Консорциум микроорганизмов, предназначенный для переработки жидких и твёрдых отходов сельскохозяйственных животных Российский патент 2023 года по МПК A01N63/20 

Область техники

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частном случае к микробиологическим препаратам, для переработки жидких и твердых отходов сельскохозяйственных животных с целью получения ценных биологических удобрений и почвенных грунтов. Эффективно способствует переработке отходов жизнедеятельности сельскохозяйственных животных и птиц в биоорганическое удобрение, подавляет развитие патогенных микроорганизмов.

Уровень техники

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является консорциум штаммов микроорганизмов, используемый для получения биопрепарата - активатора биодиструкции органических отходов животноводства и птицеводства (заявка на выдачу патента на изобретение РФ №2014116492, дата публикации 27.10.2015 г. ). Биопрепарат - активатор биодиструкции органических отходов животноводства и птицеводства содержит консорциум штаммов Bacillus subtilis В-5251, Bacillus amyloliquefaciens B-11265, Trametes hirsuta F-302, Streptomyces fradiae AC-570, Bacillus pasteurii B-10276, Exophiala nigrum Y-748, в соотношении 1:1:1:1:0,5:0,5 соответственно титр бактериальных культур в препарате составляет (1,0-1,2)×10⁹ КОЕ/мл.

Недостатком прототипа является недостаточная скорость переработки жидких и твердых отходов сельскохозяйственных животных.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является увеличение скорости переработки жидких и твердых отходов сельскохозяйственных животных.

Поставленный технический результат достигается за счет того, что в Консорциум микроорганизмов, предназначенный для переработки жидких и твердых отходов сельскохозяйственных животных, включает штаммы Bacillus subtilis B-1499, Bacillus amiloliquefacienc B-1737, Trametes hirsúta F-217, Streptomyces fradiae AC-1022, Sporosarcina pasteurii B-10276.

Раскрытие изобретения

Консорциум - это сообщество двух или более микроорганизмов, которое существует как единое целое, связанное цепями питания и микроэкологией (https://nauchkor.ru/uploads/documents/5f3f2860cd3d3e000153d06c.pdf, с. 6, дата обращения 20.10.21 г. ), совокупность различных взаимозависимых организмов, выступающих как единое целое при использовании определенного субстрата, согласно определению, приведенному в Словаре микробиологии на сайте https://dic.academic.ru/dic.nsf/dic_microbiology/535, дата обращения 16.03.2021 г. Между микроорганизмами в составе консорциума существуют различные формы взаимоотношений, которые позволяет сохранять на протяжении определенного времени устойчивый симбиоз и равновесие в составе этого консорциума.

В состав данного консорциума микроорганизмов, предназначенного для переработки жидких и твердых отходов сельскохозяйственных животных (далее именуемого иногда - консорциум микроорганизмов), входят следующие микроорганизмы: Bacillus subtilis B-1499, Bacillus amiloliquefacienc B-1737, Trametes hirsúta F-217, Streptomyces fradiae AC-1022, Sporosarcina pasteurii B-10276.

Штамм, согласно информации, приведенной в Энциклопедическом словаре на сайте https://dic.academic.ru/dic.nsf/es/65494/штамм, дата обращения 07.10.2021 г., - это чистая культура микроорганизмов одного вида, выделенная из какого-либо источника и обладающая особыми свойствами.

Штамм Bacillus subtilis B-1499 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (далее - ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ B-1499. Штамм Bacillus subtilis B-1499 выделен из чернозема типичного.

Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis B-1499 - мясопептонный бульон (далее по тексту - МПБ).

Питательная среда для хранения (агаризованная среда) Bacillus subtilis B-1499 - мясопептонный агар (далее по тексту - МПА).

Морфология Bacillus subtilis B-1499: клетки палочковидные с закругленными концами, одиночные или соединенные попарно, клетки подвижны, размеры (0,49-0,76)×(2,07-3,30)мкм, спорообразующие. Колонии Bacillus subtilis B-1499 округлые, поверхность складчатая, с кратером посередине, бежево-серого цвета, края волнистые.

Bacillus subtilis B-1499 проявляет выраженную антагонистическую активность в отношении гнилостных микроорганизмов.

Роль Bacillus subtilis B-1499 в данном консорциуме: штамм - продуцент ферментов целлюлазного комплекса, участвует в процессах трансформации целлюлозосодержащего сырья. Bacillus subtilis B-1499 не является патогенным, экологически безопасен.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens B-1737 депонирован во ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ B-1737. Штамм Bacillus amyloliquefaciens B-1737 выделен из помета птиц.

Питательная среда для культивирования Штамм Bacillus amyloliquefaciens B-1737: МПБ.

Питательная среда для хранения Штамм Bacillus amyloliquefaciens B-1737 (агаризованная среда): МПА.

Морфология: клетки штамма Bacillus amyloliquefaciens B-1737 представляют собой грамположительные аэробные спорообразующие прямые палочки с закругленными концами размером (1,5-2,5)×(0,5-0,7) мкм. Клетки штамма Bacillus amyloliquefaciens B-1737 располагаются, как правило, парами или одиночно, цепочки встречаются реже. При спорообразовании клетки штамма Bacillus amyloliquefaciens B-1737 не раздуваются, споры эллипсовидные, расположены центрально.

Bacillus amyloliquefaciens B-1737 - антагонист фитопатогенной бактериальной и грибной микрофлоры.

Роль Bacillus amyloliquefaciens B-1737 в данном консорциуме: участвует в процессах трансформации органического вещества и обеззараживания отходов аграрно-промышленного комплекса от патогенной микрофлоры.

Bacillus amyloliquefaciens B-1737 не является патогенным, экологически безопасен.

Штамм грибов Trametes hirsúta F-217 депонирован во ВКПМ под регистрационным номером коллекции ВКПМ F-217. Штамм грибов Trametes hirsúta F-217 выделен из плодового тела на лиственнице, Минск, Беларусь.

Питательная среда для культивирования Trametes hirsúta F-217: пептон - среда Сабуро без агара.

Питательная среда для хранения Trametes hirsúta F-217 (агаризованная среда): пептон - среда Сабуро с агаром.

Морфология Trametes hirsúta F-217: генеративные гифы мякоти тонкостенные, с пряжками, (3-5)мкм толщиной, скелетные гифы мякоти толстостенные, асептированные, (3-8)мкм толщиной, связывающие гифы мякоти толстостенные, (2-4)мкм толщиной. Цистиды отсутствуют.Базидии четырехспоровые, булавовидные. Споры бесцветные, цилиндрические.

Область применения Trametes hirsúta F-217: продукция целлюлаз и лигниназ.

Роль в данном консорциуме: Trametes hirsúta F-217 принимает активное участие в разложение органического вещества и за счет выделяемых ферментов осуществляет глубокий распад целлюлозосодержащего материала.

Trametes hirsúta F-217 не является патогенным, экологически безопасен.

Штамм Streptomyces fradiae AC-1022 депонирован во ВКПМ под регистрационным номером коллекции ВКПМ AC-1022, выделен из городской почвы города Москвы.

Питательная среда для культивирования Streptomyces fradiae AC-1022: среда Ваксмана без агара.

Питательная среда для хранения Streptomyces fradiae AC-1022 (агаризованная среда): среда Ваксмана с агаром.

Морфология Streptomyces fradiae AC-1022: споры овальные и шаровидные с гладкой оболочкой, размером (0,7-1,0)×(1,0-1,1)мкм. Колонии Streptomyces fradiae AC-1022 округлые, уплощенные, слабоскладчатые, с мучнистой поверхностью диаметром до 4 мм. Воздушный мицелий темно-коричневый, субстратный мицелий вишнево-красный.

Область применения Streptomyces fradiae AC-1022 - синтезирует комплекс протеолитических ферментов.

Роль Streptomyces fradiae AC-1022 в данном консорциуме: участвует в процессах минерализации азотсодержащих соединений. Streptomyces fradiae AC-1022 не является патогенным, экологически безопасен.

Штамм Sporosarcina pasteurii B-10276 депонирован во ВКПМ под регистрационным номером в коллекции ВКПМ B-10276, выделен из свиного навоза.

Питательная среда для культивирования Sporosarcina pasteurii B-10276: криптон-соевый бульон (далее - TSB).

Питательная среда для хранения Sporosarcina pasteurii B-10276 (агаризованная среда): агар триптон-соевый (далее - TSA).

Морфология Sporosarcina pasteurii B-10276: клетки короткие прямые палочки, по Грамму окрашиваются положительно, обладают характерным винтообразным движением, спорообразующие.

Sporosarcina pasteurii B-10276 принимает активное участие в процессах трансформации мочевины, мочевой и гипуровой кислоты, которые в большом количестве содержится в выделениях животных.

Роль Sporosarcina pasteurii B-10276 в данном консорциуме - участвует в процессах трансформации, превращениях амидного азота в доступную форму для растений. Sporosarcina pasteurii B-10276 не является патогенным, экологически безопасен.

Осуществление изобретения

В случае использования указанных выше элементов и средств, изобретение реализуется следующим образом.

Сначала выращивают штамм (культуру) грибов Trametes hirsúta F-217 и бактериальные штаммы (культур) Bacillus subtilis B-1499, Bacillus amiloliquefacienc B-1737, Streptomyces fradiae AC-1022, Sporosarcina pasteurii B-10276 путем твердофазного культивирования (на агаризованной среде) по-отдельности.

Для выращивания штамма (культуры) грибов Trametes hirsúta F-217 на агаризованной среде (твердофазное культивирование) готовят агаризованную среду среду Сабуро. Полученную агаризованную среду стерилизуют при повышенном на 0,5атм давлении в течение 30 минут.Далее разливают стерилизованную агаризованную среду в стерильные чашки Петри и/или стерильные пробирки и оставляют на 6 часов до застывания. Посев культуры Trametes hirsúta F-217 осуществляют микробиологической петлей, методом штриха в чашки Петри и/или пробирки с застывшей агаризованной средой. Чашки Петри и/или пробирки с культурой Trametes hirsúta F-217 инкубируют 10 суток в термостате при 28°С.

Для выращивания бактериальных штаммов (культур) на агаризованной среде (твердофазное культивирование) готовят агаризованную среду для каждого из штаммов отдельно (Bacillus subtilis B-1499, Bacillus amiloliquefacienc B-1737, Streptomyces fradiae AC-1022, Sporosarcina pasteurii B-10276). Агаризованную среду для каждого штамма выбирают из приведенных выше агаризованных сред, указанных для этого штамма. Приготовленные агаризованные среды для каждой из культур стерилизуют при повышеном давлении 1,0атм или 0,5атм в течение 30 минут.Агаризованные среды для каждой из культур разливают горячими в стерильные чашки Петри и/или стерильные пробирки. При этом агаризованную среду для одного штамма помещают в отдельную стерильную чашку Петри и/или стерильную пробирку. Наполненные агаризованными средами чашки Петри и/или пробирки оставляют на 6 часов для застывания агаризованной среды. Посев каждой из бактериальных культур осуществляют микробиологической петлей, методом штриха в чашки Петри и/или пробирки с застывшей агаризованной средой. При этом каждую культуру помещают в отдельную чашку Петри и/или пробирку с приготовленной для этой культуры агаризованной средой. Все чашки Петри и/или пробирки с культурами инкубируют 48 часов или более в термостате при 28°С.

Далее производят оценку качества (культурально-морфологических свойств) бактериальных культур Bacillus subtilis B-1499, Bacillus amiloliquefacienc B-1737, Streptomyces fradiae AC-1022, Sporosarcina pasteurii B-10276, выращенных на агаризованных средах.

Для оценки качества используют бактериальные культуры (соответствующего возраста с учетом справочных данных на них): Bacillus subtilis B-1499, Bacillus amiloliquefacienc B-1737, Streptomyces fradiae AC-1022, Sporosarcina pasteurii B-10276, выращенные на агаризованных средах. Каждую культуру переносят смывом, используя 0,9% раствор NaCl, в отдельную стерильную пробирку. Из каждой пробирки с культурой отбирают 0,1 мл полученной в результате смыва культуральной жидкости. Далее посредством микроскопирования оценивают наличие посторонней микрофлоры в отобранных культуральных жидкостях. Концентрацию бактерий определяют в камере Горяева. Концентрация бактериальных культур должна составлять не менее 1,0×10⁸клеток/мл.

Затем выращивают необходимое количество штамма грибов (грибной культуры) Trametes hirsúta F-217 и бактериальных штаммов Bacillus subtilis B-1499, Bacillus amiloliquefacienc B-1737, Streptomyces fradiae AC-1022, Sporosarcina pasteurii B-10276 на жидких средах (питательных средах для культивирования).

Для выращивания штамма грибов (грибной культуры) Trametes hirsúta F-217 на питательной среде для культивирования (жидкой среде) используют грибную культуру, выращенную на агаризованной среде. Для этого готовят питательную среду Сабуро. В стерильную посуду для культивирования (стерильный матрас) объемом 1 л вносят 250 мл приготовленной питательной среды для культивирования и автоклавируют при повышенном давлении 1,0атм в течение 30 минут. Засевают грибную культуру Trametes hirsúta F-217, выращенную на агаризованной среде, соблюдая соотношение: в 1 стерильный матрас вносится не менее 1,0×10⁶ клеток. Культивирование Trametes hirsúta F-217 проводят микроаэрофильно (с перемешиванием) в течении 14 суток при 28°С.

Для выращивания бактериальных штаммов на питательной среде для культивирования (жидкой среде) используют бактериальные культуры, выращенные на агаризованной среде. Для этого готовят питательные среды для культивирования для каждого из штаммов Bacillus subtilis B-1499, Bacillus amiloliquefacienc B-1737, Streptomyces fradiae AC-1022, Sporosarcina pasteurii B-10276. Питательную среду для культивирования выбирают в соответствие с любым из вариантов для данного штамма, приведенным выше. Каждую питательную среду для культивирования одной культуры объемом 250 мл помещают в отдельный стерильный матрас объемом 1 л. Полученные матрасы с питательными средами для культивирования автоклавируют при повышеном давлении 1,0атм или 0,5атм в течение 30 минут. Далее засевают каждую бактериальную культуру в матрас с подготовленной для этой бактериальной культуры питательной средой для культивирования. Засев осуществляют, соблюдая соотношение: в 1 матрас с питательной средой для культивирования вносят не менее 1,0×10⁸ клеток. Культивирование всех бактериальных культур проводят микроаэрофильно должна составлять не менее (с перемешиванием) в течении 2-4 суток при 28°С.

После проводят оценку качества бактериальных культур (количество жизнеспособных клеток), выращенных на жидких средах. Оценку качества бактериальных культур проводят по критерию - количество жизнеспособных клеток. Для определения количества жизнеспособных клеток бактерий из каждого стерильного матраса стерильно отбирают 0,1 мл культуральной жидкости. Далее проводят окрашивание каждой бактериальной культуры флюоресцентным красителем пропидий иодидом. Посредством микроскопирования определяют количество поврежденных и жизнеспособных бактерий в каждом из исследуемых образцов культуральной жидкости. Флюорисцентный краситель пропидий иодид окрашивает только бактерии с нарушенной проницаемостью за счет проникновения внутрь и взаимодействия с нуклеиновыми кислотами. Таким образом, данный метод позволяет окрасить только мертвые и поврежденные клетки. Количество жизнеспособных клеток должна составлять не менее более 98% от общего числа клеток бактериальной культуры.

Затем выращенные на жидкой среде бактериальные штаммы, а также выращенный на жидкой среде штамм грибов объединяют с перемешиванием для образования консорциума. В частном случае, например, из каждого матраса с бактериальной культурой и из матраса с грибной культурой стерильно отбирают по 0,2 л содержащейся в них культуральной жидкости и объединяют в стерильной посуде. При этом число жизнеспособных клеток в 1 мл полученной смеси культуральных жидкостей должно составлять не менее 1,0×10⁹ КОЕ каждого штамма микроорганизмов.

Полученную смесь культуральных жидкостей, содержащую консорциум микроорганизмов, применяют для изготовления биопрепарата для переработки жидких и твердых отходов сельскохозяйственных животных с целью получения ценных биологических удобрений и почвенных грунтов. Биопрепарат (биологический препарат, биопестицид), согласно определению, приведенному в Техническом регламенте "Требования к безопасности пестицидов (ядохимикатов)" от 29 мая 2008 г. N515 - это препарат, в котором действующим началом является микроорганизм или продукт его жизнедеятельности. Биопрепарат получают путем добавления к указанной смеси стабилизаторов. В качестве стабилизаторов используют хлорид калия, пропионат кальция, соли гуминовых веществ, молочная кислота, олеиновая кислота, бензоат натрия. В частном случае, например, стабилизаторы добавляют в биопрепарат объемом 1 л в количестве хлорида калия 9 г, пропионат кальция 0,85 г, соли гуминовых веществ 15 г, молочная кислота (80%) 0,5 мл, олеиновая кислота 4 мл, бензоат натрия 1,0 г. Кислотность (pH) полученного биопрепарата составляет 7,3-7,5.

Очистка полученного биопрепарата не требуется.

Емкости с биопрепаратом хранят в закрытых складских помещениях, исключающих попадание атмосферных осадков, прямых солнечных лучей и грунтовых вод, в местах недоступных для детей, отдельно от пестицидов. Емкости с биопрепаратом хранят при комнатной температуре (20-25)°С не более 12 месяцев, а при температуре от +4°С до +15°С - не более 18 месяцев. Не допускается хранения емкостей с биопрепаратом ниже +4°С и выше плюс +25°С. Допускается хранение емкостей с биопрепаратом в бытовом холодильнике на отдельной полке, не доступной для детей, в герметично закрытой, невскрытой, фирменной упаковке. При хранении следует избегать контакта со щелочами, с кислотами и нефтепродуктами.

Для переработки жидких и твердых отходов сельскохозяйственных животных в ямах и кучах применяют рабочий раствор, приготовленный с использованием биопрепарата. Для получения рабочего раствора биопрепарат разводят с водой в пропорции: 1000 мл биопрепарата на 50 литров воды. Дозировку биопрепарата необходимо рассчитывать по следующей пропорции: 1 литра рабочего раствора достаточно для переработки 50 м³ навоза. Эффективность возрастает, если рассчитанную дозу биопрепарата разделить на порции, которые добавляют каждую неделю.

Обработку помета или навоза при компостировании проводят рабочим раствором из расчета 2 литра на 1 тонну с влажностью не более 65%. Перемешивание обработанного рабочим раствором помета или навоза производят 1-2 раза в неделю.

Биопрепарат может быть использован для обработки глубокой подстилки в помещениях для содержания всех видов животных. Обработку глубокой подстилки проводят рабочим раствором, приготовленным из расчета 1 литр биопрепарата на 100 литров воды. Обработку осуществляют каждые 3 дня в период образования глубокой подстилки.

Для работы с рабочим раствором, содержащим биопрепарат, в сельскохозяйственном производстве используют типовые и специальные технические средства, применимые в данной области.

За счет введения в состав данного консорциума Sporosarcina pasteurii B-10276, обеспечивают повышение эффективности биопрепарата по сравнению с прототипом вследствие того, что Sporosarcina pasteurii B-10276 во взаимодействии с другими штаммами косорциума принимает активное участие в процессах трансформации мочевины, мочевой и гипуровой кислоты, которые в большом количестве содержатся в выделениях животных.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой консорциум микроорганизмов, предназначенный для переработки жидких и твердых отходов сельскохозяйственных животных, включает штаммы Bacillus subtilis ВКПМ B-1499, Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ B-1737, ВКПМ F-217, Streptomyces fradiae ВКПМ AC-1022, Sporosarcina pasteurii ВКПМ B-10276. Изобретение позволяет увеличить скорость переработки жидких и твердых отходов сельскохозяйственных животных.

Консорциум микроорганизмов, предназначенный для переработки жидких и твёрдых отходов сельскохозяйственных животных, включающий штаммы Bacillus subtilis ВКПМ B-1499, Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ B-1737, ВКПМ F-217, Streptomyces fradiae ВКПМ AC-1022, Sporosarcina pasteurii ВКПМ B-10276.