Способ получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса различных форм и размеров Российский патент 2024 года по МПК A61K35/14 A61K35/16 A61K35/19 A61K38/36 A61P17/02 A61P19/02 

Область техники

Изобретение относится к области медицины, более конкретно, к регенеративной медицине, травматологии и ортопедии, спортивной медицине, челюстно-лицевой хирургии и другим областям, в которых требуется стимуляция процесса регенерации тканей и внеклеточных образований, основанная на биологических эффектах факторов роста, синтезируемых и секретируемых тромбоцитами, заключенными в фибриновый матрикс, а именно, к способу получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса на основе обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) с большим содержанием тромбоцитов.

Предшествующий уровень техники

Прогресс в области биотехнологий и биомедицины приводит к расширению спектра применения тканевой инженерии, клеточной терапии и аутологичных препаратов на основе компонентов крови с целью стимулирования регенераторных процессов. Одним из востребованных методов, применяемых для повышения биологической активности различных типов клеток, является использование обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП, PRP – platelet-rich plasma), представляющей собой аутологичную, биологически активную производную цельной крови, содержание тромбоцитов в которой составляет 1 миллион и более клеток в 1 микролитре. В последнее годы ОТП все шире применяется во многих отраслях медицины.

Эффективность лечебных технологий с применением обогащенной тромбоцитами плазмы обусловлена тем, что тромбоциты являются источником факторов роста, таких как трансформирующий фактор роста бета (TGF-β1 и β2), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, II), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (PD-EGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и др., оказывающих широкий спектр биологических эффектов, стимулирующих регенераторные процессы на всех уровнях. При этом концентрация ростовых факторов линейно зависит от концентрации тромбоцитов в используемой ОТП. Помимо факторов роста, накапливаемых в α-гранулах, тромбоцит секретирует и другие биоактивные соединения, оказывающие прямое или опосредованное иммуномодулирующее действие, в частности ингибирующие воспалительные и катаболические процессы, хранят антибактериальные и фунгицидные белки, способные предотвращать развитие инфекций.

Концентрация тромбоцитов и их общее количество являются ключевым параметром, определяющими биологический потенциал ОТП, т.к. большинство факторов роста и других биоактивных соединений хранятся в их α- и плотных гранулах. В норме, активная секреция факторов роста инициируется процессом свертывания крови и начинается в течение первых 10 минут. Более 95% накопленных факторов роста секретируются тромбоцитом в течение первого часа. Тем не менее, тромбоциты способны ресинтезировать дополнительные факторы роста на протяжении последующих дней своей жизни. Как только тромбоцит истощается и отмирает, макрофаги, мигрирующие в область благодаря получаемым от тромбоцитов стимулам, частично берут на себя их функции, продолжая секретировать факторы роста. Таким образом, важно наличие жизнеспособных тромбоцитов в составе ОТП, количество которых определяет параметры регенераторного процесса.

Обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс (PRFM - Platelet-rich Fibrin Matrix) - биологически активная производная крови, используемая в различных областях медицины, в частности, в качестве аутологичного соединительнотканного трансплантата при пластике мягких тканей, стимулирования регенерации поврежденного мениска, связочного аппарата, с целью закрытия рецессии десны, в виде мембран при костной пластике, в качестве стимулирующего остеогенез материала при синус-лифтинге и в других областях регенеративной медицины, благодаря эффектам, оказываемым факторами роста и другими биологически активными соединениями, секретируемыми удерживаемыми в фибриновой сети тромбоцитами.

Раскрытие изобретения

Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является разработка простого, клинически высокоэффективного способа получения фибринового матрикса на основе обогащенной тромбоцитами плазмы, являющегося коммерчески выгодной, биологически эффективной аутологичной альтернативой материалам искусственного происхождения, имеющего широкий спектр потенциального применения в различных областях регенеративной медицины.

Для решения поставленной задачи разработан способ получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса различных форм и размеров, включающий следующие этапы:

а) получают обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП),

для этого по меньшей мере в одну пробирку, имеющую форму «песочных часов», помещают свежесобранную стабилизированную кровь пациента; далее пробирку(-и) центрифугируют до разделения стабилизированной крови на три фракции, средняя из которых представляет собой лейкотромбоцитарную взвесь, которую отбирают из пробирки(-ок) с добавлением верхней фракции – плазмы крови, что позволяет сформировать обогащенную тромбоцитами плазму, содержащую не менее 1 млн. тромбоцитов в 1 мкл продукта;

б) получают сыворотку, содержащую тромбин,

- для этого в пробирку, не содержащую наполнитель, помещают свежесобранную цельную кровь этого же пациента,

- далее пробирку центрифугируют до разделения крови на три фракции, верхняя из которых представляет собой плазму,

- после чего пробирку оставляют при комнатной температуре до перехода плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток, что достигается естественным каскадом коагуляции,

- после этого сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин, отделяют от фибринового сгустка;

в) формируют композицию для получения конечного продукта, для чего в емкость выбранной формы и размера добавляют последовательно:

- аутологичную обогащенную тромбоцитами плазму, полученную на этапе а),

- аутологичную сыворотку, содержащую тромбин, полученную на этапе б), и

- раствор кальция глюконата в концентрации 100 мг/мл или раствор кальция хлорида в концентрации 100мг/мл,

при этом объемное соотношение компонентов ОТП : сыворотка, содержащая тромбин : раствор кальция глюконата (кальция хлорида) составляет 16:2:1 - 16:4:2;

г) полученную смесь оставляют при комнатной температуре до образования обогащенного тромбоцитами фибринового сгустка;

д) образовавшийся обогащенный тромбоцитами фибриновый сгусток отжимают от сыворотки до получения фибринового матрикса (фибриновой мембраны).

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения размер и форму емкости выбирают так, чтобы сформированный обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс соответствовал таковым решаемой задачи, то есть дефекту, подлежащему закрытию и/или заполнению, например, размеру горизонтального разрыва мениска, предполагаемого к заполнению с целью стимуляции регенерации ткани.

В некоторых вариантах изобретения на этапе д) производят дополнительное формирование размера и формы фибринового матрикса с целью максимального соответствия размерам и форме дефекта, подлежащего закрытию и/или заполнению.

В некоторых вариантах изобретения на этапе д) отжим от сыворотки производят путем оказания осевой компрессии, при этом критерием завершения отжима является получение фибринового матрикса с минимальным содержанием сыворотки, определяемого по впитыванию сыворотки с поверхности матрикса марлевой салфеткой.

В некоторых вариантах изобретения обеспечивают формирование обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса на выбранном участке аутологичного сухожильного трансплантата, для чего выбранный участок трансплантата помещают в емкость выбранной формы и размера вместе с ОТП на этапе в).

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения стабилизированную кровь получают путем смешивания свежесобранной крови пациента с антикоагулянтом на основе цитрата натрия в соотношении 9:1 по объему. В частных вариантах изобретения антикоагулянт на основе цитрата натрия представляет собой раствор ACD-A или гемоконсервант ЦФГ.

В некоторых вариантах изобретения для достижения целевого объема ОТП используют обогащенную тромбоцитами плазму, полученную по меньшей мере в двух пробирках.

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения на этапе а) и/или б) используют пробирку АРМ - «Пробирка АРМ стерильная для получения обогащенной тромбоцитами плазмы» по ТУ 32.50.50-002-11701993-2021, Регистрационное удостоверение № РЗН 2022/16987 от 25.04.2022.

В некоторых вариантах изобретения на этапах а) и б) центрифугирование осуществляют при относительном центробежном ускорении 990 – 1100 g в течение 4-6 минут.

В частных вариантах изобретения сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин, отделяют от фибринового сгустка путем введения в фибриновый сгусток иглы, одетой на конус шприца, не содержащего наполнитель, производя покачивающие движения иглой с целью выдавливания сыворотки, заключенной в сформированной фибриновой сети сгустка, и далее выполняют последующий забор сыворотки с помощью этого же шприца.

В некоторых вариантах изобретения на этапе б) используют пробирку, имеющую форму «песочных часов», пробирку цилиндрической формы или имеющую форм-фактор шприца.

В некоторых вариантах изобретения на этапе б) переход плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток происходит в течение 5-15 мин.

В некоторых вариантах изобретения образование обогащенного тромбоцитами фибринового сгустка на этапе г) происходит в течение 5-10 мин.

В некоторых вариантах изобретения дополнительно по меньшей мере в одной отдельной пробирке, имеющей форму «песочных часов», получают лейкотромбоцитарную взвесь, которую добавляют к ОТП на этапе а) или одновременно с ОТП при формировании композиции на этапе в).

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения для получения лейкотромбоцитарной взвеси используют пробирку АРМ - «Пробирка АРМ стерильная для получения обогащенной тромбоцитами плазмы» по ТУ 32.50.50-002-11701993-2021, Регистрационное удостоверение № РЗН 2022/16987 от 25.04.2022.

Поставленная задача также решается путем получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса в результате осуществления изложенного способа. В некоторых вариантах осуществления размер и объем получаемого фибринового матрикса могут варьировать в широких пределах – от минимального, необходимого, например, для заполнения лунки после экстракции зуба или закрытия рецессии десны в стоматологии, до матриксов больших размеров (площадью до 25 см² и более), которые могут быть использованы, например, в качестве аутологичного соединительнотканного трансплантата при пластике мягких тканей, а также в виде мембран при костной пластике различной локализации.

Также поставленная задача решается путем применения полученного фибринового матрикса для заполнения дефектов поврежденных тканей. В частных вариантах, поставленная задача решается путем применения полученного обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса в качестве аутологичного соединительнотканного трансплантата при пластике мягких тканей, стимулирования регенерации поврежденного мениска коленного сустава, связочного аппарата, с целью закрытия рецессии десны, в виде мембран при костной пластике, в качестве стимулирующего остеогенез материала при синус-лифтинге и так далее. Помимо травматологии и ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, фибриновые матрицы нашли широкое применение в спортивной медицине, офтальмологии и других областях регенеративной медицины.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:

- разработан простой, высокоэффективный способ получения фибринового матрикса на основе обогащенной тромбоцитами плазмы с большим содержанием тромбоцитов, благодаря чему конечный продукт обладает высоким биологическим и клиническим потенциалом;

- благодаря возможности варьирования исходным объемом ОТП, являющейся основой для формирования фибринового матрикса, способ позволяет варьировать размерами конечного продукта, в первую очередь площадью обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса, а отсутствие ограничений в выборе форм емкости, в которой происходит формирование матрикса, делает возможным получение продукта различной формы (диск, овал и т.д.), исходя из актуальных клинических задач;

- получаемый фибриновый матрикс обладает растяжимостью и эластичностью, что в сочетании с возможностью использовать большие объемы ОТП существенно расширяет области его использования в том числе за счет повышения прочностных характеристик по сравнению с аналогами. Достигается это благодаря возможности использования большего объема субстрата для получения одной и той же желаемой площади поверхности конечного продукта. То есть при необходимости получения матрикса с площадью поверхности, равной 25 см², способ позволяет получить а) цельный матрикс, а не собранный из нескольких матриксов меньшего размера, и б) более толстый - более прочный и более устойчивый к растяжению продукт, в том числе при проведении хирургических манипуляций;

- получаемый фибриновый матрикс устойчив к прошиванию хирургическими нитями, что позволяет обеспечить возможность его подшивания (фиксации) к различным типам тканей организма, исключая тем самым миграции матрикса в интра- и послеоперационном периодах, обеспечить возможность его точного позиционирования при выполнении манипуляций в артроскопической хирургии;

- предложенный способ позволяет не только изготавливать матриксы в виде самодостаточного аутологичного трансплантата, обогащенного тромбоцитами, но и обеспечивать формирование матрикса непосредственно на выбранных участках аутологичных сухожильных трансплантатов, например, при пластике передней или задней крестообразных связок. Достигается это путем расположения участка трансплантата в емкости выбранной формы и размера вместе с ОТП на этапе в) с последующим формированием и бесшовной фиксации биологически активного матрикса на этапах г) и д) непосредственно на сухожильном трансплантате, что существенно повышает регенераторный потенциал, вероятность приживления трансплантата;

- получаемый фибриновый матрикс является коммерчески выгодной, биологически эффективной аутологичной альтернативой материалам искусственного происхождения и имеет широкий спектр потенциального применения в различных областях регенеративной медицины;

- предложенный способ подразумевает получение и использование аутологичного тромбина, что существенно снижает риск возникновения аллергических реакций;

- использование пробирки АРМ, имеющей форму «песочных часов», в процессе получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса, в отличие от пробирок стандартного (цилиндрического) форм-фактора или форм-фактора шприца, обеспечивает дополнительные результаты, связанные с истинно высоким содержанием тромбоцитов (см. таблицу 1), являющихся источником биологически активных соединений, определяющих клинический потенциал и эффективность стимулирования регенераторных процессов;

- в рамках разработанного способа также предлагается дополнительное обогащение получаемого фибринового матрикса тромбоцитами (лейкотромбоцитарной взвесью), получаемыми в дополнительной пробирке, имеющей форму «песочных часов», предпочтительно в пробирке АРМ, что позволяет существенно повысить концентрацию клеток, обеспечивающих пролонгированную секрецию факторов роста и других биоактивных соединений в получаемой композиции, как результат – к усилению стимулирующего действия, направленного на регенерацию тканей, а также иммуномодулирующему, антибактериальному, фунгицидному и другим эффектам в зоне воздействия.

Определения и термины

Следующие термины и определения применяются в данном документе, если иное не указано явно. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п. интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Использование терминов порядка «верхний», «средний», «нижний» в отношении получаемых в пробирках фракций крови подразумевает конкретный порядок, если иное четко не указано в контексте.

Термин «лечение» означает процесс, целью которого является устранение заболевания или травмы, патологического состояния или иного нарушения жизнедеятельности, нормализация нарушенных процессов жизнедеятельности, восстановление и улучшение здоровья. В настоящем документе «лечение» также означает стимулирование восстановления утраченной или поврежденной ткани, смягчение симптомов, ассоциированных с решаемой задачей.

Термины «субъект» и «пациент» охватывают любые виды млекопитающих, более предпочтительно, подразумевают человека.

Под «антикоагулянтом» в настоящем изобретении подразумевают антикоагулянт на основе цитрата натрия, например, такой как ACD-A (антикоагулянт на основе цитрата, включающий декстрозу по формуле А), гемоконсервант ЦФГ (антикоагулянт на основе цитрата, включающий фосфат и глюкозу) или их аналоги.

Термин «обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс» в рамках настоящего изобретения означает натуральную биодеградируемую матрицу (матрикс, мембрану) с высоким содержанием тромбоцитов, образующуюся в результате осуществления последовательности действий, стимулирующих естественный процесс коагуляции с переводом фибриногена обогащенной тромбоцитами плазмы в фибрин посредством воздействия тромбина и кальция. Тромбин отщепляет один или более фибринопептидов, составляющих лишь 3% от белковой массы фибриногена. Расщепление фибриногена тромбином приводит к высвобождению фибринопептидов А и B. Затем происходит спонтанная полимеризация образовавшихся фибрин-мономеров в сгустки, которые стабилизируются свертывающим фактором XIIIа в прочный фибрин-полимер.

Под «конечным продуктом» в рамках настоящего изобретения подразумевается обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс различных форм и размеров.

Под «биологической вариабельностью» в рамках настоящего изобретения подразумеваются различия состава крови пациентов.

В предпочтительных вариантах изобретения под «пробиркой» подразумевается «Пробирка АРМ стерильная для получения обогащенной тромбоцитами плазмы» по ТУ 32.50.50-002-11701993-2021 (Регистрационное удостоверение (РУ) № РЗН 2022/16987 от 25.04.2022) (далее – пробирка АРМ), описанная в патенте «Система стерильная для сепарирования крови и способ получения обогащенной тромбоцитами плазмы из цельной крови» (патент RU2698723, опубл.29.08.2019). Так же под термином «пробирка» может подразумеваться пробирка с формой в виде «песочных часов» или другого форм-фактора, если это предусмотрено в тексте.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 - Забор обогащенной тромбоцитами плазмы из пробирки АРМ.

Фиг. 2 – Пробирка АРМ стерильная для получения обогащенной тромбоцитами плазмы. На рисунке показаны хорошо видимые фракции крови после проведения центрифугирования: верхний слой (фракция) (1) – плазма крови, средний слой (фракция) (2) – лейкотромбоцитарная взвесь, нижний слой (фракция) (3) – эритромасса.

Фиг. 3 – Пример результата формирования обогащенного тромбоцитами фибринового сгустка.

Фиг. 4 – Пример результата получения фибринового матрикса (фибриновой мембраны) из фибринового сгустка после отжима сыворотки.

Фиг. 5 – Измерение растяжимости и эластичности фибринового матрикса.

Фиг. 6 – Застарелый горизонтальный разрыв заднего рога медиального мениска коленного сустава до переноса и фиксации фибринового матрикса.

Фиг. 7А-Б - Процесс подготовки конечного продукта к переносу в зону разрыва мениска.

Фиг. 8 - Фибриновый матрикс расположен в зоне разрыва мениска.

Фиг. 9 - Результат укладки обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксацией зоны разрыва мениска серией V-образных шов.

Подробное описание изобретения

Обогащенная тромбоцитами плазма (ОТП, PRP – platelet-rich plasma) представляет собой аутологичную, биологически активную производную цельной крови, содержание тромбоцитов в которой составляет не менее одного миллиона клеток в 1 микролитре.

Тромбоцит является источником факторов роста, таких как трансформирующий фактор роста бета (TGF-β1 и β2), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, II), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (PD-EGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и др., оказывающих широкий спектр биологических эффектов, стимулирующих регенераторные процессы на всех уровнях. При этом концентрация ростовых факторов линейно зависит от концентрации тромбоцитов в используемой ОТП. Помимо факторов роста, накапливаемых в α-гранулах, тромбоцит секретирует и другие биоактивные соединения, оказывающие прямое или опосредованное иммуномодулирующее действие, в частности ингибирующие воспалительные и катаболические процессы, хранят антибактериальные и фунгицидные белки, способные предотвращать развитие инфекций.

Концентрация тромбоцитов и их общее количество являются ключевым параметром, определяющими биологический потенциал ОТП, т.к. большинство факторов роста и других биоактивных соединений хранятся в их α- и плотных гранулах. В норме, активная секреция факторов роста инициируется процессом свертывания крови и начинается в течение первых 10 минут. Более 95% накопленных факторов роста секретируются тромбоцитом в течение первого часа. Тем не менее, тромбоциты способны ресинтезировать дополнительные факторы роста на протяжение последующих дней своей жизни. Как только тромбоцит истощается и отмирает, макрофаги, мигрирующие в область благодаря получаемым от тромбоцитов стимулам, частично берут на себя их функции, продолжая секретировать факторы роста. Таким образом, важно наличие жизнеспособных тромбоцитов в составе ОТП, количество которых определяет параметры регенераторного процесса.

Обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс (PRFM - Platelet-rich Fibrin Matrix) - биологически активная производная крови, используемая в различных областях медицины, в частности, в качестве аутологичного соединительнотканного трансплантата при пластике мягких тканей, стимулирования регенерации поврежденного мениска коленного сустава, связочного аппарата, с целью закрытия рецессии десны, в виде мембран при костной пластике, в качестве стимулирующего остеогенез материала при синус-лифтинге и так далее благодаря эффектам, оказываемым факторами роста и другими биологически активными соединениями, секретируемыми удерживаемыми в фибриновой сети тромбоцитам. Помимо травматологии и ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, фибриновые матрицы нашли широкое применение в спортивной медицине, офтальмологии и других областях регенеративной медицины.

В рамках настоящего изобретения разработан простой, клинически высокоэффективный способ получения на основе ОТП фибринового матрикса, являющегося коммерчески выгодной, биологически эффективной аутологичной альтернативой материалам искусственного происхождения, имеющим широкий спектр потенциального применения в различных областях регенеративной медицины.

Предлагаемый способ был разработан в рамках экспериментальной клинической работы, направленной на разрешение задачи, результат которой максимально отвечает требованиям клинической практики – возможность интраоперационного получения многоцелевого, биодеградируемого, стимулирующего регенеративные процессы устойчивого к прошиванию хирургическими нитями трансплантата желаемых форм и размеров, являющегося биологически эффективной аутологичной альтернативой мембранам искусственного происхождения.

В известных из уровня техники методах для получения плазмы используются пробирки стандартного (цилиндрического) форм-фактора или форм-фактора шприца, таким образом субстратом для формирования фибринового сгустка выступает бедная тромбоцитами плазма (БТП или Platelet-poor plasma), «очищенная» от клеток во время центрифугирования, что существенно снижает биологический потенциал конечного продукта.

В отличие от этого, в предлагаемом способе субстратом для получения фибринового матрикса выступает ОТП, как это подробно описано ниже, что, в совокупности с другими приемами способа обеспечивает существенные преимущества получаемого обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса, обуславливает эффективность его использования независимо от локализации применения и решаемых задач.

Таким образом, преимущества, которыми обладает получаемый продукт, обеспечиваются комбинацией разработанных приемов способа его получения, метода их выполнения.

Важно отметить, что результаты применения фибринового матрикса очень сильно зависят от свойств и качественных характеристик продукта, например, от клеточного состава биологически активной композиции, который, в свою очередь, очень сильно зависит от способа его получения, влияющего на эффективность и клинический результат (результирующее качество).

Предлагаемый способ получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса включает следующие этапы:

а) Получают обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП).

Для этого в пробирку, имеющую форму «песочных часов» (например: пробирка АРМ), помещают стабилизированную кровь (смесь свежесобранной цельной крови пациента и антикоагулянта на основе цитрата натрия в соотношении 9:1 по объему). Далее пробирку центрифугируют до разделения (сепарирования) стабилизированной крови на три фракции, средняя из которых представляет собой лейкотромбоцитарную взвесь (лейкотромбоцитарный слой), которую отбирают из пробирки вместе с необходимым количеством верхней фракции – плазмы крови, что позволяет получить (сформировать) обогащенную тромбоцитами плазму, содержащую не менее 1 млн. тромбоцитов в 1 мкл продукта (см. Фиг. 1).

Необходимое количество ОТП определяют исходя из целевого размера конечного продукта. Т.к. рабочий объем пробирки АРМ ограничен и составляет 15 мл, для достижения целевого объема фибринового матрикса возможно использование обогащенной тромбоцитами плазмы, полученной одновременно в одной, двух, трех и более пробирках АРМ. Благодаря этому размер и объем получаемого фибринового матрикса могут варьировать в широких пределах – от минимального, необходимого, например, для заполнения лунки после экстракции зуба или закрытия рецессии десны в стоматологии, до цельных матриксов больших размеров (25 см² и более), которые могут быть использованы, например, в качестве аутологичного соединительнотканного трансплантата при пластике мягких тканей, а также в виде мембран при костной пластике различной локализации. Кроме того, возможность использования больших объемом ОТП при получении продукта с одной и той же площадью поверхности существенно расширяет возможности его применения за счет повышения прочностных характеристик по сравнению с аналогами, повышает удобство и комфорт манипулирования продуктом.

б) Получают аутологичную сыворотку, содержащую тромбин. Этот этап может выполняться одновременно с этапом а) или непосредственно следом за ним.

Для этого в другую пробирку (возможно использование пробирок, имеющих различный форм-фактор, например стерильной пробирки с крышкой, в том числе вакуумной, имеющей цилиндрическую форму или форм-фактор шприца; пробирки, имеющей форму «песочных часов», в том числе пробирки АРМ, и др. Основными критериями являются: отсутствие антикоагулянта или какого-либо другого наполнителя, а также возможность доступа к фибриновому сгустку с целью получения сыворотки) помещают свежесобранную цельную кровь этого же пациента. Далее пробирку центрифугируют до разделения крови на три фракции, верхняя из которых представляет собой плазму. После этого пробирку оставляют при комнатной температуре до перехода плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток, что достигается естественным каскадом коагуляции (переход плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток происходит в течение 5-15 мин, что зависит от объема используемой пробирки, биологической вариабельности). После этого сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин, отделяют от фибринового сгустка.

Для отделения сыворотки, содержащей образовавшийся тромбин, в фибриновый сгусток вводят иглу, одетую на конус шприца, не содержащего наполнитель, производят покачивающие движения иглой с целью выдавливания сыворотки, заключенной в сформированной фибриновой сети сгустка, выполняют последующий забор сыворотки с помощью этого же шприца. Для этого может быть использована любая удобная игла, уместная для проведения манипуляции, соразмерная с размером используемой на этапе б) пробирки.

в) Формирование композиции для получения конечного продукта.

В лоток или другую емкость выбранной формы и размера добавляют последовательно, равномерно распределяя, обогащенную тромбоцитами плазму, в объеме, достаточном для получения желаемого размера фибринового матрикса, сыворотку, содержащую тромбин, и раствор кальция глюконата (или кальция хлорида) (в концентрации 100 мг/мл) в соотношении ОТП : сыворотка, содержащая тромбин : раствор кальция глюконата (кальция хлорида) 16:2:1 – 16:4:2 по объему.

Так как предложенный способ позволяет не только изготавливать матриксы в виде самодостаточного аутологичного трансплантата, обогащенного тромбоцитами, но и обеспечивать возможность формирования матрикса непосредственно на выбранных участках аутологичных сухожильных трансплантатов, например, при пластике передней или задней крестообразных связок, на данном этапе возможно расположение выбранного участка трансплантата в емкости выбранной формы и размера вместе с ОТП на этапе в) с последующим формированием и бесшовной фиксации биологически активного матрикса на этапах г) и д) непосредственно на сухожильном трансплантате, что существенно повышает регенераторный потенциал, вероятность приживления трансплантата.

г) Формирование фибринового сгустка.

Полученную смесь оставляют при комнатной температуре до образования обогащенного тромбоцитами фибринового сгустка. Время формирования фибриновой сети зависит от биологической вариабельности и обычно занимает 5-10 мин.

д) Формирование конечного продукта.

Образовавшийся обогащенный тромбоцитами фибриновый сгусток отжимают от сыворотки до получения конечного продукта - фибринового матрикса (фибриновой мембраны). Отжим от сыворотки производится путем оказания осевой компрессии (давления (руки, небольшого груза), оказываемой сверху). Критерием завершения отжима является получение фибринового матрикса с минимальным содержанием сыворотки, впитываемой марлевой салфеткой. На этапе формирования конечного продукта также может быть скорректирована форма подготовленного матрикса. Такая корректировка формы может быть произведена, например, вручную или с помощью хирургических инструментов в зависимости от решаемой задачи, размера и формы дефекта и т.д.

В предпочтительных вариантах изобретения получение обогащенной тромбоцитами плазмы осуществляют при использовании пробирки АРМ (см. Фиг. 2).

Пробирка АРМ представляет собой медицинское изделие, специально разработанное для получения обогащенной тромбоцитами плазмы из цельной или стабилизированной крови пациента (см. патент RU2698723, опубл.29.08.2019; РУ № РЗН 2022/16987 от 25.04.2022). В отличие от пробирок с разделительным гелем, заложенные технические решения и форм-фактор изделия позволяют сепарировать кровь на 3 видимые, возможные для забора фракции: плазма, лейкотромбоцитарная взвесь (лейкотромбоцитарный слой) клеток и эритромасса (см. Фиг.2). Эргономика пробирки, наличие информационных рисок и ключа-подставки, позволяющего менять положение поршня, а, следовательно, и границу лейкотромбоцитарного слоя, обеспечивают возможность формирования и удобство забора истинной обогащенной тромбоцитами плазмы с максимальным содержанием тромбоцитов, достигающим 2,4 миллионов и более клеток в 1 микролитре, что определяет биологический потенциал и клиническую эффективность продукта. Сепарирование крови достигается методом центрифугирования при использовании указанных параметров: относительное центробежное ускорение 990 – 1100 g, время ~ 4-6 мин. Однако, учитывая биологическую вариабельность, возможно проведение повторного центрифугирования с добавлением достаточного времени, необходимого для достижения сепарирования крови, выделения лейкотромбоцитарного слоя.

Использование дополнительной пробирки АРМ, в совокупности с технической возможностью выделения и забора каждой из фракций по отдельности, обеспечивает возможность дополнительного обогащения конечного продукта тромбоцитами путем переноса лейкотромбоцитарной взвеси (концентрат искомых клеток), что позволяет существенно повысить содержание клеток, обеспечивающих пролонгированную секрецию факторов роста и других биоактивных соединений в получаемой композиции, как результат – к усилению стимулирующего действия, направленного на регенерацию окружающих тканей, процессы репаративной регенерации сухожильной ткани, остеогенеза (или хондрогенеза), иммуномодулирующему, антибактериальному, фунгицидному и др. эффектам в зоне воздействия.

Получение лейкотромбоцитарной взвеси осуществляют в дополнительной пробирке АРМ одновременно с проведением этапа а). Для этого, в отличие от этапа а), после центрифугирования из пробирки АРМ забирают не лейкотромбоцитарную взвесь (лейкотромбоцитарный слой) с плазмой крови, а только лейкотромбоцитарную взвесь. Перенос лейкотромбоцитарной взвеси осуществляют либо на этапе а) - для повышения концентрации искомых клеток в полученной ОТП, либо на этапе в) путем добавления ее вместе с обогащенной тромбоцитами плазмой.

Возможность объективного проявления технического результата при осуществлении изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными ниже в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Следует понимать, что приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Пример 1. Получение обогащенной тромбоцитами плазмы в пробирке АРМ

Получение обогащенной тромбоцитами плазмы в пробирке АРМ производилось по методике, описанной в патенте RU2698723.

Результаты измерения концентрации тромбоцитов в полученной ОТП приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Концентрация тромбоцитов в отобранном объеме 1-2 мл ОТП,

полученной в пробирке АРМ

Тест Результат (содержание тромбоцитов (PLT))
в объеме 1-2 мл Единицы измерения Референсные значения содержания тромбоцитов в цельной крови 1 2373 х10³/мкл 180-320 2 2440 х10³/мкл 180-320 3 2077 х10³/ мкл 180-320 4 2341 х10³/мкл 180-320 5 2085 х10³/ мкл 180-320 6 1792 х10³/ мкл 180-320 7 1944 х10³/ мкл 180-320 8 1722 х10³/ мкл 180-320 9 1525 х10³/ мкл 180-320 10 1485 х10³/ мкл 180-320

Как следует из приведенных данных (результатов лабораторных исследований), содержание тромбоцитов в 1 микролитре ОТП может достигать 2 440 000 клеток, что свидетельствует о значимом биологическом потенциале ОТП, полученной в пробирке АРМ.

Пример 2. Получение обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса

Эксперимент был проведен в 3-х повторах (тестах), т.е. при проведении эксперимента была использована свежесобранная кровь 3-х пациентов.

Этап 1: ОТП получали в пробирке АРМ по методике, описанной в патенте РФ на изобретение № 2698723.

Концентрация тромбоцитов в ОТП для каждого из тестируемых образцов приведена в Таблице 2.

Таблица 2. Концентрация тромбоцитов в отобранном объеме 6 мл ОТП,

полученной в пробирке АРМ

Тест Результат (содержание тромбоцитов (PLT)) в объеме 6 мл Единицы измерения 1 1201 х10³/мкл 2 1184 х10³/мкл 3 1253 х10³/ мкл

Забор необходимого объема ОТП производился с использованием шприца объемом 10 мл.

Этап 2: получали сыворотку, содержащую тромбин.

Получение сыворотки, содержащей тромбин, также выполнялось в пробирке АРМ по схожему с получением обогащенной тромбоцитами плазмы алгоритму, но имеющему ряд значимых отличий, главным из которых является отсутствие использования антикоагулянта. Методика включает в себя следующие подэтапы:

1. Производится венепункция с последующим забором 15 мл цельной венозной крови в шприц, не содержащий наполнитель.

2. Игла, длина которой составляет 40 мм и более, надетая на конус используемого шприца, содержащего венозную кровь, вводится до упора через универсальное отверстие крышки пробирки АРМ таким образом, чтобы она была центрована в перешейке колбы, после чего производится наполнение пробирки кровью до достижения метки МАХ, ограничивающей начальный рабочий объем пробирки, равный 15 мл.

3. Игла вынимается из пробирки АРМ, отверстие крышки закрывается заглушкой, после чего из поршня пробирки вынимается ключ-подставка. Пробирка АРМ готова к центрифугированию.

4. Пробирка АРМ располагается в свободном стакане бакет-ротора центрифуги напротив соответствующей пробирки-противовеса, производится процесс центрифугирования при относительном центробежном ускорении 990–1100 g до разделения крови на фракции (плазма, лейкотромбоцитарная взвесь клеток (ЛТС), эритроцитарная масса) – около 4-6 минут. Учитывая биологическую вариабельность, возможно проведение повторного центрифугирования с добавлением достаточного времени, необходимого для достижения сепарирования венозной крови в границах или ниже перешейка пробирки АРМ.

5. Пробирка АРМ вынимается из центрифуги и устанавливается на ключ-подставку, что обеспечивает устойчивое положение пробирки при опоре на гладкую поверхность.

6. Необходимо убедиться, что обогащенная тромбоцитами плазма сохраняет текучее состояние, немного наклонив пробирку. В зависимости от уровня расположения ЛТС, вращением ключа-подставки по или против часовой стрелки выполняется управление резьбовым ходом поршня с целью выравнивания уровня нижней границы ЛТС (границы искомого слоя клеток) или верхней границы эритроцитарной массы по центральной риске перешейка пробирки АРМ.

7. Далее необходимо дождаться перехода плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток, что достигается естественным каскадом коагуляции.

8. После образования фибринового сгустка необходимо отделить от него сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин. Для этого следует открыть центральное отверстие крышки пробирки АРМ, после чего ввести через него в сгусток иглу, одетую на конус шприца, не содержащего наполнитель. Длина иглы может составляет 30 и более мм. Для отделения сыворотки необходимо произвести покачивающие движения иглой, что приведет к выдавливанию сыворотки, заключенной в сформированной фибриновой сети сгустка.

Поскольку крышка пробирки АРМ снабжена резьбой, выдавливание сыворотки иглой и последующий забор сыворотки может производиться при снятой крышке.

9. Производится забор необходимого количества сыворотки, содержащей тромбин.

Средний достаточный объем необходимой к забору сыворотки рассчитывался из соотношения: 1-2 части сыворотки к 8 частям ОТП (т.е. на 8 мл ОТП – 1-2 мл сыворотки).

Этап 3: необходимый объем раствора кальция глюконата (в концентрации 100 мг/мл) набирали в шприц, не содержащий наполнитель.

Средний достаточный объем необходимого к забору раствора кальция глюконата рассчитывался из соотношения: 1-2 часть раствора к 16 частям ОТП (т.е. на 8 мл ОТП – 0.5-1.0 мл раствора кальция глюконата).

Этап 4: сформировали фибриновый сгусток.

Для этого в лоток выбранной формы и размера добавили последовательно, равномерно распределяя, ОТП в объеме, достаточном для получения фибринового матрикса желаемого размера, сыворотку, содержащую тромбин, и раствор кальция глюконата.

После этого дожидались формирования обогащенного тромбоцитами фибринового сгустка (Фиг.3).

Этап 5: сформировали конечный продукт.

Образовавшийся обогащенный тромбоцитами фибриновый сгусток отжали от сыворотки до получения конечного продукта - обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса (фибриновой мембраны) (Фиг.4). Отжим сыворотки производился между двумя стерильными марлевыми салфетками путем оказания осевой компрессии (давления руки) сверху до тех пор, пока в сформированном фибриновом матриксе количество сыворотки не достигло минимального количества, определяемого по впитыванию марлевой салфеткой.

С целью оценки количества тромбоцитов в конечном продукте (фибриновом матриксе), для каждого из тестируемых образцов было проведено измерение концентрации тромбоцитов в сыворотке, отделенной при отжиме фибринового сгустка в процессе получения конечного продукта. Как показали проведенные измерения, в отделенной сыворотке содержатся лишь следовые количества тромбоцитов (см. Таблицу 3).

Таблица 3. Концентрация тромбоцитов в сыворотке,

отделяемой при отжиме фибринового сгустка

Тест Содержание тромбоцитов в ОТП Содержание тромбоцитов в отделенной сыворотке Единицы измерения 1 1201 0 х10³/мкл 2 1184 1 х10³/мкл 3 1253 1 х10³/ мкл

Таким образом, как следует из приведенных данных (результатов лабораторных исследований), тромбоциты, захваченные фибриновой сетью при формировании фибринового сгустка, остаются в фибриновом матриксе, не вымываясь вместе с сывороткой при получении конечного продукта. Это подтверждает высокий биологический и клинический потенциал фибринового матрикса по изобретению, обеспечиваемый, с одной стороны, за счет высокой концентрации тромбоцитов в получаемой ОТП, а с другой – за счет применяемых приемов способа, обеспечивающих сохранение тромбоцитов в конечном продукте. Более того, благодаря тому, что предлагаемый способ позволяет обеспечить дополнительное обогащение получаемого конечного продукта искомыми клетками на этапе его формирования (благодаря технической возможности выделения, забора и отдельного переноса лейкотромбоцитарной взвеси клеток, получаемой в пробирке АРМ), это позволяет дополнительно существенно повысить содержание тромбоцитов в конечном продукте.

Поскольку, как известно, тромбоциты обеспечивают пролонгированную секрецию факторов роста и других биоактивных соединений, результатом высокого содержания тромбоцитов в фибриновом матриксе по изобретению является выраженное стимулирующее действие фибринового матрикса на регенерацию окружающих тканей, а также иммуномодулирующий, антибактериальный, фунгицидный и другие стимулирующие эффекты в зоне воздействия.

Пример 3. Измерение растяжимости и эластичности фибринового матрикса

При проведении эксперимента был использован фибриновый матрикс, полученный согласно методу, описанному в Примере 2. Для проведения измерения был отделен фибриновый сгусток объемом 7 - 8 см³, площадь контактирующей с салфеткой поверхности составила около 4.3 см². После отжима фибринового сгустка от сыворотки, фибриновый матрикс имел примерно ту же площадь контактирующей поверхности (Фиг.5). Так как выбранная форма емкости имела форму круга, площадь контактирующей поверхности рассчитывалась по форме S = π*r².

Полученный фибриновый матрикс в форме круга был подвергнут растяжению на линейке при использовании двух зажимов Бильрота. В процессе эксперимента фибриновый матрикс удалось растянуть примерно на 25-30%, что свидетельствует о том, что матрикс по изобретению является достаточно прочным, растяжимым и эластичным.

Поскольку согласно предлагаемому способу процесс формирования обогащенного тромбоцитами фибринового сгустка из субстрата проводится в отдельной емкости выбранного размера и формы, соизмеримыми с решаемой задачей, и, по сути, ограничения объема субстрата практически отсутствуют, размер цельного матрикса может достигать 25 см² и более, что существенно расширяет области его использования по сравнению с аналогами.

Пример 4. Применение обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с целью создания оптимальных условий для восстановления целостности и ускорения регенерации мениска коленного сустава

В рамках проведенных клинических исследований фибриновый матрикс по изобретению был использован при лечении горизонтального разрыва заднего рога медиального мениска коленного сустава пациента.

На Фиг.6 показана зона дефекта – застарелый горизонтальный разрыв заднего рога медиального мениска коленного сустава.

Обогащенный тромбоцитами фибриновый сгусток, полученный как описано в Примере 2 (до этапа 4 включительно), был выложен на стерильную марлевую салфетку и отжат от сыворотки. Для получения подходящего размера матрикса был выбран объем обогащенной тромбоцитами плазмы, равный 16 мл, полученный при использовании нескольких пробирок АРМ. На этапе формирования обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса, во время и после отжима сыворотки из обогащенного тромбоцитами фибринового сгустка, была также скорректирована форма конечного продукта в соответствии с размерами дефекта мениска (Фиг. 7А). В процессе подготовки матрикса к переносу в зону разрыва мениска, края матрикса были прошиты хирургическими нитями с целью обеспечения возможности его точного позиционирования при выполнении артроскопических манипуляций (см. Фиг. 7Б).

После этого подготовленный конечный продукт был перенесен и уложен в зону разрыва мениска (Фиг. 8).

На завершающем этапе операции зона разрыва мениска с уложенным фибриновым матриксом была зафиксирована серией V-образных швов (см. Фиг. 9). Произведено послойное ушивание послеоперационных ран наглухо, наложена аспептическая повязка.

Исход операции: созданы оптимальные условия для купирования болевого синдрома, восстановления мениска, функции нижней конечности. Ранний послеоперационный период протекал без особенностей и осложнений. Пациент выписан из больницы в удовлетворительном состоянии, с рекомендацией последующего наблюдения врачом травматологом-ортопедом.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что предложенный способ получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса отвечает требованиям клинической практики – возможность интраоперационного формирования многоцелевого, биодеградируемого, стимулирующего регенеративные процессы, устойчивого к прошиванию хирургическими нитями трансплантата желаемых форм и размеров, являющегося биологически эффективной аутологичной альтернативой материалам искусственного происхождения.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к области регенеративной медицины, а именно, к способу получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса. Способ получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса включает следующие этапы: а) получение обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП), для этого по меньшей мере в одну пробирку, имеющую форму «песочных часов», помещают свежесобранную стабилизированную кровь пациента; далее пробирку(-и) центрифугируют до разделения стабилизированной крови на три фракции, средняя из которых представляет собой лейкотромбоцитарную взвесь, которую отбирают из пробирки(-ок) с добавлением верхней фракции – плазмы крови, что позволяет сформировать обогащенную тромбоцитами плазму, содержащую не менее 1 млн тромбоцитов в 1 мкл продукта; б) получение сыворотки, содержащей тромбин, для этого в пробирку, не содержащую наполнитель, помещают свежесобранную цельную кровь этого же пациента, далее пробирку центрифугируют до разделения крови на три фракции, верхняя из которых представляет собой плазму, после чего пробирку оставляют при комнатной температуре до перехода плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток, что достигается естественным каскадом коагуляции, после этого сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин, отделяют от фибринового сгустка; в) формирование композиции для получения конечного продукта, для чего в ёмкость выбранной формы и размера, добавляют последовательно: аутологичную обогащенную тромбоцитами плазму, полученную на этапе а), аутологичную сыворотку, содержащую тромбин, полученную на этапе б), и раствор кальция глюконата в концентрации 100 мг/мл или раствор кальция хлорида в концентрации 100 мг/мл, при этом объемное соотношение компонентов ОТП : сыворотка, содержащая тромбин : раствор кальция глюконата или кальция хлорида составляет 16:2:1 - 16:4:2; г) полученную смесь оставляют при комнатной температуре до образования обогащенного тромбоцитами фибринового сгустка; д) образовавшийся обогащенный тромбоцитами фибриновый сгусток отжимают от сыворотки до получения фибринового матрикса. Использование изобретения позволяет получить обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс, отвечающий требованиям клинической практики - возможность интраоперационного формирования многоцелевого, биодеградируемого, стимулирующего регенеративные процессы, устойчивого к прошиванию хирургическими нитями трансплантата желаемых форм и размеров, являющегося биологически эффективной аутологичной альтернативой материалам искусственного происхождения. 15 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 4 пр.

1. Способ получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса, включающий следующие этапы:

а) получают обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП),

для этого по меньшей мере в одну пробирку, имеющую форму «песочных часов», помещают свежесобранную стабилизированную кровь пациента; далее пробирку(-и) центрифугируют до разделения стабилизированной крови на три фракции, средняя из которых представляет собой лейкотромбоцитарную взвесь, которую отбирают из пробирки(-ок) с добавлением верхней фракции – плазмы крови, что позволяет сформировать обогащенную тромбоцитами плазму, содержащую не менее 1 млн тромбоцитов в 1 мкл продукта;

б) получают сыворотку, содержащую тромбин,

- для этого в пробирку, не содержащую наполнитель, помещают свежесобранную цельную кровь этого же пациента,

- далее пробирку центрифугируют до разделения крови на три фракции, верхняя из которых представляет собой плазму,

- после чего пробирку оставляют при комнатной температуре до перехода плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток, что достигается естественным каскадом коагуляции,

- после этого сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин, отделяют от фибринового сгустка;

в) формируют композицию для получения конечного продукта, для чего в ёмкость выбранной формы и размера, добавляют последовательно:

- аутологичную обогащенную тромбоцитами плазму, полученную на этапе а),

- аутологичную сыворотку, содержащую тромбин, полученную на этапе б), и

- раствор кальция глюконата в концентрации 100 мг/мл или раствор кальция хлорида в концентрации 100 мг/мл,

при этом объемное соотношение компонентов ОТП : сыворотка, содержащая тромбин : раствор кальция глюконата или кальция хлорида составляет 16:2:1 - 16:4:2;

г) полученную смесь оставляют при комнатной температуре до образования обогащенного тромбоцитами фибринового сгустка;

д) образовавшийся обогащенный тромбоцитами фибриновый сгусток отжимают от сыворотки до получения фибринового матрикса.

2. Способ по п. 1, в котором размер и форму емкости на этапе в) выбирают так, чтобы сформированный обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс соответствовал таковым дефекта, подлежащего закрытию и/или заполнению.

3. Способ по п. 1, в котором на этапе д) производят дополнительное формирование размера и формы фибринового матрикса с целью максимального соответствия размерам и форме дефекта, подлежащего закрытию и/или заполнению фибриновым матриксом.

4. Способ по п. 1, в котором на этапе д) отжим от сыворотки производят путем оказания осевой компрессии, при этом критерием завершения отжима является получение фибринового матрикса с минимальным содержанием сыворотки, впитываемой марлевой салфеткой.

5. Способ по п. 1, в котором стабилизированную кровь получают путем смешивания свежесобранной крови пациента с антикоагулянтом на основе цитрата натрия в соотношении 9:1 по объему.

6. Способ по п. 5, в котором антикоагулянт на основе цитрата натрия представляет собой раствор ACD-A или гемоконсервант ЦФГ.

7. Способ по п. 1, в котором для достижения целевого объема ОТП используют обогащенную тромбоцитами плазму, полученную по меньшей мере в двух пробирках.

8. Способ по п. 1, в котором на этапе а) и/или б) используют пробирку АРМ.

9. Способ по п. 8, в котором на этапах а) и б) центрифугирование осуществляют при относительном центробежном ускорении 990–1100 g в течение 4-6 минут.

10. Способ по п. 1, в котором сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин, отделяют от фибринового сгустка путем введения в фибриновый сгусток иглы, одетой на конус шприца, не содержащего наполнитель, производя покачивающие движения иглой с целью выдавливания сыворотки, заключенной в сформированной фибриновой сети сгустка, и далее выполняют последующий забор сыворотки с помощью этого же шприца.

11. Способ по п. 1, в котором на этапе б) используют пробирку, имеющую форму «песочных часов», пробирку цилиндрической формы или пробирку, имеющую форм-фактор шприца.

12. Способ по п. 1, в котором на этапе б) переход плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток происходит в течение 5-15 мин.

13. Способ по п. 1, в котором образование обогащенного тромбоцитами фибринового сгустка на этапе г) происходит в течение 5-10 мин.

14. Способ по п. 1, в котором дополнительно по меньшей мере в одной отдельной пробирке, имеющей форму «песочных часов», получают лейкотромбоцитарную взвесь, которую добавляют к в ОТП на этапе а) или одновременно с ОТП при формировании композиции на этапе в).

15. Способ по п. 14, в котором для получения лейкотромбоцитарной взвеси используют пробирку АРМ.

16. Способ по п. 1, в котором обеспечивают формирование обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса на выбранном участке аутологичного сухожильного трансплантата, для чего выбранный участок трансплантата помещают в емкость выбранной формы и размера вместе с ОТП на этапе в).