Contributes in Malignant Phenotype of Follicular Thyroid Tumor//International Journal of Molecular Sciences. Сер. 21. - 2020.- N17.- С. 5950.

17. Borisov E., Knyazeva M., Novak V., Zabegina L., Prisyazhnaya T., Karizkiy A., Berlev I., Malek A. Analysis of reciprocally dysregulated miRNAs in eutopic endometrium is a promising approach for low invasive diagnostics of adenomyosis//Diagnostics. Сер. 10. - 2020.- N10.

Изобретение относится к области биотехнологии и диагностической медицины, является новым методом полуколичественного анализа определенных молекул микроРНК (далее миРНК) в образцах РНК, выделенной из биологического (биопсийного) материала. Способ включает последовательное проведение двух реакций: обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР), причем последовательность обратного ПЦР праймера обеспечивает его взаимодействие только с участком комплементарной ДНК, синтезированным в результате реакции ОТ, исключает возможность взаимодействия с ОТ-праймером и инициацию ПЦР после неэффективной ОТ в отсутствие аналита (миРНК). Изобретение позволяет существенно повысить аналитическую чувствительность технологии анализа миРНК с помощью двухфланговой ОТ-ПЦР (two-tailed RT-PCR), что определяет возможность использования этой технологии для медицинской диагностики. 8 ил., 2 табл., 3 пр.

Способ количественного анализа специфических молекул микроРНК (миРНК) в образцах тотальной РНК, выделенной из материала биопсий, отличающийся тем, что для реакции обратной транскрипции (ОТ) используются оригинальный двухфланговый ОТ-праймер, при этом 5'-конец праймера связывает 8±2 оснований 5'-конца миРНК, а 3'-конец праймера связывает 6±2 оснований 3'-конца миРНК в направлении «навстречу» друг другу, полимеразная цепная реакция проводится с помощью двух оригинальных LNA модифицированных праймеров, причем структура обратного праймера исключает возможность его комплементарного взаимодействия с ОТ-праймером, детекция амплификации проводится в режиме реального времени по технологии TaqMan с помощью одного или двух ДНК-зондов, последовательность которых обеспечивает их отжиг на двух комплементарных цепях ампликона.