МЕТОД СОЗДАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ МОДЕЛИ МЫШЕЙ С НОКАУТОМ ГЕНА PDE6B Российский патент 2023 года по МПК A01K67/27 

Описание патента на изобретение RU2791687C1

Область техники

Техническое решение относится к областям молекулярной биологии и генетической инженерии, биотехнологии животных, в частности к области создания модели животного с нокаутом гена, то есть к способу получения и применению мышей с нокаутом гена pde6b.

Уровень техники

Быстрое развитие генетической инженерии в последние десять лет связано с бурным ростом новых геномных технологий, в том числе методов направленного редактирования генома с помощью CRISPR/Cas системы. Cas белки, изначально найденные в бактериях, в комплексе с короткими направляющими РНК способны специфически узнавать чужеродные ДНК и РНК и вносить в них разрыв, предотвращая распространение инфекции в бактериальной популяции (Hille et al., 2018). CRISPR/Cas технологию можно смело отнести к научно-технологическому прорыву XXI века. В октябре 2020 за изобретение метода направленного редактирования генома CRISPR/Cas получили нобелевскую премию Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье. Многочисленные исследования в этой области позволили выявить большое разнообразие Cas-нуклеаз, и соответственно, широкий спектр их применения: изменение генома, регуляция уровня транскрипции генов, детекция патогенов, определение внутриклеточной локализации нуклеиновых кислот и др. (Broughton et al., 2020; Li et al., 2020).

Система CRISPR / Cas9 состоит из трех основных компонентов: РНК-управляемая эндонуклеаза Cas9, CRISPR-РНК (crRNA) и трансактивационная CRISPR-РНК (tracrRNA). Исследование кристаллических структур белка Cas9 Streptococcus pyogenes (SpCas9) показало, что нуклеаза состоит из 5 доменов: REC, Bridge Helix (ВН), PI, HNH и RuvC (Anders et al., 2014, 2016; Huai et al., 2017; Jiang et al., 2015; Jinek et al., 2014; Nishimasu et al., 2014). Домен REC отвечает за связывание sgRNA, тогда как домен ВН играет роль в инициации нуклеазной активности сразу после связывания ДНК. Домен PI отвечает за связывание РАМ, способствуя разделению локальных цепей дуплекса ДНК-мишени и образованию гибрида sgRNA-ДНК. Домены HNH и RuvC вносят разрывы в комплементарную и некомплементарную направляющей РНК цепи ДНК-мишени, соответственно. Было показано, что домен HNH имеет мотив H-N-H (гистидин-аспарагин-гистидин), который типичен для многих эндонуклеаз и состоит из двух антипараллельных β-цепей, соединенных между собой, окруженных α-спиралью (Cymerman et al., 2006). Домен RuvC также хорошо известен при гомологичной рекомбинации у бактерий благодаря своей резольвазной активности (Gorecka et al., 2013). Последовательность sgРНК состоит из направляющей РНК (20 нуклеотидов) и tracrRNA, которая отвечает за взаимодействие с REC доменом Cas9 нуклеазы. Белок SpCas9, с момента образования комплекса с sgRNA, сканирует ДНК мишени и распознает 5'-NGG-3 'РАМ, расположенный ниже сайта расщепления на некомплементарной цепи ДНК. После этого он расщепляет ДНК с образованием "тупых" концов через три пары оснований от сайта РАМ (Jinek et al., 2014). После внесения разрыва в ДНК одна из систем репарации ДНК быстро восстанавливает повреждение, при этом внося изменение в нуклеотидную последовательность, что может привести к желаемой модификации гена на месте разрыва (Leonova and Gainetdinov, 2020).

Двухцепочечный разрыв ДНК с одной стороны, это опасное поражение; однако, с другой стороны, это обычное явление во время деления и дифференцировки клеток. Следовательно, такие нарушения ДНК обнаруживаются рядом белков, распознающих повреждения ДНК. Известны три основных пути репарации двойных разрывов ДНК и поддержания стабильности генома: гомологичная рекомбинация (HR); Ku-зависимое негомологичное соединение концов ДНК (NHEJ); и соединение концов, опосредованное микрогомологией (MMEJ). HR играет важную роль в мейозе и митозе, при обмене генетической информацией между донорной и акцепторной ДНК (San Filippo et al., 2008). HR-направленная репарация требует гомологии последовательностей, что может быть использовано для программирования модификаций генов. Ключевые этапы репарации HR включают распознавание двухцепочечного разрыва, 5'-3' деградацию концов с помощью экзонуклеаз, поиск гомологичной матрицы, синтез ДНК по этой матрице и лигирование. Главной особенностью NHEJ является то, что он не требует гомологии последовательности ДНК. Процесс NHEJ осуществляется серией белков, которые работают вместе, чтобы соединить «тупые концы» ДНК. Механизмы репарации, опосредованные NHEJ, могут производить небольшие вставки, делеции или точную коррекцию целевых последовательностей ДНК. Механизм репарации MMEJ включает выравнивание микрогомологических последовательностей (в диапазоне 5-25 п.н.), фланкирующих двухцепочечный разрыв. Этот процесс приводит к обеим делециям между плечами гомологии или, в некоторых случаях, к сложным вставкам. Все эти пути могут взаимодействовать друг с другом, хотя молекулярный механизм координации и предпочтения репарации клеток еще полностью не изучен (Kakarougkas and Jeggo, 2014). Выбор того, какой путь репарации будет активирован, зависит от многих факторов, таких как фаза клеточного цикла, структура хроматина и конструкция CRISPR / Cas (Brandsma and Gent, 2012; Liang et al., 2017; Lin et al., 2014). Однако было высказано предположение, что у млекопитающих путь NHEJ проходит быстрее и эффективнее, чем остальные (Мао et al., 2008).

Таким образом, для создания животного с нокаутом целевого гена достаточно ввести направляющую РНК и Cas нуклеазу в зиготу, чтобы активировать NHEJ или MMEJ пути репарации, которые могут внести мутацию со сдвигом рамки считывания. Чтобы нокаутировать ген, кодирующий белок, нуклеазу CRISPR / Cas9 обычно направляют в начало кодирующей области интересующего гена.

С 2013 года CRISPR/Cas систему стали успешно применять для изменения генома клеток млекопитающих, что привело к созданию ряда эффективных технологий генетической инженерии животных. В частности, для создания мышиной модели моногенного заболевания человека достаточно было внести направленную мутацию с помощью CRISPR/Cas системы в аналогичный ген мыши (Bedell et al., 1997). Этот подход был использован при создании модели мыши с нокаутом гена pde6b, имеющей большое фенотипическое сходство с пациентами, страдающими пигментным аутосомно-рецессивным ретинитом (ПАРР).

Пигментный ретинит - это тип наследственного заболевания сетчатки, которое вызывает медленную прогрессирующую дегенерацию сетчатки и потери зрения. Частота заболевания ПАРР варьируется среди различных популяций от 1:3000 до 1:7000 человек (Liesegang, 2002; Parmeggiani et al., 2011). Известно, что субъединица Pde6b функционирует как часть гетеротетрамерного фермента, состоящего из α-, β и двух γ-субъединиц (αβγ2), которые в норме регулируют уровень внутриклеточного циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) за счет его гидролиза (Cheng et al., 2016). Поскольку Pde6b играет ключевую роль в фототрансдукции - процессе преобразовании света фоторецепторами в нервные импульсы, - предполагается, что мутации в гене pde6b приводят к постоянному открытию катионных каналов, управляемых цГМФ, в мембране фоторецепторов, позволяющих избытку внеклеточных ионов кальция проникать в клетку и вызывать ее гибель в результате апоптоза (Yeo et al., 2019).

Реакцию фоторецепторов можно оценить с помощью метода регистрации ЭРГ, позволяющего рассчитать амплитуду и время до пика двух основных волн, а-волны и b-волны. Нисходящая а-волна отражает первоначальную реакцию фоторецепторов, палочек и колбочек, на световой стимул (Vollrath et al., 2015). Восходящая b-волна является мерой реакции нижележащих нейронов сетчатки, в первую очередь, биполярных клеток, на стимуляцию фоторецепторов. Потеря амплитуды волны а или b может быть отнесена к ряду дистрофий сетчатки, в то время как «сверхнормальные» волны с повышенной амплитудой были отнесены к дистрофии колбочек (Benchorin et al., 2017). ЭРГ является важным неинвазивным инструментом для оценки заболеваний глаз и дегенерации сетчатки благодаря высокому уровню чувствительности. Электроретинограмма (ЭРГ) регистрировалась в возрасте от 18 до 27 дней, поскольку, известно, мыши rd1 с природной мутацией в гене pde6b сохраняют зрительную функцию вскоре после открытия глаз, но полностью теряют ее к 3-4 неделе жизни (Gibson et al., 2013). Следует отметить, что Pde6b экспрессируется только в палочках - фоторецепторах, специализированных для сумеречного зрения. Поэтому, как правило, патологическое состояние при ПАРР развивается в два этапа: на начальной стадии происходит гибель палочек, прогрессирующая от периферии к центру, что проявляется как потеря зрения в темное время суток; в дальнейшем погибают колбочки (фоторецепторы дневного зрения), в результате чего поле зрения сужается и затем наступает полная слепота(Hartong et al., 2006). Таким образом, колбочковое зрение может сохраняться у нокаутных мышей в течение некоторого времени после открытия глаз, однако форма ЭРГ будет сильно искажена.

В 2019 году группа исследователей из Сеула получила линию крыс с нокаутом гена pde6b (Yeo et al., 2019). Для этой линии была показана дегенерация фоторецепторов в 3-недельном постнатальном возрасте (Yeo et al., 2019). Изменения глазного дна у нокаутных животных включали в себя нарушение пигментации, более слабое развитие сосудистой сети и ее нерегулярный рисунок, истончение наружной части сетчатки, которые напоминало ПАРР у людей. В 8-недельном постнатальном возрасте крысы с нокаутом гена pde6b не реагировали на световой раздражитель, при этом а- или b -волны не регистрировались с помощью ERG.

На данный момент основной моделью ПАРР на мышах являются животные с природными спонтанными мутациями в гене pde6b - фенотип rd1, это техническое решение из-за своих ближайших характеристик взят за прототип. Этот фенотип связан двумя с изменениями в локусе Pde6b хромосомы 5: инсерция провируса мышиного лейкоза (Xmv-28) в обратной ориентации в первый интрон; и нонсенс-мутация (Y347X, замена С на А) в 7 экзоне субъединицы Pde6p. Есть предположение, что у мышей нонсенс-мутация rd1 нарушает структурную организацию белка, включая каталитический домен гетеротетрамерного фермента, в состав которого он входит. Следствием этого является неправильная регуляция уровня цГМФ и высокий приток ионов кальция через управляемые циклическими нуклеотидами катионные каналы. Это вызывает гибель палочек, что приводит к развитию ночной слепоты (Wu et al., 2016).

Настоящая модель мыши с нокаутированным геном pde6b имеет большое фенотипическое сходство с пациентами, страдающими пигментным аутосомно-рецессивным ретинитом (ПАРР). Общие фенотипические характеристики включают дегенерацию фоторецепторов и их ядер во внешнем ядерном слое, поражение сосудов сетчатки, пигментные пятна на глазном дне, а также уменьшение амплитуды основных компонентов электроретинограммы (ЭРГ). Мутации в гене, кодирующем β-субъединицу cGMP-PDE, были обнаружены у пациентов, страдающих аутосомно-рецессивным пигментным ретинитом (OMIM 180072), фенотипически сходным с состоянием мышей, вызванным мутацией Pde6brd1 (Cheng et al., 2016). В качестве дополнительного контроля при отборе мышей, гомозиготных по нокаутной аллели pde6b, функциональное состояние их сетчатки оценивалось методом электроретинографии in vivo, позволяющий прижизненно регистрировать изменение потенциала на роговице, возникающее вследствие ответов сетчатки на световые стимулы.

Задачей заявляемого технического решения является создание мышиной модели пигментного аутосомно-рецессивного ретинита (ПАРР) с помощью технологии CRISPR/Cas9 для направленного нокаутирования гена, обеспечивающей более точное введение делеции 2-х нуклеотидов во втором экзоне гена pde6b, приводящей к сдвигу рамки считывания при транскрипции данного гена и выключению гена.

Раскрытие сущности технического решения

Техническое решение вышеприведенной задачи заключается в методе создания и применение модели пигментного аутосомно-рецессивного ретинита (ПАРР), включающий в себя способ нокаутирования, где с целью выключения гена pde6b и за счет использования технологии CRISPR/Cas9 он осуществляется путем подбора направляющей РНК, микроинъекции смеси направляющей РНК и белка Cas9 в зиготу мышей, подсадки зигот после микроинъекций в матку псевдобеременной самки мыши, генотипирования полученных мышей и выведения линии мышей, гомозиготных по нокауту гена pde6b. Указанное техническое решение обеспечивает полное выключение гена pde6b.

Краткий перечень чертежей

Дополнительно отмечаем, что приложенные рисунки (рис. 1-3) показывают наиболее предпочтительный вариант осуществления технического решения и не могут рассматриваться в качестве ограничения содержания технического решения, которое предусматривает и другие варианты осуществления.

На фиг. 1 - Схематическое изображение изобретения - введение делеции двух нуклеотидов с помощью CRISPR/Cas9 системы направленного редактирования генома.

На фиг. 2 - Последовательности праймеров, ДНК матрицы и sgRNA.

На фиг. 3 - Функциональное состояние сетчатки мышей с нокаутом гена pde6b, оцененное с помощью метода регистрации ЭРГ. А - пример ответа на вспышку интенсивностью 31.6 кд×с/м2. Б, В - сравнение амплитуды а- и b-волны ЭРГ мышей дикого типа и нокаутных на 18-й день жизни (n=4-7). # - статистически значимые различия по критерию Манна-Уитни (р<0.01).

Осуществление технического решения

Заявляемое техническое решение относится к генетически сконструированной мышиной модели пигментного аутосомно-рецессивного ретинита, имеющей делецию двух нуклеотидов во втором экзоне гена pde6b, который кодирует β-субъединицу фосфодиэстеразы циклического гуанидинмонофосфата. Данная делеция привела к сдвигу рамки считывания и прекращению продукции белка Pde6b.

Предлагаемый способ нокаутирования отличается тем, что за счет использования технологии CRISPR/Cas9 обеспечивается более точное введение делеции 2-х нуклеотидов во втором экзоне гена pde6b, приводящей к сдвигу рамки считывания при транскрипции данного гена и выключению гена. Способ нокаутирования включает в себя подбор направляющей РНК, микроинъекции в зиготу мышей, подсадку зигот после микроинъекций в матку псевдобеременной самки мыши, генотипирование полученных мышей и выведение линии мышей, гомозиготных по нокауту гена pde6b. Сконструированная, не встречающаяся в природе направляющая РНК, комплементарная второму экзону гена pde6b, способна образовывать комплекс с эффекторным белком Cas9 и гибридизоваться с целевой последовательностью гена pde6b, которая находится в направлении 3' от мотива, смежного с протоспейсером, (РАМ).

При этом олигонуклеотиды, необходимые для получения фрагмента ДНК, несущего протомор для РНК полимеразы бактериофага Т7 и последовательности направляющей РНК, обеспечивают синтез не встречающейся в природе направляющей РНК, комплементарной второму экзону гена pde6b.

Заявители подготовили генетическую конструкцию для направленного введения мутации в ген pde6b мыши, содержащую технологию CRISPR направляющую РНК (sgPHК), нацеленную на данный ген. Подбор праймеров для получения направляющих РНК для белка SpCas9 проводили с помощью программы Synthego (https://www.synthego.com/products/ioinformatics/crispr-design-tool). ДНК матрицу, используемую для транскрипции sgРНК in vitro, получали с помощью двух праймеров.

Прямой праймер содержал последовательность промотора Т7 РНК полимеразы, последовательность спейсера и 20 нуклеотидов sgRNA.

Обратный праймер содержал полную последовательность sgRNA, последовательности обоих праймеров приведены на фиг. 2.

Обратный и прямой праймеры смешивали в равных соотношениях и проводили достройку концов с помощью ПЦР. Полученную ДНК матрицу использовали в реакции транскрипции in vitro.

Транскрипцию in vitro проводили с использованием Т7 РНК полимеразы (Invitrogen). Выделение и очистку РНК проводили с помощью набора MEGAclear™ Transcription Clean-Up (Fermentas). Добавляли 1 мл тризола к 100 мкл смеси мРНК, хорошо перемешивали, инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Затем добавляли 200 мкл хлороформа, сильно перемешивали в течение 15 секунд и инкубировали 3 минуты при комнатной температуре. Центрифугировали при температуре +4°С, 15 мин на оборотах 12000× g. Отбирали супернатант и перенесли в стерильную пробирку. Для осаждения РНК добавляли равный объем изопропанола, инкубировали 10 минут при комнатной температуре, затем центрифугировали 10 мин на оборотах 12000× g при температуре +4°С. Осадок РНК промывали два раза добавлением 1 мл 75% спирта. Высушивали на воздухе и растворяли в 30 мкл деионизированной воды. Инкубировали 10 минут при 55°С. Измеряли концентрацию РНК с помощью спектрофотометра. Концентрация полученной мРНК составила 353 нг/мкл, А260/А280=2,0. РНК хранили при - 70°С.

Доставка полученных конструкций (40 нг/мкл sgPHK для 2 экзона pde6b+20рг/мкл мРНК Cas9) в зиготы мышей была проведена с помощью микроинъекций.

Для получения оплодотворенных яйцеклеток использовали половозрелых самок мышей после обработки гонадотропином сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) и хорионическим гонадотропином человека (ХГч) и ссаживания с самцами. Вымывание яйцеклеток из яичников самок проводили через 11-12 часов после спаривания с самцами. Для вымывания использовали среду М2. Для получения псевдобеременных самок (реципиентов) проводили ссаживание самок с вазэктомированными самцами. Успешно перенесшие микроинъекцию зиготы подсаживали в яйцевод самки-реципиента спустя 1 час после микроинъекции. У рожденных F0 мышей подтверждали наличие делеции, приводящей к сдвигу рамки считывания, с помощью секвенирования ДНК целевого фрагмента гена pde6b. ДНК была выделена из ткани рожденных детенышей, а затем целевой фрагмент был амплифицирован с помощью ПЦР. Подбор праймеров для амплификации и секвенирования проводили с помощью программы PerlPrimer (http://perlprimer.sourceforge.net/).

Выведение линейных гетерозиготных мышей из поколения F0 осуществляли путем их скрещивания с мышами С57 Black дикого типа. Затем гетерозиготы скрещивали для получения гомозигот. Далее для освобождения от потенциальных оффтаргетов проводили 6 обратных скрещиваний гомозигот с мышами С57 Black дикого типа. Каждое обратное скрещивание включало в себя последовательное скрещивание гомозиготных мышей с мышами С57 Black дикого типа и последующее скрещивание полученных гетерозигот между собой для получения гомозигот.

Для оценки функционального состояния сетчатки использовался метод электроретинографии in vivo, позволяющий регистрировать изменение потенциала на роговице, возникающее вследствие ответов сетчатки на световые стимулы. Мыши проходили предварительную темновую адаптацию в течение 12 часов, после чего на время эксперимента наркотизировались с помощью наркозного аппарата Minor Vet («Zoomed», Россия) газовой смесью изофлурана (2,5%, «Laboratorios Karizoo», Испания) и кислорода. Все манипуляции с животными проводились в темноте с использованием красных фонарей. На оба глаза животного предварительно наносили местный анестетик оксибупрокаин («Инокаин» 0.4%, «Сентисс Рус», Россия) и расширитель зрачка тропикамид («Мидримакс» 0.8%, «Сентисс Рус», Россия). ЭРГ регистрировали с помощью волосковых электродов с серебряным напылением, помещаемых на роговицу левого глаза (стимулируется светом) и на роговицу правого глаза (держится в темноте). Заземляющий электрод закрепляли под холкой животного подкожно. Система световой стимуляции включала в себя светодиод с максимумом излучения 525 нм, контроль интенсивности осуществлялся с помощью серых нейтральных светофильтров и варьирования тока светодиода. Сигнал с электродов через усилитель (Model 3000, «А-М Systems», США) с аналоговым низкочастотным фильтром 3 кГц записывали с частотой дискретизации 1 мс/точку. Запись данных, а также управление временем подачи, длительностью и интенсивностью стимулов во время эксперимента осуществляли при помощи плат и программ LabView («National Instruments», Austin, TX). Записывалась серия электрических ответов на короткие (10 мс) вспышки света с возрастающей интенсивностью. Контрольные записи были выполнены на мышах дикого типа на 18 день жизни. Последующая обработка записанных ответов включала корректировку нулевой линии и дополнительную фильтрацию (низкочастотный фильтр Бесселя 30 Гц). Затем определялись экстремальные точки, соответствующие пикам основных компонентов ЭРГ: нисходящей а-волне и восходящей b-волне.

Полученная генетически сконструированная мышиная модель продемонстрировала клинические признаки пигментного аутосомно-рецессивного ретинита из-за делеции двух нуклеотидов в гене pde6b, приводящей к сдвигу рамки считывания и подавлению продукции данного белка. Поскольку ген pde6b мыши имеет ортологичные отношения интрон-экзон, сравнимые с таковыми для человеческого гена pde6b (Wu et al., 2016), использование полученной мышиной модели заболевания пигментного аутосомно-рецессивного ретинита хорошо подходит для изучения нейропатологических процессов и механизмов заболевания, а также для разработки, тестирования и совершенствовании терапевтических подходов.

Актуальность обозначенной проблемы естественно диктуется высокой социальной значимостью проблемы протезирования зрения при дегенеративных поражениях сетчатки. Доступность подходящих и легко генерируемых моделей животных важна для доклинической оценки потенциальных методов лечения, предназначенных для использования у людей.

Похожие патенты RU2791687C1

название год авторы номер документа
Способ редактирования гена GJB2 для исправления патогенного варианта c.del35G в клетках человека, культивируемых in vitro 2021
  • Кривой Андрей Анатольевич
  • Кириллова Анастасия Олеговна
  • Саклакова Виктория Сергеевна
  • Афасижев Роберт Нурбиевич
  • Белова Вера Александровна
  • Павлова Анна Сергеевна
  • Сучалко Олег Николаевич
  • Шевцова Юлия Александровна
  • Зимин Кирилл Андреевич
  • Силачев Денис Николаевич
  • Коростин Дмитрий Олегович
  • Ребриков Денис Владимирович
RU2780677C1
ГЕННОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЛУБОКИХ ИНТРОННЫХ МУТАЦИЙ 2016
  • Жуань, Госян
  • Скариа, Абрахам
RU2759335C2
СПОСОБЫ ЗАЩИТЫ ПЛОДОВ СВИНЕЙ ОТ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВИРУСОМ 2018
  • Пратер, Рэндалл С.
  • Уэллс, Кевин Д.
  • Уитуорт, Кристин М.
RU2778405C2
Технология получения мышей с гуманизированным участком Gnao1 в области однонуклеотидного полиморфизма rs587777057 для тестирования РНК-терапии для GNAO1 c.607 G>A пациентов 2021
  • Бардина Марьяна Владимировна
  • Егорова Татьяна Владимировна
  • Поликарпова Анна Вадимовна
  • Алексей Васильевич Дейкин
RU2757121C1
Способ получения мышиной модели для изучения синдрома Леша-Нихена путем внесения делеции p.Val8del в ген hprt1 2021
  • Кубекина Марина Владиславовна
  • Брутер Александра Владимировна
  • Силаева Юлия Юрьевна
  • Коршунова Диана Сергеевна
  • Коршунов Евгений Николаевич
  • Солдатов Владислав Олегович
  • Дейкин Алексей Васильевич
  • Яблонская Мария Игоревна
RU2768048C1
Способ получения генно-модифицированных лабораторных животных с нуль-аллелем гена P2rx3 2022
  • Брутер Александра Владимировна
  • Силаева Юлия Юрьевна
  • Коршунова Диана Сергеевна
  • Ильчук Леонид Альбертович
  • Окулова Юлия Дмитриевна
  • Потеряев Дмитрий Александрович
  • Кубекина Марина Владиславовна
RU2805173C1
Способ получения генно-модифицированных мышей, экспрессирующих миниген антитромбина III человека, с помощью микроинъекций TelN-линеаризованного фрагмента ДНК 2022
  • Шепелев Михаил Валентинович
  • Коршунова Диана Сергеевна
  • Осадчий Игорь Сергеевич
  • Сафонова Полина Дмитриевна
  • Силаева Юлия Юрьевна
RU2806568C1
СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ И ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С RDH12 2017
  • Беннетт, Джин
  • Сунь, Цзюньвей
  • Васиредди, Видиуллата
RU2764920C2
ДОСТАВКА И ПРИМЕНЕНИЕ СИСТЕМ CRISPR-CAS, ВЕКТОРОВ И КОМПОЗИЦИЙ ДЛЯ ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ И ТЕРАПИИ В ПЕЧЕНИ 2014
  • Чжан Фэн
  • Цун Лэ
  • Жань Фэй
RU2716420C2
Генетическая конструкция, содержащая последовательности химерных направляющих РНК для делеции гена SMN1 человека в культурах клеток человека 2022
  • Шитик Екатерина Максимовна
  • Черепанова Алёна Игоревна
  • Игнатова Юлия Петровна
  • Юдкин Дмитрий Владимирович
RU2816897C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 791 687 C1

Реферат патента 2023 года МЕТОД СОЗДАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ МОДЕЛИ МЫШЕЙ С НОКАУТОМ ГЕНА PDE6B

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения генетически сконструированной мышиной модели пигментного аутосомно-рецессивного ретинита, имеющему делецию двух нуклеотидов во втором экзоне гена pde6b, который кодирует β-субъединицу фосфодиэстеразы циклического гуанидинмонфосфата, путем выключения гена pde6b. Способ включает микроинъекцию смеси направляющей РНК, комплементарной второму экзону гена pde6b, способной образовывать комплекс с эффекторным белком Cas9 и гибридизоваться с целевой последовательностью гена pde6b, и белка Cas9 в зиготу мышей, подсадку зигот после микроинъекций в матку псевдобеременной самки мыши, генотопирование полученных мышей и выведение линии мышей, гомозиготных по нокауту гена pde6b. Изобретение позволяет эффективно получать направленную делецию 2-х нуклеотидов во втором экзоне гена pde6b, приводящую к сдвигу рамки считывания при трансляции данного гена и выключению гена. 3 ил.

Формула изобретения RU 2 791 687 C1

Способ получения генетически сконструированной мышиной модели пигментного аутосомно-рецессивного ретинита, имеющий делецию двух нуклеотидов во втором экзоне гена pde6b, который кодирует β-субъединицу фосфодиэстеразы циклического гуанидинмонфосфата, путем выключения гена pde6b, включающий микроинъекцию смеси направляющей РНК, комплементарной второму экзону гена pde6b, способной образовывать комплекс с эффекторным белком Cas9 и гибридизоваться с целевой последовательностью гена pde6b, которая находится в направлении 3' от мотива, смежного с протоспейсером (РАМ), представленной на фиг. 2 и характеризующейся 5'-UGCGCUGGCGGUACAUAAAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGAAAAAAACAGCAU AGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUC GGUGCUUCG-3', и белка Cas9 в зиготу мышей, подсадку зигот после микроинъекций в матку псевдобеременной самки мыши, генотопирование полученных мышей и выведение линии мышей, гомозиготных по нокауту гена pde6b.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2791687C1

JOON HYUNG YEO et al., Development of a Pde6b Gene Knockout Rat Model for Studies of Degenerative Retinal Diseases, Invest Ophthalmol Vis Sci, 2019, 60(5), 1519-1526, doi: 10.1167/iovs.18-25556
HYUNJI LEE et al., Genome editing methods in animal models, Anim Cells Syst (Seoul), 2020, 24(1), pp 8-16
WEN-HSUAN WU et al., CRISPR Repair Reveals

RU 2 791 687 C1

Авторы

Леонова Елена Ивановна

Ротов Александр Юрьевич

Сопова Юлия Викторовна

Даты

2023-03-13Публикация

2022-02-07Подача