Консорциум микроорганизмов, предназначенный для ускорения разложения остатков растительного происхождения и подавления фитопатогенов на растительных остатках и в почве Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C05F17/00 

Область техники

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Конкретно изобретение относится к микробиологическим препаратам, предназначенным для ускорения процессов деструкции (разложения) органических остатков растительного происхождения и подавлению фитопатогенов на растительных остатках и в почве. Фитопатоген, согласно определению, приведенному в ГОСТ 21507-81 Защита растений. Термины и определения. Представляет собой возбудителя болезни растений. Фитопатогенами могут быть вирусы, бактерии, грибы, насекомые, а также токсические вещества и другие.

Уровень техники

Наиболее близким техническим решением является способ получения супрессивного компоста по отношению к фитопатогенным грибам, в частности к возбудителю фузариоза растений fusarium oxysporum (патент РФ №2629776, дата публикации 04.09.2017 г.). Согласно изобретения первоначально приготавливают компостную смесь из органических сельскохозяйственных отходов. Компостирование проводят в помещении, например, при температуре (25-27)°С, при регулярном перемешивании компостной смеси (например, 1 раз/сут) и поддержании влажности смеси, например, на уровне 55%. Проводят оценку зрелости компоста путем определения респираторной активности (интенсивности дыхания микробного сообщества компостов) и фитотоксичности (влияния компонентов компоста на рост и развитие растений). На следующем этапе из компоста готовят компостную суспензию в стерильной водопроводной воде. Выделяют отдельные штаммы, на среде МПА (мясопептонный агар) выделяют бактериальные штаммы, на среде Чапека - грибные штаммы. После этого оценивают возможность использования выделенных штаммов для создания биопрепарата. Для каждого из штаммов проводят оценку его хитиназной, протеазной, антагонистической активности и способности его повышать системную устойчивость растений томата. После проведения тестов выбирают штаммы с максимальной хитиназной (Штамм А), протеазной (Штамм Б), антагонистической активностью (Штамм В) и способностью повышать системную устойчивость растений томата (Штамм Г). Далее оценивают антагонистическую активность каждого из четырех штаммов по отношению к трем оставшимся штаммов. Основываясь на полученных данных, сделан вывод, что из выделенных штаммов А-Г, обладающих разными механизмами супрессивности и не обладающих антагонистической активностью по отношению друг к другу. Наращивают количество микроорганизмов штаммов для составления биопрепарата. Так как выделенные штаммы относятся к разным царствам (грибы, бактерии), их культивирование проводят в течение различного времени, определяют концентрацию (КОЕ/мл) для каждого штамма и составляют биопрепарат таким образом, чтобы концентрация бактериальных клеток составляла 10 КОЕ/мл, грибных 10 КОЕ/мл. Исходя из расчета, берут 450мл штамма А, 450мл штамма Б, 6мл штамма В, 3мл штамма Г и перемешивают для составления биопрепарата. Внесение препарата производят двукратно.

Недостатком известного технического решения является недостаточная скорость разложения остатков растительного происхождения и слабое подавление фитопатогенов на растительных остатках и в почве.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является ускорение разложения остатков растительного происхождения и подавление фитопатогенов на растительных остатках и в почве.

Поставленный технический результат достигается за счет использования консорциума, состтоящего из следующих штаммов микроорганизмов: Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302, Steccherinum murashkinskyi ВКПМ F-6577 и Trichodérma harziánum ВКПМ F-398.

Раскрытие изобретения

Консорциум - это сообщество двух или более микроорганизмов, которое существует как единое целое, связанное цепями питания и микроэкологией (https://nauchkor.ru/uploads/documents/5f3f2860cd3d3e000153d06c.pdf, с.6, дата обращения 20.10.21 г.), совокупность различных взаимозависимых организмов, выступающих как единое целое при использовании определенного субстрата, согласно определению, приведенному в Словаре микробиологии на сайте https://dic.academic.ru/dic.nsf/dic_microbiology/535, дата обращения 16.03.2021 г. Между микроорганизмами в составе консорциума существуют различные формы взаимоотношений, которые позволяет сохранять на протяжении определенного времени устойчивый симбиоз и равновесие в составе этого консорциума.

В состав данного консорциума микроорганизмов, предназначенного для ускорения разложения остатков растительного происхождения и подавления фитопатогенов на растительных остатках и в почве (далее именуемого иногда по тексту - консорциум микроорганизмов), входят следующие штаммы микроорганизмов: Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302, Steccherinum murashkinskyi ВКПМ F-6577 и Trichodérma harziánum ВКПМ F-398. Trametes hirsúta БИМ ГМ-73, Steccherinum murashkinskyi и Trichodérma harziánum, депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (далее по тексту именуемой - ВКПМ).

Штамм, согласно информации, приведенной в Энциклопедическом словаре на сайте https://dic.academic.ru/dic.nsf/es/65494/штамм, дата обращения 07.10.2021 г., - это чистая культура микроорганизмов одного вида, выделенная из какого-либо источника и обладающая особыми свойствами.

Штамм Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 депонирован во ВКПМ под регистрационным номером коллекции ВКПМ F-302, выделен из плодового тела на лиственнице, город Минск, Беларусь.

Морфология Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302: на сусло-агаре - колония округлая с ризоидным краем, пушится вокруг инокулюма, профиль приподнятый, воздушный мицелий белого цвета, субстратный мицелий бесцветный. По мере старения мицелий становится плотным, кожистым.

Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302 является продуцентом целлюлаз и лигиназ при глубинном и твердофазном культивировании, применяется также для получения кормового белка на целлюлозосодержащих субстратах.

Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302 размножается на среде (питательная среда для культивирования) - полной дрожжевой среде (далее по тексту - ПДС) следующего состава: пептон – 10 г, дрожжевой экстракт – 5 г, глюкоза – 20 г, агар-агар – 15 г, вода водопроводная – 1 л. Количество (аналогично для других участников консорциума и этапов технологического процесса) ПДС выбирают в зависимости от требуемого количества производимого продукта. Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302 растет при температуре (22-24)°С.

Для длительного хранения культуру Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302 на мальт-пептонном агаре заливают стерильным вазелиновым маслом медицинского качества, отстоянным после стерилизации до прозрачности. Уровень масла должен быть на 1см выше края косяка (места роста культуры на пробирке). Культура Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302 в таком состоянии может сохранять жизнеспособность до 5 лет. При первых пересевах микроорганизмы обладают несколько пониженной жизнеспособностью. Для восстановления полной жизнеспособности требуется 2-3 пассажа на питательных средах, соответствующих потребностям данного микроорганизма. Рекомендуется использовать культуру Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302 после второго или третьего пассажа. Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302 не является патогенным, экологически не опасен.

Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302 в данном консорциуме отвечает за деструкцию растительных остатков.

Штамм Steccherinum murashkinskyi депонирован во ВКПМ под регистрационным номером коллекции ВКПМ F-6577. Steccherinum murashkinskyi ВКПМ F-6577 выделен из мертвой древесины ивы плакучей, Астраханская область. Способ выделения - микробиологический посев на питательные среды.

Steccherinum murashkinskyi ВКПМ F-6577 представляет собой факультативный анаэроб. На сусло-агаре колонии ризоидные светло-розового окраса, вросшие в агар. Гифы имеют толщину (5-7) мкм, сначала палево-розоватые, затем красно-бурые до темно-бурого окраса. Споры цилиндрические, тонкостенные, (3,3-4,7)х(1,7-2,4) мкм.

Steccherinum murashkinskyi ВКПМ F-6577 культивируются на ПДС.

Steccherinum murashkinskyi ВКПМ F-6577 является продуцентом термостабильных лакказ, продуцентом гибберелинов. Steccherinum murashkinskyi участвует в процессе деструкции лигнина.

В данном консорциуме Steccherinum murashkinskyi ВКПМ F-6577 представляет собой эффективный деструктор лигнина в анаэробных условиях.

Штамм Trichodérma harziánum депонирован во ВКПМ под регистрационным номером коллекции ВКПМ F-398. Происхождение штамма Trichodérma harziánum ВКПМ F-398 - Московский технологичнский институт пищевой промышленности, может быть выделен Trichodérma harziánum ВКПМ F-398 из почвы Московской области. Способ выделения - микробиологический посев на питательные среды.

Морфология Trichodérma harziánum ВКПМ F-398: на сусло-агаре - рост очень быстрый, край колонии бахромчатый, мицелий ватообразный, воздушный мицелий белого цвета. Цвет колоний от травяно-зеленого до зелено-малахитового, пигмент не выделяет. Конидиеносцы - неокрашенные гладкие, прямые или слегка извилистые, 4,0-8,0 нм в диаметре. Конидии яйцевидные, зеленого цвета, расположенные на гифах терминально или интеркалярно, размером (2,7-3,5)×(1,8-3,0) Мкм в диаметре, образует хламидоспоры.

Область применения Trichodérma harziánum ВКПМ F-398 - деструктор целлюлозсодержащих материалов.

В данном консорциуме Trichodérma harziánum ВКПМ F-398 осуществляет биоразложение целлюлозосодержащих компонентов растительных остатков.

Trichodérma harziánum ВКПМ F-398 культивируются на ПДС.

Осуществление изобретения

Изобретение реализуется следующим образом (далее приведен пример реализации изобретения, содержащий последовательно выполняемые технологические процессы).

Сначала выращивают входящие в состав консорциума штаммы (культуры) микроорганизмов на агаризованной среде (твердофазное культивирование). Для этого, в частном случае, для всех микроорганизмов (Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302, Steccherinum murashkinskyi ВКПМ F-6577 и Trichodérma harziánum ВКПМ F-398) готовят питательную среду ПДС, описанную выше. Среду стерилизуют при повышенном давлении 0,5 атм в течение 30 минут и разливают в стерильные чашки Петри и/или стерильные пробирки и оставляют на 6 часов для застывания. Посев каждой отдельной культуры осуществляют микробиологической петлей, методом штриха в чашки Петри и/или пробирки с застывшей агаризованной средой. При этом в каждую отдельную чашку Петри и/или пробирку с застывшей агаризованной средой осуществляют посев (по отдельности) одной культуры. Все чашки Петри и/или пробирки с культурами (штаммами) инкубируют десять суток в термостате при 28°С.

Далее выращивают необходимое количество микроорганизмов на жидкой питательной среде, используя микробные культуры, выращенные ранее, как указано выше. Для этого готовят питательную среду следующего состава: пептон – 10 г, дрожжевой экстракт – 5 г, глюкоза – 20 г, вода водопроводная – 1 л. В колбу соответствующего объема вносят питательную среду (в одну колбу помещают питательную среду не более 1/3 ее объема, например, 250 мл питательной среды на колбу объемом 1 л). Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, колпачками из крафт бумаги и автоклавируют при избыточном давлении 0,5 атм в течение 30 минут. Каждую из культур Trametes hirsúta БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302, Steccherinum murashkinskyi ВКПМ F-6577 и Trichodérma harziánum ВКПМ F-398, засевают в отдельные колбы с питательной средой. Культивирование проводят микроаэрофильно в течение 14 суток при 28°С. В результате в каждой из колб формируется културальная жидкость, содержащая соответствующие микроорганизмы.

Консорциум микроорганизмов формируют из культур, выращенных на жидкой среде (ПДС) путем их смешивания. Из каждой колбы отбирают необходимое количество культуральной жидкости и переносят в посуду для смешивания (бутылку). В частном случае, например, объемы культуральных жидкостей в смеси составляют для Trametes hirsúta - 0,5 л, Steccherinum murashkinskyi - 0,3 л, Trichodérma harziánum - 0,2 л.

Консорциум микроорганизмов используют для получения биопрепарата, предназначенного для ускорения процессов деструкции (разложения) органических остатков растительного происхождения и подавлению фитопатогенов на растительных остатках и в почве. Биопрепарат (биологический препарат, биопестицид), согласно определению, приведенному в Техническом регламенте "Требования к безопасности пестицидов (ядохимикатов)" от 29 мая 2008г. N515 - это препарат, в котором действующим началом является микроорганизм или продукт его жизнедеятельности. Биопрепарат получают путем добавления к указанной смеси стабилизаторов. В качестве стабилизаторов используют хлорид калия, пропионат кальция, соли гуминовых веществ, молочную кислоту, олеиновую кислоту, мочевину и бензоат натрия. В частном случае хлорид калия – 9 г/л, пропионат кальция - 0,65 г/л, соли гуминовых веществ – 15 г/л, молочная кислота – 2 мл (для концентрации 40%), олеиновая кислота – 4 мл (для концентрации 40%), мочевина - 1,5 г/л, бензоат натрия - 1,5 г/л. Кислотность биопрепарата (pH) составляет 7,3-7,5. В 1 мл полученного биопрепарата содержится не менее 1×10⁹ КОЕ (колониеобразующих единиц) каждого штамма, входящих в консорциум, а также стабилизаторы. Очистка полученного биопрепарата не требуется.

Емкости с биопрепаратом хранят в закрытых складских помещениях, исключающих попадание атмосферных осадков, прямых солнечных лучей и грунтовых вод, в местах недоступных для детей, отдельно от пестицидов. Емкости с биопрепаратом хранят при комнатной температуре (20-25)°С до 12 месяцев, а при температуре +4°С до +15°С - до 18 месяцев, не допускается хранение биопрепарата ниже +4°С и выше плюс +25°С.

Для работы с биопрепаратом используют в сельскохозяйственном производстве типовые и специальные технические средства, предназначенные для выполнения соответствующих работ.

Обработку растительных остатков производят рабочим раствором, приготовленным на основе биопрепарата. Для приготовления рабочего раствора из биопрепарата используют нехлорированную воду. При приготовлении рабочего раствора в рабочую емкость (бак поливочной системы или опрыскивателя) наливают нехлорированную воду, примерно на 2/3 объема рабочей емкости. При включенном перемешивающем устройстве добавляют в рабочую емкость с нехлорированной водой необходимое количество биопрепарата. Доливают воду до полного объема. Раствор перемешивают и проводят обработку.

Например, в личных подсобных хозяйствах для получения рабочего раствора разводят 100мл биопрепарата на 10 л воды (1:100).

Слой растительных остатков высотой (10-15)см поливают рабочим раствором из расчета (4-6)л рабочего раствора на 1 м² площади слоя. Далее сверху указанного слоя растительных остатков насыпают слой земли из расчета на 1 м² слоя растительных остатков 1 ведро земли. Полученный слой растительных остатков и слой земли перемешивают. Сверху могут быть засыпаны следующие слои растительных остатков с послойной обработкой каждого слоя растительных остатков рабочим раствором и добавлением земли, как описано для предыдущего слоя растительных остатков.

Полученную смесь растительных остатков с рабочим раствором и землей (компостную кучу) накрывают темной пленкой. В зависимости от состава растительных остатков и температуры компостной кучи компост будет готов через (1-3) месяца.

Компост можно вносить в почву, даже если он не дозрел, но не следует допускать попадания недозревшего компоста в приствольную зону.

Использование полученного биопрепарата позволяет ускорить разложение растительных остатков и перегнивание компоста (через 25-45 дней перегной можно вносить в почву).

Входящие в состав консорциума микроорганизмы образуют устойчивую структуру, которая осуществляет пролонгированное воздействие на остатки растительного происхождения и подавляют фитопатогены на них и в почве

Таким образом обеспечивается ускорение разложения остатков растительного происхождения и подавление фитопатогенов на растительных остатках и в почве.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение реализуется путём использования консорциума, состоящего из следующих штаммов микроорганизмов: БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302, Steccherinum murashkinskyi ВКПМ F-6577 и ВКПМ F-398. Изобретение позволяет ускорить разложение остатков растительного происхождения и подавить фитопатогены на растительных остатках и в почве.

Консорциум для ускорения разложения остатков растительного происхождения и подавления фитопатогенов на растительных остатках и в почве, состоящий из штаммов микроорганизмов БИМ ГМ-73 ВКПМ F-302, Steccherinum murashkinskyi ВКПМ F-6577 и ВКПМ F-398.