СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ НАТИВНОЙ АМНИОТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ И ОДНОРАЗОВОЕ ЗАЖИМНОЕ УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C12N5/73 C12M3/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии и тканевой инженерии и может быть применено для создания биоинженерных трансплантатов, необходимых для реконструкции поврежденных глазных тканей (кожи, конъюнктивы, роговицы), и позволяет оптимизировать транспортировку, консервацию и применение нативной амниотической мембраны в качестве биотрансплантата или подложки-носителя для культивируемых эпителиальных клеток как в жидких культуральных системах, так и на границе жидкой и воздушной среды путем создания надежной фиксации нативной амниотической мембраны в расправленном состоянии и в плоскости между верхним и нижним краем зажимного силиконового эластичного кольца, что предотвращает ее деформацию или повреждение в результате движения жидкостей в условиях транспортировки, консервации или применения амниотической мембраны в качестве носителя клеток и позволяет сохранять полученную амниотическую мембрану в индивидуальной стерильной упаковке.

Для реконструкции поврежденных эпителиальных тканей в медицине применяется трансплантация культивированных эпителиальных, в том числе и стволовых клеток, различного происхождения в том числе и стволовых, на различных подложках-носителях. Например, в офтальмологии для культивирования клеток эпителия эктодермального происхождения (роговичного, буккального и т.д.) с целью их последующего использования в реконструктивной хирургии глазной поверхности в настоящее время применяется амниотическая мембрана [Tsai, R.J., Li, L.M., Chen, J.K., 2000. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells. N. Engl. J. Med. 343, 86-93; Nakamura, Т., Endo, K., Cooper, L.J., Fullwood, N.J., Tanifuji, N., Tsuzuki, M, Koizumi, N., Inatomi, Т., Sano, Y., Kinoshita, S., 2003. The successful culture and autologous transplantation of rabbit oral mucosal epithelial cells on amniotic membrane. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 106-116], известная своими положительными свойствами и лечебным эффектом при использовании ее в реконструктивной хирургии глазной поверхности, а также хорошими адгезивными свойствами для культивированных эпителиальных, в том числе и стволовых клеток. При этом транспортировка и консервация нативной амниотической мембраны, а также подготовка на ее основе биотрансплантата с культивированными эпителиальными, в том числе и стволовыми клетками, зачастую является достаточно трудной задачей, так как в результате движения жидкостей транспортной среды, среды для консервирования, а также культуральной системы, не иммобилизированная амниотическая мембрана, имеющая толщину около 30 мкм, легко деформируется и сворачивается в тканевой конгломерат. Ее сложно поддерживать в расправленном состоянии. Это приводит к трудности определения необходимой для культивирования и трансплантации поверхности амниотической мембраны, неэффективной ее консервации, неправильному распределению культивированных клеток и к невозможности получения их качественного монослоя.

Ранее нами был также описан способ иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы [патент РФ № RU 2646162 С1 МПК C12N 5/00, опубл. 06.02.2018]. Этот способ позволяет оптимизировать культивирование эпителиальных стволовых клеток в жидких культуральных системах, путем создания надежной фиксации подложки-носителя клеток (на основе биомембран), благодаря тому, что ее механически фиксируют в расправленном состоянии на предварительно залитом в чашку Петри стерильном агар-агаре при помощи стерильных игл от инсулиновых шприцев под углом вкола от 10 до 60 градусов, вершина которого направлена к подложке-носителю клеток. Это предотвращает ее деформацию в результате движения жидкостей культуральной системы в течение всего периода культивирования и транспортировки, а также позволяет консервировать подложку на основе биомембран в расправленном состоянии, однако такой способ фиксации не позволяет перенести в расправленном состоянии амниотическую мембрану с культивированными клетками на глазную поверхность, что определяет ряд технических трудностей при выполнении трансплантации амниотической мембраны как без, так и с культивированными клетками.

Поэтому для решения этих проблем нами был предложен способ иммобилизации нативной амниотической мембраны для транспортировки, консервации и применения ее в качестве носителя культивированных клеток [патент РФ № RU 2680471 С1 МПК C12N 5/00, опубл. 21.02.2019]. Данный способ является наиболее близким к заявленному изобретению и является его прототипом. Он показал высокую эффективность в отношении транспортировки, консервации и применения амниотической мембраны в качестве носителя культивированных клеток и позволил надежно ее зафиксировать без риска деформации и контаминации амниотической мембраны и/или находящейся на ней клеточной культуры. Однако и этот способ имеет ряд недостатков:

1. необходимость предварительного изготовления и стерилизации зажимного устройства (чашка Петри с отсеченным дном и хомут);

2. сложность и длительность механического расправления и натяжения амниотической мембраны на края чашки Петри со срезанным дном при помощи двух пинцетов;

3. высок риск деформации и разрыва тонкой (30 мкм) амниотической мембраны в момент ее натяжения пинцетами на края чашки Петри со срезанным дном;

4. фиксация зажимным хомутом требует применения дополнительного инструментария для достижения максимального его обжатия вокруг чашки Петри со срезанным дном;

5. высок риск разлома пластиковой чашки Петри со срезанным дном в момент фиксации зажимным хомутом;

6. имеется риск повреждения зафиксированных амниотических мембран зажимными частями фиксирующих хомутов при групповой транспортировке в жидких системах;

7. невозможность надежной фиксации амниотической мембраны в области зажимной части фиксирующего хомута;

8. амниотическая мембрана, зафиксированная по данному способу, находится в одной плоскости с верхними краями чашки Петри, по сути, выполняя роль ее дна, в результате чего лиофилизация (высушивание) амниотической мембраны возможна только в положении «мембраной кверху» что не позволяет хранить зажимные устройства с амниотической мембраной сложенными друг на друга и требует использования большой площади для банкирования;

9. отсутствует возможность стерильной индивидуальной упаковки иммобилизированной таким образом амниотической мембраны, так как ее фиксация предусмотрена только в одной плоскости с верхними краями чашки Петри, что при упаковке неизбежно создает условия для соприкосновения амниотической мембраны с упаковочным материалом;

Технический результат при использовании изобретения - создание биоинженерных трансплантатов, необходимых для реконструкции поврежденных глазных тканей (кожи, конъюнктивы, роговицы), оптимизация транспортировки, консервации и применения нативной амниотической мембраны в качестве биотрансплантата или подложки-носителя для культивированных эпителиальных, в том числе и стволовых клеток как в жидких культуральных системах, так и на границе жидкой и воздушной сред путем создания надежной фиксации нативной амниотической мембраны в расправленном состоянии и в плоскости между верхним и нижним краем фиксирующего кольца, что предотвращает ее деформацию или повреждение в результате движения жидкостей в условиях транспортировки, консервации или применения амниотической мембраны в качестве носителя клеток и позволяет сохранять полученную амниотическую мембрану в индивидуальной стерильной упаковке с возможностью укладки устройств с иммобилизированной амниотической мембраной друг на друга.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается благодаря тому, что в способе иммобилизации, для транспортировки, консервации и применения нативной амниотической мембраны в качестве биотрансплантата или подложки-носителя для культивированных эпителиальных, в том числе и стволовых клеток осуществляют выделение амниотической мембраны в условиях стерильной операционной путем механического отделения ее от хориона и очищения от спонгиозного слоя амниона при помощи марлевого шарика или салфетки под биомикроскопическим контролем при помощи операционного микроскопа или щелевой лампы, затем осуществляют укладывание подготовленной на предыдущем этапе нативной амниотической мембраны на закругленные атравматичные края стерильного фиксирующего кольца, затем производят надевание силиконового эластичного кольца на стерильное фиксирующее кольцо с нативной амниотической мембраной, с достижением равномерного натяжения последней по всем меридианам и отсечение лишней амниотической мембраны, затем производят окончательную фиксацию стерильного фиксирующего кольца во внутреннем углублении силиконового эластичного кольца, с вторичной ее иммобилизацией до смещения плоскости нахождения амниотической мембраны на уровень середины высоты самого устройства.

Одноразовое зажимное устройство для иммобилизации, транспортировки, консервации и применения нативной амниотической мембраны в качестве биотрансплантата или подложки-носителя для культивированных эпителиальных, в том числе и стволовых клеток, состоит из стерильного фиксирующего кольца диаметром 35 мм, толщиной 2 мм и высотой 6 мм, выполненного из химически ареактивного для культивируемых клеток пластика с закругленными атравматичными краями и стерильного зажимного силиконового эластичного кольца, конструктивно имеющего соразмерное со стерильным фиксирующим кольцом внутреннее углубление и дополнительный натяжитель амниотической мембраны, выполненный в виде косого продолжения верхнего края стерильного зажимного силиконового эластичного кольца в направлении книзу и к центру устройства под углом 45° на расстояние, равное высоте стерильного зажимного силиконового эластичного кольца, нижний край которого с внутренней стороны переходит в основной натяжитель амниотической мембраны, являющийся одновременно фиксирующим элементом для стерильного фиксирующего кольца.

Изобретение поясняется фиг. 1, на которой схематично показано строение одноразового зажимного устройства на примере его фронтального среза, фиг. 2 (А - вид снизу, Б - вид сверху), на которой приведено фотографическое изображение зажимного устройства, фиг. 3, на которой продемонстрированы этапы фиксации амниотической мембраны по предлагаемому способу, а также фиг. 4, где показаны варианты стерильной упаковки как дегидратированной мембраны (4А), так и в жидкой среде (4Б).

Одноразовое зажимное устройство для иммобилизации, транспортировки, консервации и применения нативной амниотической мембраны в качестве биотрансплантата или подложки-носителя для культивированных эпителиальных, в том числе и стволовых клеток представлено на фиг. 1-2 и состоит из стерильного фиксирующего кольца (1) диаметром 35 мм, толщиной 2 мм и высотой 6 мм, выполненного из химически ареактивного для культивируемых клеток пластика с закругленными атравматичными краями (2) и стерильного зажимного силиконового эластичного кольца (3), конструктивно имеющего соразмерное со стерильным фиксирующим кольцом (1) внутреннее углубление (4) и дополнительный натяжитель амниотической мембраны (5), выполненный в виде косого продолжения верхнего края стерильного зажимного силиконового эластичного кольца (6) в направлении книзу и к центру устройства на угол 45° на расстояние равное высоте (7) самого устройства, при этом нижний край зажимного силиконового эластичного кольца (8) с внутреннего края переходит в основной натяжитель амниотической мембраны (9), являющийся одновременно фиксирующим элементом для стерильного фиксирующего кольца (1).

Способ иммобилизации нативной амниотической мембраны, для транспортировки, консервации и применения ее в качестве биотрансплантата или подложки-носителя для культивированных эпителиальных, в том числе и стволовых клеток подразумевает выполнение нескольких этапов:

1. выделение амниотической мембраны в условиях стерильной операционной путем механического отделения ее от хориона и очищения от спонгиозного слоя амниона при помощи марлевого шарика или салфетки под биомикроскопическим контролем при помощи операционного микроскопа или щелевой лампы (Фиг. 3А);

2. укладывание подготовленной на предыдущем этапе нативной амниотической мембраны на закругленные атравматичные края (2) стерильного фиксирующего кольца (1) (Фиг. 3Б);

3. надевание силиконового эластичного кольца (3) на стерильное фиксирующее кольцо (1) с нативной амниотической мембраной, с достижением равномерного натяжения (1 этап натяжения) последней по всем меридианам при помощи основного натяжителя амниотической мембраны (10) и отсечение лишней амниотической мембраны (Фиг. 3В-Е);

4. окончательная фиксация стерильного фиксирующего кольца (1) во внутреннем углублении (4) силиконового эластичного кольца (3), с вторичной ее иммобилизацией дополнительным натяжителем амниотической мембраны (5), до смещения плоскости нахождения амниотической мембраны на уровень середины высоты самого устройства (2 этап натяжения) (Фиг. 3Ж-И).

Отличительные особенности, обеспечивающие преимущество предлагаемого изобретения перед аналогами следующие:

1. изобретение предусматривает использование промышленно изготавливаемого стерильного зажимного устройства, что не требует предварительного его изготовления и стерилизации;

2. способ прост в выполнении, обеспечивает высокую скорость (в течение нескольких секунд) иммобилизации и расправления нативной амниотической мембраны в сочетании с автоматическим ее двухэтапным механическим равномерным натяжением, что не требует использования дополнительного инструментария;

3. отсутствует риск деформации и разрыва амниотической мембраны в момент ее натяжения;

4. возможна безопасная групповая транспортировка зафиксированных амниотических мембран в жидких системах без риска их деформации или повреждения;

5. за счет нахождения иммобилизированной амниотической мембраны в плоскости, расположенной на середине высоты зажимного устройства, достигается дополнительная ее защита от механических повреждений краями стерильного зажимного силиконового эластичного кольца;

6. обеспечивает надежную фиксацию амниотической мембраны по всему периметру стерильного фиксирующего кольца;

7. благодаря конструктивному решению по пункту №5 для лиофилизации (высушивания) амниотической мембраны в предлагаемом изобретении ориентация зажимного устройства (кверху или книзу) не имеет значения;

8. благодаря конструктивному решению по пункту №5 предусмотрено хранение зажимных устройств, в положении сложенных друг на друга, без риска деформации или повреждения фиксированных в них амниотических мембран, что многократно уменьшает площадь хранения (банкирования) зажимных устройств;

9. благодаря конструктивному решению по пункту №5 имеется возможность стерильной индивидуальной упаковки иммобилизированной амниотической мембраны в зажимном устройстве как в воздушной среде (для лиофилизированной амниотической мембраны), так и в питательной среде (для сохранения жизнеспособности культивированных на поверхности амниотической мембраны эпителиальных клеток) без риска соприкосновения амниотической мембраны с упаковочным материалом;

Таким образом, способ и одноразовое зажимное устройство для иммобилизации, транспортировки, консервации и применения нативной амниотической мембраны в качестве биотрансплантата или подложки-носителя для культивированных эпителиальных, в том числе и стволовых клеток позволяет оптимизировать транспортировку, консервацию и применение нативной амниотической мембраны в качестве биотрансплантата или подложки-носителя для культивированных эпителиальных, в том числе и стволовых клеток как в жидких культуральных системах, так и на границе жидкой и воздушной среды путем создания надежной фиксации нативной амниотической мембраны в расправленном состоянии и в плоскости между верхним и нижним краем зажимного силиконового эластичного кольца, что предотвращает ее деформацию или повреждение в результате движения жидкостей в условиях транспортировки, консервации или применения амниотической мембраны в качестве носителя клеток и позволяет сохранять полученную амниотическую мембрану в индивидуальной стерильной упаковке без риска ее деформации и контаминации.

Изобретение относится к клеточной биологии, тканевой инженерии и медицине, в частности, к офтальмологии, и представляет собой способ иммобилизации нативной амниотической мембраны для транспортировки, консервации и применения в качестве биотрансплантата или подложки-носителя для культивируемых клеток и устройство для его осуществления. Одноразовое зажимное состоит из стерильного фиксирующего кольца диаметром 35 мм, толщиной 2 мм и высотой 6 мм, выполненного из химически ареактивного для культивируемых клеток пластика с закругленными атравматичными краями и стерильного зажимного силиконового эластичного кольца, конструктивно имеющего соразмерное со стерильным фиксирующим кольцом внутреннее углубление. Устройство также содержит дополнительный натяжитель амниотической мембраны, выполненный в виде косого продолжения верхнего края стерильного зажимного силиконового эластичного кольца в направлении книзу и к центру устройства под углом 45° на расстояние, равное высоте стерильного зажимного силиконового эластичного кольца, нижний край которого с внутренней стороны переходит в основной натяжитель амниотической мембраны, являющийся одновременно фиксирующим элементом для стерильного фиксирующего кольца. Настоящее изобретение позволяет надежно фиксировать амниотическую мембрану и способствует ее натяжению, препятствуя ее провисанию, а также позволяет сохранять полученную амниотическую мембрану в индивидуальной стерильной упаковке с возможностью укладки устройств с иммобилизованной амниотической мембраной друг на друга. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 пр.

1. Способ иммобилизации нативной амниотической мембраны для транспортировки, консервации и применения в качестве биотрансплантата или подложки-носителя для культивируемых клеток, отличающийся тем, что осуществляют выделение амниотической мембраны в условиях стерильной операционной путем механического отделения ее от хориона и очищения от спонгиозного слоя амниона при помощи марлевого шарика или салфетки под биомикроскопическим контролем при помощи операционного микроскопа или щелевой лампы, затем осуществляют укладывание подготовленной на предыдущем этапе нативной амниотической мембраны на закругленные атравматичные края стерильного фиксирующего кольца, затем производят надевание силиконового эластичного кольца на стерильное фиксирующее кольцо с нативной амниотической мембраной, с достижением равномерного натяжения последней по всем меридианам и отсечение лишней амниотической мембраны, затем производят окончательную фиксацию стерильного фиксирующего кольца во внутреннем углублении силиконового эластичного кольца, с вторичной ее иммобилизацией до смещения плоскости нахождения амниотической мембраны на уровень середины высоты самого устройства.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве культивируемых клеток выбирают эпителиальные стволовые клетки.

3. Одноразовое зажимное устройство для иммобилизации нативной амниотической мембраны для транспортировки, консервации и применения в качестве биотрансплантата или подложки-носителя для культивируемых клеток, отличающееся тем, что состоит из стерильного фиксирующего кольца диаметром 35 мм, толщиной 2 мм и высотой 6 мм, выполненного из химически ареактивного для культивируемых клеток пластика с закругленными атравматичными краями и стерильного зажимного силиконового эластичного кольца, конструктивно имеющего соразмерное со стерильным фиксирующим кольцом внутреннее углубление и дополнительный натяжитель амниотической мембраны, выполненный в виде косого продолжения верхнего края стерильного зажимного силиконового эластичного кольца в направлении книзу и к центру устройства под углом 45° на расстояние, равное высоте стерильного зажимного силиконового эластичного кольца, нижний край которого с внутренней стороны переходит в основной натяжитель амниотической мембраны, являющийся одновременно фиксирующим элементом для стерильного фиксирующего кольца.