СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АСЕПТИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ IN VITRO ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ЛИСТВЕННЫХ ПОРОД СРЕДНЕГО И СТАРШЕГО КЛАССОВ ВОЗРАСТА Российский патент 2025 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для массового размножения древесных растений в условиях культуры тканей.

Метод клонального микроразмножения позволяет сохранять характеристики материнского организма растения.

Для введения в асептическую культуру древесных растений лиственных пород используют ткани на ювенильном этапе развития при относительно легкой регенерации. Введение в культуру клеток и тканей растений, относящихся к среднему и старшему классу возраста деревьев, достигших физиологической зрелости, ограничено низкой регенерацией и способностью к клеточному делению и сопровождается большим отпадом исходного материала. Полученные регенеранты растений среднего и старшего классов возраста можно культивировать в асептической среде для сохранения генофонда и дальнейшей мультипликации.

Известен способ выращивания посадочного материала тополя (патент RU 2485755, МПК A01G 1/00, опубл. 27.06.2013), включающий заготовку побегов, их стерилизацию, индукцию развития основного пазушного побега на первичных эксплантах, укоренение изолированных побегов, их мультипликацию в условиях in vitro и перевод в нестерильные условия, отличающийся тем, что микрочеренкование осуществляют на питательной среде WPM - Woody Plant Medium, со сниженным содержанием БАП - бензиламинопурин 0,2 мг/л и добавлением ГК - гиббереллиновой кислоты 0,2 мг/л, и высадка пробирочных микрорастений в нестерильные условия проводится без их предварительной адаптации к условиям климатической камеры.

Недостатком способа является сложность и трудоемкость процесса, способ применим только для быстрорастущих культур с высокой побегообразовательной способностью.

Известен способ формирования коллекции и длительного депонирования винограда in vitro (патент RU 2764104, МПК А01Н 4/00, опубл. 13.01.2022), включающий введение в культуру апикальных меристем и формирование на их основе коллекции, с предварительным культивированием на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга (MS), высадку на хранение, отличающийся тем, что апикальные меристемы размером 0,1-0,2 мм, выделенные из пробирочных растений, ранее введенных в культуру, выдерживают на питательной среде с добавлением регулятора роста Мелафен при разведении 10^-5-10^-11, а образовавшиеся побеги выдерживают на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей Цефотаксим в концентрации 50-450 мг/л, и производят высадку на хранение микрочеренков оздоровленных растений, выделенных из верхних частей побегов.

Недостатком способа является введение в культуру in vitro меристем пробирочных растений из лабораторной коллекции, что увеличивает риск мутации регенерантов.

Наиболее близким к заявленному решению, принятым за прототип, является способ клонального микроразмножения грецкого ореха (а.с. СССР №1706478 A1, опубл. 23.01.1992), включающий вычленение экспланта от материнского растения, высадку его на питательную среду Мурасиге-Скуга (MS) и культивирование до получения побега, отличающийся тем, что с целью повышения выхода растений-регенерантов в качестве материнского растения используют сеянцы или привитые саженцы, при этом экспланты вычленяют из этиолированных травянистых побегов материнского растения, предварительно выращенные в темноте.

Недостатком способа является применение исходного материала семенного происхождения, который не является клоном и не обеспечивает сохранения характеристик материнского растения, сложность и трудоемкость процесса предварительной прививки.

Задачей изобретения является разработка способа получения асептической культуры in vitro эксплантов вне зависимости от времени года, получение генетически идентичных регенерирующих клонов от древесных растений среднего и старшего классов возраста. Технический результат предлагаемого изобретения совпадает с задачей.

Для решения задачи предложен способ получения асептической культуры in vitro древесных растений лиственных пород среднего и старшего классов возраста в период вегетации или покоя растений, включающий вычленение этиолированного побега клонируемого растения, высадку на питательную среду MS в вертикальном положении и культивирование с пассированием экспланта с интервалом в 14 суток до получения жизнеспособного регенеранта. В период вегетации индукцию этиолированных побегов производят в полной темноте из спящих почек из сегментов ствола или скелетных ветвей древесных растений с дальнейшей поэтапной стерилизацией в 1%-ном рабочем растворе дезинфицирующего средства на основе гипохлорита натрия (с содержанием активного хлора 5-15%) в течение 30 минут и 5%-ном растворе Лизоформина 3000 в течение 10 минут, и культивируют на питательной среде MS с половинным составом макро- и микросолей с добавлением гиббереллиновой кислоты 0,4 мг/л, а в период покоя индукцию этиолированных побегов проводят в темноте из вегетативных почек, стерилизуют и культивируют на питательной среде MS с полным составом макро- и микросолей с добавлением феруловой кислоты 1 мг/л, 6-бензиламинопурина 1 мг/л, индолилуксусной кислоты 0,5 мг/л, кинетина 0,5 мг/л.

Способ реализуется следующим образом:

Пример 1. Заготовку сегментов ствола или крупных скелетных веток дерева среднего или старшего классов возраста девяти лиственных пород из Дендрологического сада Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова (Crataegus Russanwvii Cin. (72 г.), C. douglasii Lindl (39 л.), C. dahurica Koehne ex Schneid (73 г.), C.chlorosarca Maxim. (71 г.), Acer ukurunduense Trautv. & C.A.Mey. (43 г.), A. tegmentosum Maxim. (44 г.), Juglans mandshurica Maxim. (36 л.), Prunus maackii Rupr. (68 л.), Syringa amurensis Rupr. (40 л.)) проводили в период вегетации и помещали в темное помещение. В течение 7-15 суток из спящих почек при температуре 21-23°С развивались этиолированные побеги, которые использовали в качестве первичных эксплантов.

Стерилизацию первичных эксплантов проводили в два этапа. Первый этап проводили в нестерильных условиях, помещая этиолированные побеги в 1% рабочий раствор дезинфицирующего средства на основе гипохлорита натрия с содержанием активного хлора 5-15% на 30 минут. На втором этапе в асептических условиях ламинар-бокса экспланты перемещали в 5% раствор Лизоформина 3000 на 10-15 минут, после чего трехкратно промывали стерильной дистиллированной водой.

Простерилизованные экспланты в асептических условиях делили на сегменты с 1-2 пазушными почками, помещали в вертикальном или слегка наклонном положении в культуральные сосуды с половинным составом макро- и микросолей (чистый для анализа - ЧДА) питательной среды MS с добавлением гиббереллиновой кислоты (ГК) 0,4 мг/л. Добавление в питательную среду ГК способствует элонгации (доращиванию) индуцированных побегов. Через 15-20 суток побеги пересаживали на среду с полной концентрацией микро- и макросолей для культивирования.

Пример 2. В период покоя с деревьев среднего и старшего классов возраста заготавливали крупные ветки диаметром 1-4 см, помещали их в темное помещение при температуре 21-23°С. В течение 7-15 суток из вегетативных почек развивались этиолированные побеги, используемые в качестве первичных эксплантов.

Стерилизацию первичных эксплантов проводили в два этапа. Первый этап стерилизации проводили в нестерильных условиях в 1% дезинфицирующем растворе гипохлорита натрия в течение 30 минут. На втором этапе в асептических условиях ламинар-бокса экспланты перемещали в 5% раствор Лизоформина 3000 на 10-15 минут, после чего трехкратно промывали стерильной дистиллированной водой.

Простерилизованные экспланты в асептических условиях делили на сегменты с 1-2 пазушными почками, помещали в вертикальном или слегка наклонном положении в культуральные сосуды с питательной средой MS с полным составом макро- и микросолей (ЧДА) с добавлением феруловой кислоты 1 мг/л, 6-бензиламинопурина 1 мг/л, индолилуксусной кислоты 0,5 мг/л, кинетина 0,5 мг/л.

В течение 15-20 суток с начала культивирования в культуральном сосуде формировались побеги, отличающиеся динамичным ростом в высоту с нормально развитыми листовыми пластинками, отсутствием признаков сомаклональной изменчивости. Дальнейшее пассирование в стерильных условиях проводили через 30 суток, для снижения вероятности заражения грибными болезнями исходных эксплантов. В процессе наблюдений периодически визуально контролировали наличие заражения патогенами.

В эксперименте учитывали только жизнеспособные экспланты. В процессе морфогенеза первичных эксплантов определяли способность к регенерации (образованию каллуса) и развитие активных микропобегов. Результаты опытов приведены в табл. 1.

Таблица 1 - Результаты введения этиолированных побегов в асептическую культуру

Название вида Этиолированные побеги из спящих почек, % Этиолированные побеги из вегетативных почек, % регенерирующие микропобеги регенерирующие микропобеги Crataegus Russanwvii Cin. 100 100 100 90 C. douglasii Lindl 100 85 100 80 C. dahurica Koehne ex Schneid 100 95 100 90 C. chlorosarca Maxim. 100 80 100 80 Acer ukurunduense Trautv. & C.A.Mey. 100 40 100 42 A. tegmentosum Maxim. 100 100 100 67 Juglans mandshurica Maxim. 100 33 100 26 Prunus maackii Rupr. 100 95 100 90 Syringa amurensis Rupr. 100 45 100 55

Представленные в таблице результаты опыта показывают, что все жизнеспособные экспланты способны к регенерации и образуют каллусную ткань. 33-100% эксплантов, полученных из спящих почек, и 26-90% эксплантов, полученных из вегетативных почек, способны к морфогенезу и образуют микропобеги, пригодные для дальнейшего культивирования.

Эффективность введения в асептическую культуру этиолированных побегов древесных растений, относящихся к среднему и старшему классам возраста, связана с содержанием в тканях большого количества регуляторов роста и низким содержанием фенольных соединений, что обеспечивает высокую способность к регенерации.

Применение этиолированных побегов древесных растений лиственных пород среднего и старшего классов возраста в качестве первичных эксплантов и стерилизация эксплантов неагрессивными стерилизующими агентами обеспечивают высокую сохранность растительных тканей и исключают необходимость ежедневных многоразовых пассажей эксплантов на питательную среду. Образовавшиеся побеги регенерантов продолжают рост в отличие от стандартных способов введения, где почка только раскрывает кроющие чешуи, но дальше побег не развивается.

Предложенный способ введения в культуру in vitro эксплантов древесных растений среднего и старшего классов возраста позволяет получить растения-регенеранты для последующего их размножения с целью сохранения генофонда исходных материнских форм и расширить коллекционный фонд.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для размножения древесных растений лиственных пород среднего и старшего классов возраста в условиях культуры тканей. Способ клонального микроразмножения включает заготовку ветвей с материнских древесных растений лиственных пород среднего и старшего классов возраста, выгонку этиолированных побегов, отбор первичных эксплантов, их стерилизацию, культивирование на питательной среде на основе макро- и микросолей MS, стерилизацию первичных эксплантов в 1% рабочем растворе дезинфицирующего средства на основе гипохлорита натрия (с содержанием активного хлора 5-15%) и 5% растворе Лизоформина 3000 и культивирование эксплантов на стерильной питательной среде в течение 15-20 суток. Способ введения в культуру in vitro древесных растений лиственных пород среднего и старшего классов возраста позволяет получить растения-регенеранты для последующего их размножения с целью сохранения генофонда исходных материнских форм и расширить коллекционный фонд.

Способ получения асептической культуры in vitro древесных растений лиственных пород среднего и старшего классов возраста в период вегетации или покоя растений, включающий вычленение этиолированного побега клонируемого растения, высадку на питательную среду MS в вертикальном положении и культивирование с пассированием экспланта с интервалом в 14 суток до получения жизнеспособного регенеранта, отличающийся тем, что индукцию этиолированных побегов производят в полной темноте в период вегетации из спящих почек из сегментов ствола или скелетных ветвей древесных растений с дальнейшей поэтапной стерилизацией в 1% рабочем растворе дезинфицирующего средства на основе гипохлорита натрия с содержанием активного хлора 5-15% в течение 30 минут и 5% растворе Лизоформина 3000 в течение 10 минут и культивируют на питательной среде MS с половинным составом макро- и микросолей с добавлением гиббереллиновой кислоты 0,4 мг/л, а в период покоя индукцию этиолированных побегов проводят в темноте из вегетативных почек, стерилизуют и культивируют на питательной среде MS с полным составом макро- и микросолей с добавлением феруловой кислоты 1 мг/л, 6-бензиламинопурина 1 мг/л, индолилуксусной кислоты 0,5 мг/л, кинетина 0,5 мг/л.