Универсальная питательная среда для культивирования микроорганизмов Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, а также к сельскому хозяйству и может быть использовано для получения высокоэффективных препаратов - средств защиты растений.

Современные средства защиты растений - это консорциумы микроорганизмов. Культивирование каждого штамма на определенной питательной среде - процесс трудоемкий и дорогостоящий.

Известна питательная среда для культивирования Pseudomonas fluorescens АР-33, состоящая из следующих компонентов, при их соотношении, г/л:

Меласса 15, Калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 0,5, Сульфат магния семиводный 0,2, Горох шлифованный, предварительно обработанный автоклавированием 250, Янтарная кислота 0,05, Лапрол или агар соответственно 5 или 18, Дистиллированная вода до 1 л [1]. Данная среда не предназначена для культивирования Bacillus subtilis и Azotobacter chroococcum.

Известна питательная среда для культивирования Bacillus subtilis L-бульон. Его готовят следующим образом: состав (г/л): дрожжевой экстракт - 5, пептон ферментативный - 15, хлорид натрия - 5, дистиллированная вода - до 1 л (рН 6,8-7,0). Стерилизацию проводили при давлении 1,1 атм. в течение 40 минут [2].

Недостатком данной среды является то, что при культивировании Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 максимальное количество организмов не выше 5×10⁹ КОЕ/мл. Не предназначена для культивирования Pseudomonas fluorescens АР-33 и Azotobacter chroococcum.

Известна питательная среда для культивирования Azotobacter chroococcum: горох (отвар) - 100,0 мл; глюкоза - 10,0 г; (NH₄)₂SO₄ - 1,0 г; KH₂PO₄ H₂O - 0,5 г; K₂HPO₄ - 0,5 г; MgSO₄ 7H₂O - 0,3 г; Са СО₃ - 1,0 г, затем изготовление рабочей культуры на среде, содержащей (г/л): глюкоза - 20,0; кукурузный экстракт - 10,0; дрожжевой экстракт - 0,25; KH₂PO₄ H₂O - 0,5; K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄ 7H₂O - 0,3; Са СО₃ - 1,0 [3].

Недостатком среды является многокомпонентный состав, не предназначена для культивирования Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens.

Целью настоящего исследования является создание недорогой универсальной питательной среды для культивирования микроорганизмов различных таксономических групп, на примере Pseudomonas fluorescens АР-33 Bacillus subtilis 27 D, Bacillus subtilis B-12079, Bacillus subtilis B-2896, Azotobacter chroococcum. Предлагаемая питательная среда, способствует оптимизации технологического процесса и удешевлению готового продукта, когда в одном препарате используются консорциум микроорганизмов.

Сущность технического решения поясняется следующим.

Технология приготовления питательной среды

Для использования гороха шлифованного требуется его предварительная обработка. Горох шлифованный, в количестве 80 г промыть водопроводной водой, помесить в емкость, и довести до литра водой. Затем варить на плите 30 минут и настаивать 1 час. После приготовления остудить до комнатной температуры и дважды процедить через два слоя марли. Полученную суспензию соединить с компонентами (г/л): меласса 10, фосфат калия 2,5, сульфат магния 1, сульфат железа(III) 1, нитрат аммония 1 довести до 1 л дистиллированной водой. Значение рН должно соответствовать 7,5-7,6 ед. рН. Затем стерилизовать в автоклаве 30 минут 1,0 Bar. Полученная среда имеет светло-желтый цвет, «чистый» запах и незначительный осадок. Культивирование микроорганизмов Pseudomonas fluorescens АР-33 Bacillus subtilis 27 D, Bacillus subtilis B-12079, Bacillus subtilis B-2896 производиться 20-24 часа, температура - 30±2°C, принудительная аэрация со скоростью вращения 125 об/мин, культивирование Azotobacter chroococcum через 72 часа без принудительной аэрации.

Контроль за численностью микроорганизмов осуществляют стандартным методом десятикратных разведений.

Пример 1. Сравнение результатов культивирования на питательных средах Pseudomonas fluorescens АР-33

Из таблицы 1 видно, что численность Pseudomonas fluorescens АР-33 на исследуемой питательной среде выше.

Пример 2. Сравнение результатов культивирования на питательных средах Bacillus subtilis 27 D, Bacillus subtilis В-12079, Bacillus subtilis B-2896

Из таблицы 2 видно, что численность микроорганизмов, Bacillus subtilis 27 D и Bacillus subtilis B-2896 сопоставим с ростом на L-бульоне, а численность Bacillus subtilis В-12079 выше.

Пример 3. Сравнение результатов культивирования на питательных средах Azotobacter chroococcum

Из таблицы 3 видно, что численность Azotobacter chroococcum на исследуемой питательной среде выше.

Таким образом, предлагаемая питательная среда для культивирования различных штаммов бактерии Pseudomonas fluorescens АР-33, Bacillus subtilis 27 D, Bacillus subtilis B-12079, Bacillus subtilis B-2896, Azotobacter chroococcum универсальна, содержит не дорогое и доступное сырье, малокомпетентная, проста в приготовлении, не требует дополнительного оборудования для культивирования (нет необходимости темостатировать культуры) что позволяет оптимизировать технологический процесс.

Список литературы

1. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ PSEUDOMONAS FLUORESCENS АР-33 Яценко Е.С., Ширманов М.В., Евдокимов И.Ю., Бойко С.С, Дурникин Д.А. Патент на изобретение RU 2678133 С1, 23.01.2019.

2. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ BACILLUS SUBTILIS. Рыженков Н.С., Яценко Е.С., Микушина И.В., Ширманов М.В., Евдокимов И.Ю. Патент на изобретение RU 2668178 С1, 26.09.2018.

3. Хотянович А.В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе (Методические рекомендации), Ленинград, 1991.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена питательная среда для культивирования Pseudomonas fluorescens АР-33, Bacillus subtilis В-12079, Bacillus subtilis B-2896 или Azotobacter chroococcum. Среда содержит исходные компоненты, г/л: меласса 10, фосфат калия 2,5, сульфат магния 1, сульфат железа (III) 1, нитрат аммония 1, суспензия, полученная путем смешивания 80 г шлифованного гороха с водой, доведенной до литра, варкой смеси в течение 30 минут и настаиванием в течение одного часа, с последующим охлаждением до комнатной температуры и процеживанием дважды через два слоя марли, дистиллированная вода до литра. Изобретение позволяет оптимизировать технологический процесс производства биотехнологических препаратов, где в составе находятся микроорганизмы разных таксономических групп. 3 табл., 3 пр.

Универсальная питательная среда для культивирования микроорганизмов разных таксономических групп Pseudomonas fluorescens АР-33, Bacillus subtilis В-12079, Bacillus subtilis B-2896 или Azotobacter chroococcum, содержащая мелассу, фосфат калия, сульфат магния, сульфат железа (III), нитрат аммония, суспензию, полученную путем смешивания 80 г шлифованного гороха с водой, доведенной до литра, варкой смеси в течение 30 минут и настаиванием в течение одного часа с последующим охлаждением до комнатной температуры и процеживанием дважды через два слоя марли, и дистиллированную воду при заданных соотношениях исходных компонентов, г/л:

меласса 10, фосфат калия 2,5, сульфат магния 1, сульфат железа (III) 1, нитрат аммония 1, суспензия, полученная путем смешивания 80 г шлифованного гороха с водой, доведенной до литра, варкой смеси в течение 30 минут и настаиванием в течение одного часа с последующим охлаждением до комнатной температуры и процеживанием дважды через два слоя марли, дистиллированная вода до 1 л.