Способ получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани Российский патент 2023 года по МПК C12N1/00 C12N5/00 A61K35/14 

Область техники

Изобретение относится к области медицины, более конкретно, к регенеративной медицине, травматологии и ортопедии, спортивной медицине, челюстно-лицевой хирургии и другим областям, в которых применим метод стимуляции процесса регенерации тканей и внеклеточных образований, основанный на биологических эффектах факторов роста, синтезируемых и секретируемых тромбоцитами, заключенными в фибриновый матрикс, а именно, к способу получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани.

Предшествующий уровень техники

Прогресс в области биотехнологий и биомедицины приводит к расширению спектра применения тканевой инженерии, клеточной терапии и аутологичных препаратов на основе компонентов крови с целью стимулирования регенераторных процессов. Одним из востребованных методов, применяемых для повышения биологической активности различных типов клеток, является использование обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП, PRP - platelet-rich plasma), представляющей собой аутологичную, биологически активную производную цельной крови, содержание тромбоцитов в которой составляет 1 и более млн. клеток в 1 микролитре. В последнее годы ОТП все шире применяется во многих отраслях медицины.

Эффективность лечебных технологий с применением обогащенной тромбоцитами плазмы обусловлена тем, что тромбоциты являются источником факторов роста, таких как трансформирующий фактор роста бета (TGF-β1 и β2), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, II), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (PD-EGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и др., оказывающих широкий спектр биологических эффектов, стимулирующих регенераторные процессы на всех уровнях. При этом концентрация ростовых факторов линейно зависит от концентрации тромбоцитов в используемой ОТП. Помимо факторов роста, накапливаемых в α-гранулах, тромбоцит секретирует и другие биоактивные соединения, оказывающие прямое или опосредованное иммуномодулирующее действие, в частности ингибирующие воспалительные и катаболические процессы, хранят антибактериальные и фунгицидные белки, способные предотвращать развитие инфекций.

Концентрация тромбоцитов и их общее количество являются ключевым параметром, определяющими биологический потенциал ОТП, т.к. большинство факторов роста и других биоактивных соединений хранятся в их α- и плотных гранулах. В норме, активная секреция факторов роста инициируется процессом свертывания крови и начинается в течение первых 10 минут. Более 95% накопленных факторов роста секретируются тромбоцитом в течение первого часа. Тем не менее, тромбоциты способны ресинтезировать дополнительные факторы роста на протяжение последующих дней своей жизни. Как только тромбоцит истощается и отмирает, макрофаги, мигрирующие в область благодаря получаемым от тромбоцитов стимулам, частично берут на себя их функции, продолжая секретировать факторы роста. Таким образом, важно наличие жизнеспособных тромбоцитов в составе ОТП, количество которых определяет параметры регенераторного процесса.

Обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс (PRFM - Platelet-rich Fibrin Matrix) - биологически активная производная крови, используемая, в частности, для заполнения дефектов костной ткани и ускорения ее регенерации за счет стимулирования миграции недифференцированных остеогенных и других типов клеток. Помимо травматологии и ортопедии, фибриновые матрицы нашли широкое применение в спортивной медицине, офтальмологии, челюстно-лицевой хирургии и других областях регенеративной медицины.

Раскрытие изобретения

Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является разработка простого, клинически высокоэффективного способа получения фибринового матрикса на основе обогащенной тромбоцитами плазмы, позволяющего эффективно фиксировать в фибриновой сети остеозамещающий материал или аутокрошку из костной или хрящевой ткани, предотвращая ее миграцию в интра- и послеоперационном периодах.

Для решения поставленной задачи был разработан способ получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани, включающий следующие этапы:

а) получают обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП),

для этого по меньшей мере в одну в пробирку, имеющую форму «песочных часов», помещают свежесобранную стабилизированную кровь пациента; далее пробирку(-и) центрифугируют до разделения стабилизированной крови на три фракции, средняя из которых представляет собой лейкотромбоцитарную взвесь, которую отбирают из пробирки(-ок) с добавлением верхней фракции - плазмы крови, что позволяет сформировать обогащенную тромбоцитами плазму, содержащую не менее 1 млн. тромбоцитов в 1 мкл продукта;

б) получают сыворотку, содержащую тромбин,

- для этого в пробирку, не содержащую наполнитель, помещают свежесобранную цельную кровь этого же пациента,

- далее пробирку центрифугируют до разделения на три фракции, верхняя из которых представляет собой плазму,

- после чего пробирку оставляют при комнатной температуре до перехода плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток, что достигается естественным каскадом коагуляции,

- после этого сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин, отделяют от фибринового сгустка;

в) формируют композицию для получения конечного продукта,

остеозамещающий материал или аутокрошку из костной или хрящевой ткани, соответственно (далее: «материал»), размещают в лотке или емкости выбранной формы, добавляют последовательно:

- аутологичную обогащенную тромбоцитами плазму, полученную на этапе а),

- аутологичную сыворотку, содержащую тромбин, полученную на этапе б), и

- раствор кальция глюконата в концентрации 100 мг/мл или раствор кальция хлорида в концентрации 100мг/мл,

при этом объемное соотношение компонентов ОТП : сыворотка, содержащая тромбин : раствор кальция глюконата (кальция хлорида) составляет 16:2:1 - 16:4:2;

г) полученную смесь оставляют при комнатной температуре до образования обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети «материалом».

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения размер и форму лотка или емкости выбирают так, чтобы сформированный обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани соответствовал таковым дефекта, соответственно, костной или хрящевой ткани, предполагаемого к заполнению. При этом количество «материала» выбирают исходя из объема дефекта, предполагаемого к заполнению.

В некоторых вариантах изобретения количество ОТП на этапе а) выбирают так, чтобы ОТП в результате его добавления к «материалу» на этапе в) обеспечивал возможность полного погружения «материала» в ОТП.

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения стабилизированную кровь получают путем смешивания свежесобранной крови пациента с антикоагулянтом на основе цитрата натрия в соотношении 9:1 по объему. В частных вариантах изобретения антикоагулянт на основе цитрата натрия представляет собой раствор ACD-A или гемоконсервант ЦФГ.

В некоторых вариантах изобретения для достижения целевого объема ОТП используют обогащенную тромбоцитами плазму, полученную по меньшей мере в двух пробирках.

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения на этапе а) и/или б) используют пробирку АРМ - «Пробирка АРМ стерильная для получения обогащенной тромбоцитами плазмы» по ТУ 32.50.50-002-11701993-2021, Регистрационное удостоверение № РЗН 2022/16987 от 25.04.2022.

В некоторых вариантах изобретения на этапах а) и б) центрифугирование осуществляют со скоростью вращения 3500-3600 об./мин. в течение 4-6 минут.

В частных вариантах изобретения сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин, отделяют от фибринового сгустка путем введения в фибриновый сгусток иглы, одетой на конус шприца, не содержащего наполнитель, производя покачивающие движения иглой с целью выдавливания сыворотки, заключенной в сформированной фибриновой сети сгустка, и далее выполняют последующий забор сыворотки с помощью этого же шприца.

В некоторых вариантах изобретения на этапе б) используют пробирку, имеющую форму «песочных часов» или пробирку цилиндрической формы.

В некоторых вариантах изобретения на этапе б) переход плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток происходит в течение 5-15 мин.

В некоторых вариантах изобретения образование обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети «материалом» на этапе г) происходит в течение 5-10 мин.

В некоторых вариантах изобретения дополнительно по меньшей мере в одной отдельной пробирке, имеющей форму «песочных часов», получают лейкотромбоцитарную взвесь, которую добавляют к в ОТП на этапе а) или к используемому «материалу» одновременно с ОТП на этапе в).

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения для получения лейкотромбоцитарной взвеси используют пробирку АРМ - «Пробирка АРМ стерильная для получения обогащенной тромбоцитами плазмы» по ТУ 32.50.50-002-11701993-2021, Регистрационное удостоверение № РЗН 2022/16987 от 25.04.2022.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:

- разработан простой, высокоэффективный способ получения фибринового матрикса на основе обогащенной тромбоцитами плазмы с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани;

- разработанный способ позволяет фиксировать остеозамещающий материал или аутокрошку из костной или хрящевой ткани внутри матрикса, полученного на основе ОТП, что предотвращает миграцию используемого материала в интра- и послеоперационном периодах, способствует стимулированию регенеративных процессов, включая репаративный остеогенез (или хондрогенез), что обуславливает эффективность применения получаемого продукта независимо от локализации и размера дефекта, его этиологии и патогенеза;

- предложенный способ подразумевает получение и использование аутологичного тромбина, что существенно снижает риск возникновения аллергических реакций;

- использование пробирки АРМ, имеющей форму «песочных часов», в процессе получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани, в отличие от пробирок стандартного (цилиндрического) форм-фактора, обеспечивает дополнительные результаты, связанные с истинно высоким содержанием тромбоцитов (см. таблицу 1), являющихся источником биологически активных соединений, определяющих клинический потенциал и эффективность стимулирования репаративного остеогенеза (или хондрогенеза), миграции недифференцированных остеогенных, а также других типов клеток, участвующих в регенераторных процессах;

- в рамках разработанного способа также предлагается дополнительное обогащение получаемого фибринового матрикса тромбоцитами (лейкотромбоцитарной взвесью), получаемыми в дополнительной пробирке, имеющей форму «песочных часов», предпочтительно в пробирке АРМ, что позволяет существенно повысить концентрацию клеток, обеспечивающих пролонгированную секрецию факторов роста и других биоактивных соединений в получаемой композиции, как результат - к усилению стимулирующего действия, направленного на регенерацию окружающих тканей, процессы репаративного остеогенеза (или хондрогенеза), а также иммуномодулирующему, антибактериальному, фунгицидному и другим эффектам в зоне воздействия.

Определения и термины

Следующие термины и определения применяются в данном документе, если иное не указано явно. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п. интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Использование терминов порядка «верхний», «средний», «нижний» в отношении получаемых в пробирках фракций крови подразумевает конкретный порядок, если иное четко не указано в контексте.

Термин «лечение» означает процесс, целью которого является устранение заболевания или травмы, патологического состояния или иного нарушения жизнедеятельности, нормализация нарушенных процессов жизнедеятельности, восстановление и улучшение здоровья. В настоящем документе «лечение» также означает стимулирование восстановления утраченной костной или хрящевой ткани (стимулирование репаративного остеогенеза и хондрогенез соответственно), смягчение симптомов, ассоциированных с решаемой задачей.

Термины «субъект» и «пациент» охватывают любые виды млекопитающих, более предпочтительно, подразумевают человека.

Под «антикоагулянтом» в настоящем изобретении подразумевают антикоагулянт на основе цитрата натрия, например, такой как ACD-A (антикоагулянт на основе цитрата, включающий декстрозу по формуле А), гемоконсервант ЦФГ (антикоагулянт на основе цитрата, включающий фосфат и глюкозу) или их аналоги.

Термин «обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс» в рамках настоящего изобретения означает натуральную биодеградируемую матрицу (матрикс) с высоким содержанием тромбоцитов, образующуюся в результате осуществления последовательности действий, стимулирующих естественный процесс коагуляции с переводом фибриногена обогащенной тромбоцитами плазмы в фибрин посредством воздействия тромбина и кальция. Тромбин отщепляет один или более фибринопептидов, составляющих лишь 3% от белковой массы фибриногена. Расщепление фибриногена тромбином приводит к высвобождению фибринопептидов А и B. Затем происходит спонтанная полимеризация образовавшихся фибрин-мономеров в сгустки, которые стабилизируются свертывающим фактором XIIIa в прочный фибрин-полимер.

Под «остеозамещающим материалом» в рамках настоящего изобретения подразумевается материал, который может выступать в роли основы для формирования собственной костной ткани человека при его введении в зону дефекта костной ткани в составе композиции (продукта) по изобретению. Согласно изобретению, могут быть использованы аллогенные (аллогенная костная крошка, в том числе подвергнутая деминерализации, депротеинизации и/или лиофилизации), ксеногенные (костная крошка животного происхождения) или синтетические (производятся из различных материалов, как правило, на основе солей кальция, искусственным путем) материалы, разрешенные и пригодные для заполнения костных дефектов.

Под термином «аутокрошка» в рамках настоящего изобретения подразумевается измельченная ткань (костная или хрящевая соответственно), полученная у человека и имплантированная ему же, то есть ткань, имеющая происхождение из организма самого пациента.

Под «конечным продуктом» в рамках настоящего изобретения подразумевается обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани.

Под «биологической вариабельностью» в рамках настоящего изобретения подразумеваются различия состава крови пациентов.

В предпочтительных вариантах изобретения под «пробиркой» подразумевается «Пробирка АРМ стерильная для получения обогащенной тромбоцитами плазмы» по ТУ 32.50.50-002-11701993-2021 (Регистрационное удостоверение (РУ) № РЗН 2022/16987 от 25.04.2022) (далее - пробирка АРМ), описанная в патенте «Система стерильная для сепарирования крови и способ получения обогащенной тромбоцитами плазмы из цельной крови» (патент RU2698723, опубл.29.08.2019). Так же под термином «пробирка» может подразумеваться пробирка с формой в виде «песочных часов» или другого форм-фактора, если это предусмотрено в тексте.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Краткое описание рисунков

Фиг.1 - Забор обогащенной тромбоцитами плазмы из пробирки АРМ.

Фиг.2 - Пробирка АРМ стерильная для получения обогащенной тромбоцитами плазмы. На рисунке показаны хорошо видимые фракции крови после проведения центрифугирования: верхний слой (фракция) (1) - плазма крови, средний слой (фракция) (2) - лейкотромбоцитарная взвесь, нижний слой (фракция) (3) - эритромасса.

Фиг.3 - Заполнение емкости с аутокрошкой из костной ткани обогащенной тромбоцитами плазмой.

Фиг.4 - Добавление сыворотки, содержащей тромбин.

Фиг.5 - Добавление раствора кальция глюконата.

Фиг.6 - Результат формирования обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированной в фибриновой сети аутокрошкой из костной ткани в емкости выбранной формы и объема.

Фиг.7 - Зона дефекта костной ткани перед переносом и укладкой обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированной в фибриновой сети аутокрошкой.

Фиг.8 - Перенос и укладка обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированной в фибриновой сети аутокрошкой в зону дефекта костной ткани.

Фиг.9 - Результат укладки обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированной в фибриновой сети аутокрошкой в зоне дефекта.

Фиг.10 - Рентгенологическая картина на первые сутки после операции: А - боковая проекция, Б - прямая проекция. Обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс удерживает фиксированную в фибриновой сети аутокрошку в зоне дефекта.

Подробное описание изобретения

Обогащенная тромбоцитами плазма (ОТП, PRP - platelet-rich plasma) представляет собой аутологичную, биологически активную производную цельной крови, содержание тромбоцитов в которой составляет не менее одного миллиона клеток в 1 микролитре.

Тромбоцит является источником факторов роста, таких как трансформирующий фактор роста бета (TGF-β1 и β2), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, II), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (PD-EGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и др., оказывающих широкий спектр биологических эффектов, стимулирующих регенераторные процессы на всех уровнях. При этом концентрация ростовых факторов линейно зависит от концентрации тромбоцитов в используемой ОТП. Помимо факторов роста, накапливаемых в α-гранулах, тромбоцит секретирует и другие биоактивные соединения, оказывающие прямое или опосредованное иммуномодулирующее действие, в частности ингибирующие воспалительные и катаболические процессы, хранят антибактериальные и фунгицидные белки, способные предотвращать развитие инфекций.

Концентрация тромбоцитов и их общее количество являются ключевым параметром, определяющими биологический потенциал ОТП, т.к. большинство факторов роста и других биоактивных соединений хранятся в их α- и плотных гранулах. В норме, активная секреция факторов роста инициируется процессом свертывания крови и начинается в течение первых 10 минут. Более 95% накопленных факторов роста секретируются тромбоцитом в течение первого часа. Тем не менее, тромбоциты способны ресинтезировать дополнительные факторы роста на протяжение последующих дней своей жизни. Как только тромбоцит истощается и отмирает, макрофаги, мигрирующие в область благодаря получаемым от тромбоцитов стимулам, частично берут на себя их функции, продолжая секретировать факторы роста. Таким образом, важно наличие жизнеспособных тромбоцитов в составе ОТП, количество которых определяет параметры регенераторного процесса.

Обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс (PRFM - Platelet-rich Fibrin Matrix) - биологически активная производная крови, используемая, в частности, для заполнения дефектов костной ткани и ускорения ее регенерации за счет стимулирования миграции недифференцированных остеогенных и других типов клеток. Помимо травматологии и ортопедии, фибриновые матрицы нашли широкое применение в спортивной медицине, офтальмологии, челюстно-лицевой хирургии и других областях регенеративной медицины.

В рамках настоящего изобретения разработан простой, клинически высокоэффективный способ получения на основе ОТП фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани, которые могут быть использованы для заполнения дефектов костной ткани (для чего используют фибриновый матрикс с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной ткани) или дефектов хрящевой ткани (для чего используют фибриновый матрикс с фиксированной в фибриновой сети аутокрошкой из хрящевой ткани).

Предлагаемый способ был разработан в рамках экспериментальной клинической работы, направленной на разрешение задачи, результат которой максимально отвечает требованиям клинической практики - возможность фиксации остеозамещающего материала или аутокрошки из костной или хрящевой ткани в зоне дефекта костной или хрящевой ткани, соответственно, при использовании биодеградируемого, желательно аутологичного фиксирующего материала, обеспечивающего предотвращение миграции фиксируемого материала в интра- и послеоперационном периодах, стимулирующего регенеративные процессы, с целью сокращения сроков репаративного остеогенеза (или хондрогенеза).

В известных из уровня техники методах на первом этапе получают фибриновый сгусток, к которому лишь потом добавляют костную крошку с последующим ее утрамбовыванием в тело сгустка, что сопровождается выдавливанием из него сыворотки. Таким образом, костная крошка находится на поверхности фибриновый сети, а не фиксирована в ней, что не позволяет предотвратить ее миграцию в интра- и послеоперационном периодах.

Кроме того, в применяемых методах для получения плазмы используются пробирки стандартного (цилиндрического) форм-фактора, таким образом субстратом для формирования фибринового сгустка выступает бедная тромбоцитами плазма (БТП или Platelet-poor plasma), «очищенная» от клеток во время центрифугирования, что существенно снижает биологический потенциал конечного продукта.

В отличие от этого, в предлагаемом способе остеозамещающий материал или аутокрошку из костной или хрящевой ткани совмещают с ОТП еще на этапе формирования фибринового матрикса, как это подробно описано ниже, что, в совокупности с другими приемами способа, обеспечивает существенные преимущества получаемого обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса, обеспечивает эффективность его применения независимо от локализации и размера дефекта, его этиологии и патогенеза.

Таким образом, преимущества, которыми обладает получаемый продукт, обеспечиваются комбинацией разработанных приемов способа его получения и метода их выполнения.

Несмотря на то, что хорошо известно, что ОТП при ее совмещении с остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной ткани может применяться для восстановления утраченной костной ткани, результаты такого хирургического лечения очень сильно зависят от свойств и качественных характеристик продукта, например, от клеточного состава биологически активной композиции, который, в свою очередь, очень сильно зависит от способа его получения, влияющего на эффективность и клинический результат (результирующе качество).

Предлагаемый способ получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани (далее - «используемый материал» (или «материал»)) включает следующие этапы:

а) Получают обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП).

Для этого в пробирку, имеющую форму «песочных часов» (например: пробирка АРМ), помещают стабилизированную кровь (смесь свежесобранной цельной крови пациента и антикоагулянта на основе цитрата натрия в соотношении 9:1 по объему). Далее пробирку центрифугируют до разделения (сепарирования) стабилизированной крови на три фракции, средняя из которых представляет собой лейкотромбоцитарную взвесь (лейкотромбоцитарный слой), которую отбирают из пробирки вместе с необходимым количеством верхней фракции - плазмы крови, что позволяет получить (сформировать) обогащенную тромбоцитами плазму, содержащую не менее 1 млн. тромбоцитов в 1 мкл. продукта (см. Фиг.1).

Необходимое количество ОТП определяют исходя из целевого объема конечного продукта. Т.к. рабочий объем пробирки АРМ ограничен и составляет 15 мл, для достижения целевого объема фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети материалом возможно использование обогащенной тромбоцитами плазмы, полученной одновременно в одной, двух, трех и более пробирках АРМ.

б) Получают аутологичную сыворотку, содержащую тромбин. Этот этап может выполняться одновременно с этапом а) или непосредственно следом за ним.

Для этого в другую пробирку (возможно использование пробирок, имеющих различный форм-фактор, например стерильной пробирки с крышкой, в том числе вакуумной, имеющей цилиндрическую форму; пробирки, имеющей форму «песочных часов», в том числе пробирки АРМ, и др. Основными критериями являются: отсутствие антикоагулянта или какого-либо другого наполнителя, а также возможность доступа к фибриновому сгустку с целью получения сыворотки) помещают свежесобранную цельную кровь этого же пациента. Далее пробирку центрифугируют до разделения крови на три фракции, верхняя из которых представляет собой плазму. После этого пробирку оставляют при комнатной температуре до перехода плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток, что достигается естественным каскадом коагуляции (переход плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток происходит в течение 5-15 мин, что зависит от объема используемой пробирки, биологической вариабельности). После этого сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин, отделяют от фибринового сгустка.

Для отделения сыворотки, содержащей образовавшийся тромбин, в фибриновый сгусток вводят иглу, одетую на конус шприца, не содержащего наполнитель, производят покачивающие движения иглой с целью выдавливания сыворотки, заключенной в сформированной фибриновой сети сгустка, выполняют последующий забор сыворотки с помощью этого же шприца. Для этого может быть использована любая удобная игла, уместная для проведения манипуляции, соразмерная с размером используемой на этапе б) пробирки.

в) Формирование композиции для получения конечного продукта.

Используемый материал, общий объем которого соизмерим с объемом дефекта костной (или хрящевой) ткани, предполагаемого к заполнению, размещают в лотке или емкости выбранной оператором формы и размера (соизмеримыми с необходимым объемом используемого материала и формой дефекта), затем добавляют последовательно, равномерно распределяя, обогащенную тромбоцитами плазму, в объеме, достаточном для погружения используемого материала, сыворотку, содержащую тромбин, и раствор кальция глюконата (или кальция хлорида) (в концентрации 100 мг/мл) в соотношении ОТП : сыворотка, содержащая тромбин : раствор кальция глюконата (кальция хлорида) 16:2:1 - 16:4:2 по объему (см. Фиг.2-4). Объем ОТП по отношению к используемому материалу выбирают так, чтобы в результате весь материал оказался погруженным в ОТП, при этом, в силу своей текучести, ОТП заполняет все пространство между фрагментами используемого материала, обеспечивая условия для его надежной фиксации в фибриновой сети при формировании конечного продукта.

г) Формирование конечного продукта.

Полученную смесь оставляют при комнатной температуре до образования обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети используемым материалом (см. Фиг.5). Время формирования фибриновой сети зависит от биологической вариабельности и обычно занимает 5-10 мин.

В предпочтительных вариантах изобретения получение обогащенной тромбоцитами плазмы осуществляют при использовании пробирки АРМ (см. Фиг.2).

Пробирка АРМ представляет собой медицинское изделие, специально разработанное для получения обогащенной тромбоцитами плазмы из цельной или стабилизированной крови пациента (см. патент RU2698723, опубл.29.08.2019; РУ № РЗН 2022/16987 от 25.04.2022). В отличие от пробирок с разделительным гелем, заложенные технические решения и форм-фактор изделия позволяют сепарировать кровь на 3 видимые, возможные для забора фракции: плазма, лейкотромбоцитарная взвесь (лейкотромбоцитарный слой) клеток и эритромасса (см. Фиг.2). Эргономика пробирки, наличие информационных рисок и ключа-подставки, позволяющего менять положение поршня, а, следовательно, и границу лейкотромбоцитарного слоя, обеспечивают возможность формирования и удобство забора истинной обогащенной тромбоцитами плазмы с максимальным содержанием тромбоцитов, достигающим 2,4 миллионов и более клеток в 1 микролитре, что определяет биологический потенциал и клиническую эффективность продукта. Сепарирование крови достигается методом центрифугирования при использовании указанных параметров: об./мин. - 3500-3600, время ~ 4-6 мин. Однако, учитывая биологическую вариабельность, возможно проведение повторного центрифугирования с добавлением достаточного времени, необходимого для достижения сепарирования крови, выделения лейкотромбоцитарного слоя.

Использование дополнительной пробирки АРМ, в совокупности с технической возможностью выделения и забора каждой из фракций по отдельности, обеспечивает возможность дополнительного обогащения конечного продукта тромбоцитами путем переноса лейкотромбоцитарной взвеси (концентрат искомых клеток), что позволяет существенно повысить содержание клеток, обеспечивающих пролонгированную секрецию факторов роста и других биоактивных соединений в получаемой композиции, как результат - к усилению стимулирующего действия, направленного на регенерацию окружающих тканей, процессы репаративного остеогенеза (или хондрогенеза), иммуномодулирующему, антибактериальному, фунгицидному и др. эффектам в зоне воздействия.

Получение лейкотромбоцитарной взвеси осуществляют в дополнительной пробирке АРМ одновременно с проведением этапа а). Для этого, в отличие от этапа а), после центрифугирования из пробирки АРМ забирают не лейкотромбоцитарную взвесь (лейкотромбоцитарный слой) с плазмой крови, а только лейкотромбоцитарную взвесь. Перенос лейкотромбоцитарной взвеси осуществляют либо на этапе а) - для повышения концентрации искомых клеток в полученной ОТП, либо на этапе в) путем добавления ее к используемому материалу вместе с обогащенной тромбоцитами плазмой.

Возможность объективного проявления технического результата при осуществлении изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными ниже в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Следует понимать, что приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Пример 1. Получение обогащенной тромбоцитами плазмы в пробирке АРМ

Получение обогащенной тромбоцитами плазмы в пробирке АРМ производилось по методике, описанной в патенте RU2698723.

Результаты измерения концентрации тромбоцитов в полученной ОТП приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Концентрация тромбоцитов в ОТП в объеме 1-2 мл, полученной в пробирке АРМ. Тест Результат (содержание тромбоцитов (PLT)) Единицы измерения Референсные значения 1 2373 х10³/мкл 180-320 2 2440 х10³/мкл 180-320 3 2077 х10³/ мкл 180-320 4 2341 х10³/мкл 180-320 5 2085 х10³/ мкл 180-320 6 1792 х10³/ мкл 180-320 7 1944 х10³/ мкл 180-320 8 1722 х10³/ мкл 180-320 9 1525 х10³/ мкл 180-320 10 1485 х10³/ мкл 180-320

Как следует из приведенных данных (результатов лабораторных исследований), содержание тромбоцитов в 1 микролитре ОТП может достигать 2 440 000 клеток, что свидетельствует о значимом биологическом потенциале ОТП, полученной в пробирке АРМ.

Пример 2. Получение обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированной в фибриновой сети аутокрошкой из костной ткани

Этап 1: ОТП получали в пробирке АРМ по методике, описанной в патенте РФ на изобретение № 2698723.

Забор необходимого объема ОТП производился с использованием шприца объемом 10 мл.

Этап 2: получали сыворотку, содержащую тромбин.

Получение сыворотки, содержащей тромбин, также выполнялось в пробирке АРМ по схожему с получением обогащенной тромбоцитами плазмы алгоритму, но имеющему ряд значимых отличий, главным из которых является отсутствие использования антикоагулянта. Методика включает в себя следующие подэтапы:

1. Производиться венепункция с последующим забором 15 мл цельной венозной крови в шприц, не содержащий наполнитель.

2. Игла, длина которой составляет 40 мм и более, надетая на конус используемого шприца, содержащего венозную кровь, вводится до упора через универсальное отверстие крышки пробирки АРМ таким образом, чтобы она была центрована в перешейке колбы, после чего производится наполнение пробирки кровью до достижения метки МАХ, ограничивающей начальный рабочий объем пробирки, равный 15 мл.

3. Игла вынимается из пробирки АРМ, отверстие крышки закрывается заглушкой, после чего из поршня пробирки вынимается ключ-подставка. Пробирка АРМ готова к центрифугированию.

4. Пробирка АРМ располагается в свободном стакане бакет-ротора центрифуги напротив соответствующей пробирки-противовеса, производится процесс центрифугирования при скорости вращения 3600 об./мин до разделения крови на фракции (плазма, лейкотромбоцитарная взвесь клеток (ЛТС), эритроцитарная масса) - около 5-6 минут. Учитывая биологическую вариабельность, возможно проведение повторного центрифугирования с добавлением достаточного времени, необходимого для достижения сепарирования венозной крови в границах или ниже перешейка пробирки АРМ.

5. Пробирка АРМ вынимается из центрифуги и устанавливается на ключ-подставку, что обеспечивает устойчивое положение пробирки при опоре на гладкую поверхность.

6. Убедитесь, что обогащенная тромбоцитами плазма сохраняет текучее состояние, немного наклонив пробирку. В зависимости от уровня расположения ЛТС, вращением ключа-подставки по или против часовой стрелки выполняется управление резьбовым ходом поршня с целью выравнивания уровня нижней границы ЛТС (границы слоя клеток) по центральной риске перешейка пробирки АРМ.

7. Дождитесь перехода плазмы из жидкого состояние в фибриновый сгусток, что достигается естественным каскадом коагуляции.

8. После образования фибринового сгустка необходимо отделить от него сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин. Для этого необходимо открыть центральное отверстие крышки пробирки АРМ, после чего ввести через него в сгусток иглу, одетую на конус шприца, не содержащего наполнитель. Длина иглы может составляет 30 и более мм. Для отделения сыворотки необходимо произвести покачивающие движения иглой, что приведет к выдавливанию сыворотки, заключенной в сформированной фибриновой сети сгустка.

Поскольку крышка пробирки АРМ снабжена резьбой, выдавливание сыворотки иглой и последующий забор сыворотки может производиться при снятой крышке.

9. Производится забор необходимого количества сыворотки, содержащей тромбин.

Средний достаточный объем необходимой к забору сыворотки рассчитывался из соотношения: 1-2 части сыворотки к 8 частям ОТП (т.е. на 8 мл ОТП - 1-2 мл сыворотки).

Этап 3: необходимый объем раствора кальция глюконата (в концентрации 100 мг/мл) набирали в шприц, не содержащий наполнитель.

Средний достаточный объем необходимого к забору раствора кальция глюконата рассчитывался из соотношения: 1-2 часть раствора к 16 частям ОТП (т.е. на 8 мл ОТП - 0.5-1.0 мл раствора кальция глюконата).

Этап 4: формировали «конечный продукт».

Аутокрошку из костной ткани в объеме, соизмеримом с объемом дефекта костной ткани, разместили в лотке выбранной формы и размера, сопоставимом с дефектом костной ткани, равномерно распределили аутокрошку ложкой Фолькмана. Затем добавили последовательно, равномерно распределяя, ОТП в объеме, достаточном для погружения аутокрошки (см. Фиг.3), сыворотку, содержащую тромбин (см. Фиг.4) и раствор кальция глюконата (см. Фиг.5).

После этого дожидались формирования обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированной в фибриновой сети аутокрошкой из костной ткани (см. Фиг.6).

Пример 3. Применение обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированной в фибриновой сети аутокрошкой из костной ткани с целью заполнения дефекта костной ткани, стимулирования репаративного остеогенеза

На Фиг.7 показана зона дефекта костной ткани перед переносом и укладкой обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированной в фибриновой сети аутокрошкой из костной ткани.

Обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс с фиксированной в фибриновой сети аутокрошкой, полученный, как описано в Примере 2, перенесли в зону дефекта костной ткани. На Фиг.8 показан процесс переноса и укладки обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированной в фибриновой сети аутокрошкой в зону дефекта костной ткани. На Фиг.9 показан результат укладки обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированной в фибриновой сети аутокрошкой в зоне дефекта костной ткани.

На Фиг.10 показана рентгенологическая картина на первые сутки после операции: А – боковая проекция, Б – прямая проекция. Как видно на рентгенологической картине, обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс хорошо удерживает фиксированную в фибриновой сети аутокрошку в зоне дефекта.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что предложенный способ получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани, отвечает требованиям клинической практики - возможность фиксации остеозамещающего материала или аутокрошки из костной или хрящевой ткани в зоне дефекта костной или хрящевой ткани, соответственно, при использовании биодеградируемого, аутологичного фиксирующего материала, обеспечивающего предотвращение миграции фиксируемого материала в интра- и послеоперационном периодах, стимулирующего регенеративные процессы с целью сокращения сроков репаративного остеогенеза (или хондрогенеза).

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам стимуляции репаративного остегенеза и хондрогенеза. Изобретение эффективно для получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани, что предотвращает миграцию используемого материала в интра- и послеоперационном периодах. Настоящее изобретение также позволяет обеспечить возможность большего насыщения конечного продукта тромбоцитами путем переноса лейкотромбоцитарной взвеси из дополнительной пробирки АРМ, имеющей форму «песочных часов». 14 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Способ получения обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани, включающий следующие этапы:

а) получают обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП),

для этого по меньшей мере в одну в пробирку, имеющую форму «песочных часов», помещают свежесобранную стабилизированную кровь пациента; далее пробирку(-и) центрифугируют до разделения стабилизированной крови на три фракции, средняя из которых представляет собой лейкотромбоцитарную взвесь, которую отбирают из пробирки(-ок) с добавлением верхней фракции - плазмы крови, что позволяет сформировать обогащенную тромбоцитами плазму, содержащую не менее 1 млн тромбоцитов в 1 мкл продукта;

б) получают сыворотку, содержащую тромбин,

- для этого в пробирку, не содержащую наполнитель, помещают свежесобранную цельную кровь этого же пациента,

- далее пробирку центрифугируют до разделения на три фракции, верхняя из которых представляет собой плазму,

- после чего пробирку оставляют при комнатной температуре до перехода плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток, что достигается естественным каскадом коагуляции,

- после этого сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин, отделяют от фибринового сгустка;

в) формируют композицию для получения конечного продукта,

остеозамещающий материал или аутокрошку из костной или хрящевой ткани, соответственно (далее: «материал»), размещают в лотке или емкости выбранной формы, добавляют последовательно:

- аутологичную обогащенную тромбоцитами плазму, полученную на этапе а),

- аутологичную сыворотку, содержащую тромбин, полученную на этапе б), и

- раствор кальция глюконата в концентрации 100 мг/мл или раствор кальция хлорида в концентрации 100 мг/мл,

при этом объемное соотношение компонентов ОТП:сыворотка, содержащая тромбин:раствор кальция глюконата (кальция хлорида) составляет 16:2:1-16:4:2;

г) полученную смесь оставляют при комнатной температуре до образования обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети «материалом».

2. Способ по п. 1, в котором размер и форму лотка или емкости выбирают так, чтобы сформированный обогащенный тромбоцитами фибриновый матрикс с фиксированным в фибриновой сети остеозамещающим материалом или аутокрошкой из костной или хрящевой ткани соответствовал таковым дефекта, соответственно, костной или хрящевой ткани, предполагаемого к заполнению.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, в котором количество «материала» выбирают исходя из объема дефекта, предполагаемого к заполнению.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором количество ОТП на этапе а) выбирают так, чтобы ОТП в результате его добавления к «материалу» на этапе в) обеспечивал возможность полного погружения «материала» в ОТП.

5. Способ по п. 1, в котором стабилизированную кровь получают путем смешивания свежесобранной крови пациента с антикоагулянтом на основе цитрата натрия в соотношении 9:1 по объему.

6. Способ по п. 5, в котором антикоагулянт на основе цитрата натрия представляет собой раствор ACD-A или гемоконсервант ЦФГ.

7. Способ по п. 1, в котором для достижения целевого объема ОТП используют обогащенную тромбоцитами плазму, полученную по меньшей мере в двух пробирках.

8. Способ по п. 1, в котором на этапе а) и/или б) используют пробирку АРМ стерильную для получения обогащенной тромбоцитами плазмы.

9. Способ по п. 8, в котором на этапах а) и б) центрифугирование осуществляют со скоростью вращения 3500-3600 об/мин в течение 4-6 мин.

10. Способ по п. 1, в котором сыворотку, содержащую образовавшийся тромбин, отделяют от фибринового сгустка путем введения в фибриновый сгусток иглы, одетой на конус шприца, не содержащего наполнитель, производя покачивающие движения иглой с целью выдавливания сыворотки, заключенной в сформированной фибриновой сети сгустка, и далее выполняют последующий забор сыворотки с помощью этого же шприца.

11. Способ по п. 1, в котором на этапе б) используют пробирку, имеющую форму «песочных часов» или пробирку цилиндрической формы.

12. Способ по п. 1, в котором на этапе б) переход плазмы из жидкого состояния в фибриновый сгусток происходит в течение 5-15 мин.

13. Способ по п. 1, в котором образование обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса с фиксированным в фибриновой сети «материалом» на этапе г) происходит в течение 5-10 мин.

14. Способ по п. 1, в котором дополнительно по меньшей мере в одной отдельной пробирке, имеющей форму «песочных часов», получают лейкотромбоцитарную взвесь, которую добавляют к в ОТП на этапе а) или к используемому «материалу» одновременно с ОТП на этапе в).

15. Способ по п. 14, в котором для получения лейкотромбоцитарной взвеси используют пробирку АРМ стерильную для получения обогащенной тромбоцитами плазмы.