Способ очистки дигликозилированного белка интерферон-бета Российский патент 2023 года по МПК C07K14/565 C07K1/18 C07K1/20 C07K1/22 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с Корейской патентной заявкой № 10-2019-0087244, поданной 18 июля 2019 г., содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.

Настоящее изобретение относится к способу очистки дигликозилированного белка интерферон-бета и, более конкретно, к способу очистки дигликозилированного белка интерферон-бета, и дигликозилированному белку интерферон-бета, выделенному указанным способом, где способ включает стадии (а) получения культурального раствора, содержащего интерферон-бета, экспрессированный в клетке-хозяине; (b) проведения аффинной хроматографии в отношении полученного на стадии (а) культурального раствора; (c) инактивации низким рН полученного на стадии (b) раствора; (d) проведения хроматографии гидрофобного взаимодействия (гидрофобная хроматография) в отношении полученного на стадии (c) раствора; (e) проведения анионообменной хроматографии в отношении полученного на стадии (d) раствора; и (f) проведения катионообменной хроматографии в отношении полученного на стадии (е) раствора.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящее время известно 8 типов интерферонов (ИФН) человека, которые по физико-химическим и функциональным признакам классифицируются на два типа - Тип 1 и Тип 2. Интерферон Типа 1 включает альфа-, бета-, каппа-, дельта-, эпсилон-, тау- и омега-интерфероны, а интерферон Типа 2 включает гамма-интерферон.

Интерфероны (ИФНы) подавляют репликацию вируса, проявляя противовирусную активность, подавляют пролиферацию клетки и регулируют иммунный ответ. Среди них интерферон-бета представляет собой цитокин, продуцируемый в ответ на вирусную инфекцию и т. п., и в частности применяется в качестве терапевтического агента для рассеянного склероза (РС) и т. п., а также проявляет противораковую активность при применения в качестве противоракового терапевтического агента.

В настоящее время для лечения применяют два типа интерферона-бета. Во-первых, интерферон-бета-1а представляет собой гликозилированный белок, который продуцируют из яичника китайского хомячка (СНО), включая ген интерферон-бета человека, состоит из 166 аминокислотных остатков и имеет размер 25 кДа. Во-вторых, интерферон-бета-1b представляет собой белок, состоящий из 165 аминокислотных остатков, продуцируемый в E. coil, причем в нем удален сахар, удален остаток метионина в качестве аминокислоты в положении 1, а остаток цистеина в положении 17 замещен серином. Коммерциализированный в настоящее время интерферон-бета-1а включает Rebif и Avonex, а интерферон-бета-1b включает Betaseron и Extavia.

С другой стороны, гликопротеин представляет собой белок, содержащий олигосахаридную цепь, которая ковалентно присоединена к полипептидной боковой цепи. Гликопротеин обладает очень разными физиологическими функциями, включая структурную, защитную, транспортную, гормональную или ферментативную функции, и общеизвестно, что присоединенная сахарная цепь играет важную роль в реализации этих физиологических функций. В настоящее время гликопротеин может быть получен рекомбинантно, но чтобы извлечь из культуры клеток целевой гликопротеин требуется глубокий способ очистки. Поскольку отсоединение, модификация и т. п. сахарной цепи во время процессов продуцирования/экспрессии и очистки влияют на физиологические функции, важно настроить каждый процесс таким образом, чтобы она правильно формировалась в процессе продуцирования/экспрессии или таким образом, чтобы не отсоединять и не модифицировать сахарную цепь в процессе очистки.

Интерферон также представляет собой разновидность гликопротеина, и в случае дикого типа интерферона-бета сахарная цепь присоединена к аминокислоте в положении 80. В частности, в 2004 г. был разработан мутантный белок интерферон-бета, вызывающий мутацию гликозилирования интерферона, и были проведены исследования по применению белка в качестве терапевтического агента. Для того чтобы применять интерферон-бета в качестве терапевтического агента, он должен быть получен в достаточном количестве и иметь высокую чистоту, а также должен быть очищен в форме, подходящей для длительного хранения. Поскольку интерферон-бета менее стабилен, то в ходе очистки обычно происходят реакции разложения, такие как расщепление пептидной связи, дезамидирование и окисление метионина до сульфида метионина, и дисульфидный обмен (US2012/0177603), и в процессе очистки необходимо учитывать эти реакции разложения.

Кроме того, поскольку для очистки в целом может применяться множество различных способов хроматографии, для поиска подходящего способа очистки необходимо протестировать огромное количество комбинаций. В этих комбинациях могут сочетаться и применяться различные порядки действий и даже разное количество способов хроматографии, но согласно этим комбинациям эффект очистки недостаточен, или очищенный белок может быть поврежден, и в результате для очистки гликозилированного белка в данной области техники всегда требуется способ определения стадий хроматографии в подходящем порядке.

В частности, в смежных областях техники существуют недостатки, связанные с тем, что поскольку в процессе очистки применяют органические растворители, при крупномасштабном производстве требуется специальное оборудование, а поскольку процесс очистки сложен, стоимость будет высокой. Поэтому необходимо разработать способ очистки дигликозилированного белка интерферон-бета, который легок при крупномасштабной очистки, прост и экономичен и имеет высокий выход без применения органических растворителей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

В силу вышеуказанных обстоятельств авторы настоящего изобретения провели исследование по разработке способа очистки дигликозилированного белка интерферон-бета, и в результате обнаружили, что очистка с применением аффинной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия и ионообменной хроматографии представляет собой новый способ очистки, который обеспечивает достаточное количество белка и высокую чистоту, и снижает возникновение модификации гликозилирования или других модификаций интерферон-бета, и тем самым создали настоящее изобретение.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является предложение способа очистки дигликозилированного белка интерферон-бета, включающего стадии (а) получения культурального раствора, содержащего интерферон-бета, экспрессированный в клетке-хозяине; (b) проведения аффинной хроматографии в отношении полученного на стадии (а) культурального раствора; (c) инактивации низким рН полученного на стадии (b) раствора; (d) проведения хроматографии гидрофобного взаимодействия в отношении полученного на стадии (c) раствора; (e) проведения анионообменной хроматографии в отношении полученного на стадии (d) раствора; (f) проведения катионообменной хроматографии в отношении полученного на стадии (е) раствора.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение дигликозилированного белка интерферон-бета, полученного способом очистки по настоящему изобретению.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

Для достижения указанной задачи в настоящем изобретении предлагают способ очистки дигликозилированного белка интерферон-бета, включающий стадии (а) получения культурального раствора, содержащего интерферон-бета, экспрессированный в клетке-хозяине; (b) проведения аффинной хроматографии в отношении полученного на стадии (а) культурального раствора; (c) инактивации низким рН полученного на стадии (b) раствора; (d) проведения хроматографии гидрофобного взаимодействия в отношении полученного на стадии (c) раствора; (e) проведения анионообменной хроматографии в отношении полученного на стадии (d) раствора; (f) проведения катионообменной хроматографии в отношении полученного на стадии (е) раствора.

Для решения другой задачи настоящее изобретение обеспечивает дигликозилированный белок интерферон-бета, полученный способом очистки по настоящему изобретению.

Далее будет подробно описано настоящее изобретение.

Общие способы хроматографии и их применение известны специалистам в данной области техники.

Используемый в контексте настоящего изобретения термин “материал для хроматографии” означает твердый материал, который могут применять без дополнительной модификации в качестве материала для хроматографии, например гидроксиапатит или материал для аффинной хроматографии, и означает материал, включающий сыпучий основной материал, к которому функциональная группа для хроматографии предпочтительно присоединена ковалентной связью. Сыпучий основной материал демонстрирует по существу отсутствие взаимодействия с процессом хроматографии, т. е. взаимодействия между подлежащим разделению полипептидом и функциональной группой для хроматографии материала для хроматографии. Материал для хроматографии просто содержит функциональную группу для хроматографии, прикрепленную к нему, и обеспечивает трехмерную структуру таким образом, чтобы раствор, содержащий подлежащий разделению материал, имел доступ к функциональной группе для хроматографии. Сыпучий основной материал предпочтительно представлен в твердой форме. Соответственно, “материал для хроматографии” предпочтительно представляет собой твердую фазу, в которой функциональная группа для хроматографии предпочтительно присоединена с помощью ковалентной связи. “Функциональная группа для хроматографии” предпочтительно представляет собой ионогенную гидрофобную группу, или гидрофобную группу, или составную группу, в которой различные функциональные группы для хроматографии скомбинированы для связывания только некоторых видов полипептидов, или заряженную группу, связанную ковалентной связью.

Используемые в контексте настоящего изобретения термины “полипептид” и “белок” применяют в общепринятом значении, т. е. обозначающими полимер аминокислотных остатков. Полипептид не ограничен конкретной длиной, но в контексте настоящего изобретения его могут, как правило, относить к фрагменту полноразмерного белка. Полипептид или белок может включать посттрансляционную модификацию, например гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т. д., и другие модификации (природные модификации или неприродные модификации), известные в данной области техники. Полипептид и белок по настоящему изобретению могут получать с помощью любых различных известных рекомбинантных и/или синтетических технологий.

Используемые в контексте настоящего изобретения термины “способ связывания” и “способ элюирования” означают виды операций способа хроматографии, в которых раствор, содержащий желаемый материал (например, дигликозилированный интерферон-бета), находится в контакте со статической фазой, предпочтительно твердой фазой, где желаемый материал связывается с твердофазным материалом для хроматографии. В результате, желаемый материал прикрепляется к твердой фазе, а нежелательный материал удаляется потоком растворителя или вместе с супернатантом. После этого желаемый материал элюируют из твердой фазы и извлекают из твердой фазы вместе с элюирующим раствором. Это необязательно означает, что нежелательный материал удаляют полностью, но 50% или больше, предпочтительно 75% или больше, более предпочтительно 85% или больше, наиболее предпочтительно 95% или больше нежелательного материала удаляют.

Используемые в контексте настоящего изобретения термины “непрерывное элюирование” и “способ непрерывного элюирования” означают, например, что концентрация материала, вызывающего элюирование, т. е. отделение связанного материала от материала для хроматографии, непрерывно увеличивается или уменьшается. То есть концентрацию изменяют серией небольших стадий изменения концентрации вызывающего элюирование материала не более чем на 2%, предпочтительно 1% на каждой стадии. При таком “непрерывном элюировании” одно или несколько условий хроматографического способа, например рН, ионная сила, концентрация соли и/или скорость потока, изменяют линейно или геометрически. Предпочтительно изменения происходят линейно.

Используемые в контексте настоящего изобретения термины “постадийное элюирование” и “способ постадийного элюирования” означают, например, способ хроматографии, при котором концентрация материала, вызывающего элюирование, т. е. отделение связанного материала от материала для хроматографии, увеличивается или уменьшается одномоментно, т. е. от значения/уровня до следующего значения/уровня. При “постадийном элюировании” одно или несколько условий хроматографического способа, например рН, ионная сила, концентрация соли и/или скорость потока, одномоментно изменяют от первого значения, например от начального значения, до второго значения, например конечного значения. При изменении стадии концентрацию вызывающего элюирование материала изменяют так, чтобы она была больше 5%, предпочтительно 10%. “Постадийное элюирование” изменяют постепенно, т. е. постадийно, в отличие от линейного изменения. В “способе постадийного элюирования” после каждого увеличения собирают новую фракцию. После каждого увеличения условие сохраняют до следующей стадии в способе элюирования.

В контексте настоящего описания термины “выделенный белок” и “выделенный полипептид” означают полипептиды, которые по существу свободны от примесей, таких как углеводородные, липидные примеси или примеси других белков, связанных с полипептидами в природе. Обычно препарат выделенного белка содержит очень чистые полипептиды, т. е. около 80% чистоты, около 90% чистоты или более, около 95% чистоты или более, 95% чистоты или более, или 99% чистоты или более. Способ, демонстрирующий, что конкретный состав белка содержит выделенные полипептиды, заключается, например, в проявлении одной полосы после электрофореза препарата белка и окрашивания геля Кумасси Бриллиантовым Синим. Однако термин “выделенный” не исключает существование того же полипептида в другой физической форме, такой как димер, производная форма, правильно развернутая форма, неправильно сшитая дисульфидная форма или скремблированная форма.

Используемый в контексте настоящего изобретения термин “полинуклеотид” или “нуклеиновая кислота” относится к дезоксирибонуклеотиду (ДНК) или рибонуклеотиду (РНК) в одно- или двухцепочечной форме. Если не ограничено иным, “полинуклеотид” или “нуклеиновая кислота” также включает известные аналоги природных нуклеотидов, которые гибридизируются с нуклеиновыми кислотами аналогично природным нуклеотидам.

Используемый в контексте настоящего изобретения термин “активность интерферона-бета человека” определяют, как одну или несколько активностей, которой достаточно для любого полипептида, чтобы быть идентифицированным в качестве интерферона-бета человека среди известных активностей интерферона-бета человека. Такие активности могут включать, например, активность по снижению, облегчению или лечению рассеянного склероза, противовирусную активность, активность по ингибированию клеточного роста, антиростовую активность, антипролиферативную активность, активность по усилению токсичности клеток лимфоцитов, иммуннорегуляторную активность, активность дифференциальной индукции или ингибирования клеток-мишеней, повышенную активность выработки цитокинов, повышенную активность эффекта цитотоксических Т-клеток, повышенную активность эффекта макрофагов, повышенную активность естественных клеток-киллеров, активность по профилактике или лечению рака, активность по профилактике или лечению аутоиммунных заболеваний, активность по профилактике или лечению вирусной инфекции, активность по профилактике или лечению заболеваний, связанных с ВИЧ, активность по профилактике или лечению гепатита С, активность по профилактике или лечению ревматоидного артрита и т. п.

Используемый в контексте настоящего изобретения термин “экспрессия” относится к образованию белков или нуклеиновых кислот в клетках.

Используемое в контексте настоящего изобретения однобуквенное (трехбуквенное) обозначение аминокислот соответствует стандартным правилам сокращений в области биохимии: A (Ala): Аланин; C (Cys): Цистеин; D (Asp): Аспартовая кислота; E (Glu): Глутаминовая кислота; F (Phe): Фенилаланин; G (Gly): Глицин; H (His): Гистидин; I (IIe): Изолейцин; K (Lys): Лизин; L (Leu): Лейцин; M (Met): Метионин; N (Asn): Аспарагин; O (Ply): Пирролизин; P (Pro): Пролин; Q (Gln): Глутамин; R (Arg): Аргинин; S (Ser): Серин; T (Thr): Треонин; U (Sec): Селеноцистеин; V (Val): Валин; W (Trp): Триптофан; Y (Tyr): Тирозин.

Настоящее изобретение предлагает способ очистки дигликозилированного белка интерферон-бета, включающий стадии:

(а) получение культурального раствора, содержащего интерферон-бета, экспрессированный в клетке-хозяине;

(b) проведение аффинной хроматографии в отношении полученного на стадии (а) культурального раствора;

(c) инактивация низким рН полученного на стадии (b) раствора;

(d) проведение хроматографии гидрофобного взаимодействия в отношении полученного на стадии (c) раствора;

(e) проведение анионообменной хроматографии в отношении полученного на стадии (d) раствора;

(f) проведение катионообменной хроматографии в отношении полученного на стадии (е) раствора.

В способе очистки (или способе выделения) по настоящему изобретению соответствующие стадии выглядят следующим образом.

Стадия (а): получение культурального раствора, содержащего интерферон-бета, экспрессированный в клетке-хозяине;

Интерферон-бета (полипептид интерферон-бета или белок интерферон-бета) по настоящему изобретению может представлять собой интерферон-бета, в котором сайт аргинина (R27) в положении 27 дикого типа интерферона-бета мутирован в треонин (R27Т). Предпочтительно интерферон-бета по настоящему изобретению может представлять собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1. Следует понимать интерферон-бета по настоящему изобретению как полипептид, обладающий активностью интерферона-бета, в котором сахарная цепь связана с двумя сайтами аминокислот SEQ ID NO: 1 в положениях 25 и 80. Предпочтительно интерферон-бета по настоящему изобретению представляет собой интерферон-бета человека.

Интерферон-бета по настоящему изобретению может быть экспрессирован в клетке-хозяине, трансформированной для экспрессии таким образом, чтобы ген экспрессировался внутрь или вовне клетки. В настоящем изобретении могут выбрать клетку-хозяина для регулирования экспрессии введенной последовательности, или манипулировать генным продуктом определенным образом. Различные клетки-хозяева обладают характерными и специфическими механизмами трансляции и посттрансляционного процессинга и модификации белка. Подходящую клеточную линию или систему-хозяин могут выбрать для получения предпочтительной модификации и процессинга экспрессируемых гетерогенных белков. Экспрессия в дрожжах может продуцировать биологически активные продукты. Экспрессия в эукариотических клетках может повышать вероятность естественного фолдинга.

В настоящем изобретении могут использоваться любые клетки-хозяева, которые могут непрерывно и стабильно экспрессировать интерферон-бета, но для экспрессии дигликозилированного интерферона-бета прокариотические клетки-хозяева не могут быть применены. Клетки-хозяева по настоящему изобретению могут быть, например, дрожжами (Saccharomyces cerevisiae), клетками насекомого, клетками животного и клетками человека, предпочтительно клеточными линиями яичника китайского хомячка (СНО), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN и MDCK, более предпочтительно клеточной линией CHO.

В настоящем изобретении культивирование могут проводить в соответствующих условиях, обеспечивающих экспрессию целевого белка, интерферона-бета, и такие условия могут соответствовать известным методам. Трансформированные клетки-хозяева могут культивировать в больших количествах с помощью обычных способов культивирования. Среда для культивирования может представлять собой среду, состоящую из источника углерода, источника азота, витаминов и минералов, например такую среду, как SFM4CHO, optiCHO SFM; а 200 мМ L-глютамина и т. п. могут применять в качестве добавки. Клетки-хозяева можно выращивать при обычных условиях культивирования, например в диапазоне температур от 15 °С до 45 °С в течение от 10 ч до 40 ч. Могут проводить центрифугирование или фильтрацию, чтобы удалить культуральную среду из культурального раствора и выделить только сконцентрированные клетки, и эту стадию могут проводить специалисты в данной области техники по мере необходимости.

Стадия (b): проведение аффинной хроматографии в отношении полученного на стадии (а) культурального раствора

В контексте настоящего изобретения термин “аффинная хроматография” означает способ хроматографии с помощью материала для аффинной хроматографии. В аффинной хроматографии разделение полипептидов проводится с учетом их биологической активности или химической структуры на основании электростатического взаимодействия, гидрофобного связывания и/или водородного связывания с функциональной группой для хроматографии. Для выделения специфически связанных полипептидов из материала для аффинной хроматографии добавляют конкурирующие лиганды или изменяют хроматографические условия, такие как значения рН, полярность или ионная сила буфера. Материал для аффинной хроматографии представляет собой материал для хроматографии, включающий составную функциональную группу для хроматографии, скомбинированную с различными простыми функциональными группами для хроматографии таким образом, чтобы связывать только определенные типы полипептидов. Этот хроматографический материал специфически связывается с некоторыми типами полипептидов в соответствии со специфичностью функциональной группы для хроматографии.

В настоящем изобретении материал для аффинной хроматографии может представлять собой аффинную хроматографию с красителем, обладающим аффинностью к интерферону, предпочтительно интерферону-бета, а Голубую Сефарозу могут применять в качестве смолы. Аффинная хроматография с красителем может проводиться в матрице, фиксированной, например, Голубой Декстран Сефарозой R или Цибакроном R Голубым. Например, могут применять Matrex Gel Blue A от Amicon, Fraktogel 45 TSK AF-Blue от Merck или Голубая Сефароза R 6FF (быстропоточная) от GE Healthcare.

В типичном варианте осуществления настоящего изобретения дигликозилированный белок интерферон-бета является подтверждением того, что выделен белок интерферон-бета, в частности сохранено гликозилированное состояние при аффинной хроматографии с применением Голубой Сефарозы R 6FF, и выделен белок интерферон-бета. Соответственно, в настоящем изобретении предпочтительно могут применять Голубую Сефарозу R 6FF в качестве материала для аффинной хроматографии.

Из различной технической литературы в данной области техники известны выделение и очистка интерферона-бета путем аффинной хроматографии с красителем с помощью Голубой Сефарозы R 6FF, а способ проведения хроматографии в технической литературе включен в данное описание путем ссылки.

Интерферон-бета сильно связывается с Голубой Сефарозой R 6FF, и связанные белки можно промывать различными буферами перед элюированием. Поскольку интерферон-бета хорошо связывается с Голубой Сефарозой R 6FF даже при низкой концентрации в обычных условиях, эта стадия подходит в качестве первой стадии хроматографии в способе очистки по настоящему изобретению. В качестве реагента для элюирования ИФН-бета могут применять хаотропный агент, соль или т. п., а могут применять водный раствор, включающий восстанавливающий агент, такой как этиленгликоль или пропиленгликоль. Предпочтительно для элюирования на данной стадии могут применять водный раствор пропиленгликоля, и могут применять 20-40% водный раствор пропиленгликоля.

Стадия (c): инактивация низким рН полученного на стадии (b) раствора

В контексте настоящего изобретения термин “инактивация низким рН” представляет собой инактивацию внешних вирусных агентов в кислых условиях с рН 4,0 или меньше путем добавления кислоты с целью инактивации оболочечного вируса.

Предпочтительно инактивацию низким рН проводят путем добавления кислоты для того, чтобы получить рН от рН 2,0 до рН 4,0, более предпочтительно от рН 3,0 до рН 4,0 или от рН 3,5 до рН 4,0. Время обработки и температура могут составлять от 10 °С до 30 °С или от 15 °С до 25 °С и от 30 мин до 4 ч. После обработки кислый раствор нейтрализуют до рН от 6,0 до 7,5, предпочтительно рН от 6,5 до 7,5, применяя при необходимости щелочной раствор, и проводят последующую стадию.

Добавляемая кислота может представлять собой неорганическую кислоту, такую как фосфорная кислота, соляная кислота и серная кислота, или органическую кислоту, такую как уксусная кислота и щавелевая кислота, и предпочтительно водный раствор фосфорной кислоты.

В варианте осуществления настоящего изобретения инактивацию низким рН проводили путем добавления к элюату со стадии (b) 10-кратно разбавленного водного раствора фосфорной кислоты с рН 3,5, чтобы понизить рН до 4 или меньше, и обработки водного раствора фосфорной кислоты при 15-25 °С в течение 1 ч, а потом проводили нейтрализацию с применением 2 М основания Trizma.

Стадия (d): проведение хроматографии гидрофобного взаимодействия в отношении полученного на стадии (c) раствора

В контексте настоящего изобретения термин “хроматография гидрофобного взаимодействия” означает способ хроматографии с помощью материала для хроматографии гидрофобного взаимодействия. Материал для хроматографии гидрофобного взаимодействия представляет собой материал для хроматографии, к которому присоединяют гидрофобную группу, например, группу бутил-, октил- или фенил-, в качестве функциональной группы для хроматографии. Полипептид могут выделить путем взаимодействия гидрофобной группы материала для хроматографии гидрофобного взаимодействия с гидрофобной областью, расположенной на ее поверхности. На взаимодействие между полипептидом и материалом для хроматографии могут влиять температура, растворитель и ионная сила растворителя. Поскольку подвижность боковых цепей аминокислот увеличивается, а гидрофобные боковые цепи аминокислот, скрытые в полипептиде, доступны при более низких температурах, то повышенная температура дополнительно увеличивает взаимодействие между, например, полипептидом и материалом для хроматографии гидрофобного взаимодействия. Кроме того, космотропная соль также способствует гидрофобному взаимодействию, а хаотропная соль уменьшает его.

В качестве смолы - материала для хроматографии гидрофобного взаимодействия - может быть использована бутил-сефароза, фенил-сефароза, октил-сефароза, например фенил-сефароза CL-4B, 6FF, HP, фенил-супероза, октил-сефароза CL-4B, 4FF и бутил-сефароза 4FF, предпочтительно бутил-сефароза, более предпочтительно бутил-сефароза 4FF.

Стадия (e): проведение анионообменной хроматографии в отношении полученного на стадии (d) раствора

В контексте настоящего изобретения термин “анионообменная хроматография” означает способ хроматографии с помощью материала для анионообменной хроматографии. Материал для анионообменной хроматографии означает твердофазный полимерный материал, имеющий анион-заряженную группу в качестве функциональной группы для хроматографии и анионообменный материал. Обычно противоионы связываются с материалом для анионообменной хроматографии, а материал для анионообменной хроматографии может обменивать анионы, имеющие одинаковый заряд в окружающем растворе, на противоионы.

Анионообменная хроматография может представлять собой, например, хроматографию с помощью коммерческого материала для анионообменной хроматографии, и для нее могут применять материалы для анионообменной хроматографии, предоставленные производителями, такими как Biorad Laboratories, Cyphergen, GE Healthcare и т. п.

Анионообменную хроматографию могут проводить с помощью четвертичного аммония в качестве анионообменной смолы, предпочтительно смолы Q в качестве смолы, более предпочтительно Capto Q ImpRes.

Предпочтительно анионообменную хроматографию проводят первой при ионообменной хроматографии. Эта стадия необходима для эффективного удаления основного варианта, вируса, белка клетки-хозяина (HCP), ДНК клетки-хозяина (HCD) и эндотоксина, которые соответствуют примесям в способе очистки интерферона-бета.

Стадия (f): проведение катионообменной хроматографии в отношении полученного на стадии (е) раствора

В контексте настоящего изобретения термин “катионообменная хроматография” означает способ хроматографии с помощью материала для катионообменной хроматографии. Материал для катионообменной хроматографии означает твердофазный полимерный материал, имеющий катион-заряженную группу в качестве функциональной группы для хроматографии и катионообменный материал. Обычно противоионы связываются с материалом для катионообменной хроматографии, а материал для катионообменной хроматографии может обменивать катионы, имеющие одинаковый заряд в окружающем растворе, на противоионы.

В зависимости от свойств заряженной группы материал для катионообменной хроматографии может иметь, например, группу сульфоновой кислоты (SP) или карбоксиметильную группу (CM). Дополнительно в зависимости от свойств заряженной группы материал для катионообменной хроматографии могут дополнительно классифицировать как сильный или слабый материал для катионообменной хроматографии в зависимости от интенсивности заряженного заместителя. Например, сильный материал для катионообменной хроматографии имеет группу сульфоновой кислоты в качестве функциональной группы для хроматографии, а слабый материал для катионообменной хроматографии имеет группу карбоновой кислоты в качестве функциональной группы для хроматографии.

Катионообменная хроматография может представлять собой хроматографию с помощью, например, коммерческого материала для катионообменной хроматографии, и для нее могут применять материал для катионообменной хроматографии, предоставленный производителями Biorad Laboratories, Cyphergen, GE Healthcare и т. п. Катионообменную хроматографию могут проводить предпочтительно с помощью сефарозы SP, более предпочтительно сефадекса S.F.F. в качестве смолы.

Интерферон-бета, выделенный путем очистки по настоящему изобретению, обладает активностью интерферона-бета человека, имеет биологические и/или иммунологические характеристики интерферона-бета для применения в обычных способах лечения с точки зрения надлежащей производственной практики (GMP), и предпочтительно удовлетворяет регуляторным требованиям для утверждения (валидация, воспроизводимость) и конкретными биохимическими характеристиками интерферона-бета (такими как гидрофобность и т. д.).

Удельная активность выделенного дигликозилированного интерферона-бета может составлять по меньшей мере 2×10⁸ МЕ/мг, предпочтительно по меньшей мере 3×10⁸ МЕ/мг, более предпочтительно по меньшей мере 4×10⁸ МЕ/мг. Двумя существенными биологическими активностями ИФН-бета, которые могут быть измерены, являются противовирусный эффект и антипролиферативный эффект. Эти биологические активности могут измерять стандартным способом через ингибирование эффекта модификации клетки вируса, соответственно. Для измерения активности интерферона-бета могут применять известные в данной области техники способы.

Способ очистки дигликозилированного интерферона-бета по настоящему изобретению предпочтительно не включает обращенно-фазовую хроматографию, ультрафильтрацию или диализ и эксклюзионную хроматографию. Поскольку ацетонитрил в качестве обычно применяемого буфера представляет собой органический растворитель, недостаток обращенно-фазовой хроматографии состоит в том, что для масштабного культивирования и очистки требуется такое дополнительное оборудование, как взрывозащищенное оборудование, а недостатком ультрафильтрации или диализа является то, что они не подходят для масштабного культивирования и очистки, и может образовываться большое количество жидких отходов. Дополнительно недостатком эксклюзионной хроматографии является то, что она не подходит для масштабного культивирования и очистки.

Преимущество исключения обращенно-фазовой хроматографии, ультрафильтрации или диализа и эксклюзионной хроматографии заключается в возможности принципиального исключения некоторых ограничений, влияющих на безопасность и окружающую среду, например требующих значительной рабочей силы, обязательного применения дорогостоящего оборудования, требующего значительных вложений, или обращения с легковоспламеняющимся растворителем, защиты от взрыва и обработки жидких отходов.

Дополнительно настоящее изобретение относится к дигликозилированному интерферону-бета, полученному способом очистки по настоящему изобретению. Предпочтительно белок интерферон-бета по настоящему изобретению имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 и имеет сахарные цепи в аминокислотных положениях 25 и 80.

Сахарные цепи белка интерферон-бета могут представлять собой сахарные цепи со структурами A2G2, FA2G2, FA2G2S1, FA2G2S2, FA2G2S*2, FA3G3S1, FA3G3S3, FA3G3S*3, FA4G4S1, FA4G4S3, FA4G4S4, FA4G4S*3, FA4G4S*4, FA4G4Lac1S3, FA4G4Lac1S*3, FA4G4Lac1S4, FA4G4Lac2S3 и FA4G4Lac1S*3, обозначенными в соответствии со способом оксфордской записи; предпочтительно белок включает две любые структуры сахарной цепи из указанных.

(F представляет собой фукозилированное ядро;

А2 представляет собой биантеннарную структуру с двумя GlcNAc, связанными бета-1-2-связью;

А3 представляет собой триантеннарную структуру с GlcNAc, связанным бета-1-2 связями с обеими маннозами, а третий GlcNAc связан бета-1-4-связью с альфа-1-3 связанной маннозой;

А3' представляет собой триантеннарную структуру с GlcNAc, связанным бета-1-2-связями с обеими маннозами, а третий GlcNAc связан бета-1-6-связью с альфа-1-6 связанной маннозой;

А4 представляет собой GlcNAc, связанный как А3, с дополнительными GlcNAc, связанным бета-1-6-связью с 1-6 маннозой;

Gх представляет собой количество звеньев (х) галактозы, связанной бета-1-4-связью с антенной;

Sх представляет собой количество звеньев (х) сиаловых кислот, связанных с галактозой; сиаловые кислоты связаны альфа-2-3-связями, если не указано с помощью *, где также присутствуют связи альфа-2-6;

Lacx представляет собой количество (х) лактозаминовых удлинений (Gal-GlcNAc).

Дополнительные возможные структуры лактозамина выделены курсивом)

В типичном варианте осуществления настоящего изобретения клетки культивировали в масштабе 5 л, интерферон-бета экспрессировали и потом очищали с помощью способа очистки дигликозилированного интерферона-бета по настоящему изобретению. Очистку дигликозилированного интерферона-бета осуществляли последовательным проведением аффинной хроматографии с помощью смолы Голубая Сефароза 6 быстропоточная, инактивации низким рН путем добавления кислоты и хроматографии гидрофобного взаимодействия с помощью смолы бутил-сефарозы (Бутил 4 быстропоточный), анионообменной хроматографии с помощью смолы Capto Q ImpRes и катионообменной хроматографии с помощью колонки с сефарозой SP быстропоточной.

В качестве сравнительного примера интерферон-бета, полученный с помощью экспрессии в той же культуре, очищали в соответствии с обычным способом очистки белка интерферон-бета путем последовательного проведения аффинной хроматографии с помощью колонки с Голубой сефарозой 6 быстропоточной, обращенно-фазовой хроматографии (VYDAC C4) с помощью катионообменной хроматографии со смолой сефарозой CM быстропоточной, ультрафильтрации и концентрирования, а также эксклюзионной хроматографии (Sephacryl 100HR).

В типичном варианте осуществления настоящего изобретения интерферон-бета, выделенный и очищенный по каждому способу очистки, оценивали с точки зрения выхода, модификации белка, удельной активности, содержания и общей активности. В результате, способ по настоящему изобретению был превосходен по общему содержанию, выходу и по содержанию формы с удаленным МЕТ по сравнению со способом из сравнительного примера, причем способ из Сравнительного примера отличается высокой инертностью по сравнению со способом по настоящему изобретению, а способ по настоящему изобретению значительно его превосходит даже по общей активности с учетом общей степени очистки. Таким образом, понятно, что дигликозилированный интерферон-бета могут выделять/очищать с помощью способа по настоящему изобретению для получения превосходного качества и выхода и более высокой активности.

В типичном варианте осуществления настоящего изобретения примеси интерферона-бета, выделенного и очищенного по каждому способу очистки, исследовали на предмет содержания белка клеточного происхождения (CHO-НСР), содержания эндотоксина и с помощью картины ИЭФ (изоэлектрическое фокусирование) в отношении клеток CHO. В результате, могли подтвердить, что белок клеток CHO и эндотоксин соответствовали общему эталонному значению, но содержание примесей в случае способа по настоящему изобретению было меньшим. В дополнении видно, что поскольку отсутствовал основной вариант, способ по настоящему изобретению представлял собой способ очистки с гораздо более высокой чистотой, чем способ из сравнительного примера 1.

В результате серии процессов, описанных выше, ниже в таблице 1 приведены выход очистки и чистота для каждой стадии.

Таблица 1 Исходный материал Объединенный элюат Выход Конц.
(мг/мл) Объем
(мл) Количество
(мг) Конц.
(мг/мл) Объем
(мл) Количество
(мг) Голубая Н/Д
(не доступно) 4500 Н/Д 0,574 66 37,9 Н/Д Низкий рН и Нейтрализация 0,574 64 36,7 0,544 68 37,0 100,7% Загрузка образца ХГВ (хроматография гидрофобного взаимодействия) 0,544 64 34,8 0,131 261 34,1 97,8% ХГВ 0,131 255 33,3 0,095 123 11,7 35,1% АОХ (анионообменная хроматография) 0,095 115 10,9 0,407 25 10,2 93,2% КОХ (катионообменная хроматография) 0,078 150 11,7 0,290 30 8,7 74% Общий выход Н/Д Н/Д Н/Д Н/Д Н/Д Н/Д 20,1%

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ

Способ очистки белка интерферон-бета, предлагаемый по настоящему изобретению, значительно превосходит по выходу очистки дигликозилированного белка интерферон-бета, прост в управлении производством и управлении качеством при масштабном культивировании, и может очищать дигликозилированный белок интерферон-бета с превосходным качеством, соответствующим регуляторным требованиям для применения в качестве лекарственных средств.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 схематически показан способ очистки по настоящему изобретению.

На Фиг. 2 показан результат проведения ИЭФ экспериментов для материалов, очищенных в соответствии со способом очистки по настоящему изобретению (правая полоса) и сравнительным способом очистки (левая полоса). Стрелка указывает на основной вариант.

ВАРИАНТЫ ИЗОБРЕТЕНИЙ

Далее настоящее изобретение будет описано подробно.

Однако следующие примеры представляют собой просто иллюстративные примеры по настоящему изобретению, и объем настоящего изобретения не ограничен следующими примерами.

Пример 1: Экспрессия и получение дигликозилированного интерферона-бета в клетках-хозяевах

В культуральном растворе экспрессируют интерферон-бета путем культивирования продуцирующей клеточной линии СНО, включающей соответствующий ген дигликозилированного интерферона-бета, в масштабе 5 л с помощью среды на основе optiCHO SFM от Hyclone.

Культуральный раствор поддерживали при медленном перемешивании при исходной температуре 34,0 °С, рН 7,0 и 50% растворенного кислорода в течение 9 дней, а потом извлеченный из инкубатора культуральный раствор центрифугировали при 4500 об./мин и 4 °С в течение 30 мин. После центрифугирования супернатант асептически фильтровали при размере пор 0,22 мкм и проводили очистку.

Пример 2: Очистка дигликозилированного интерферона-бета

Полученный в примере 1 интерферон-бета подвергали способу очистки с помощью аффинной хроматографии.

Сначала собранные фракции интерферона-бета связывали в колонке с Голубой Сефарозой 6 быстропоточной (GE), предварительно уравновешенной раствором 10 мМ фосфата натрия, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl и при рН 7,4, и в достаточной мере промывали раствором 700 мМ тиоцианата натрия. После этого фракции интерферона-бета элюировали раствором 20 мМ фосфата натрия, 1,4 М NaCl, 35% пропиленгликоля, 250 мМ L-Аргинина и при рН 7,4 для сбора.

По результатам анализа ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) чистота составила в пределах от 94% до 96%, а в результате определения остаточного HCP первую очистку завершали с содержанием от 6300 до 9500 млн^-1.

На второй стадии добавляли фосфорную кислоту с рН 3,5 (99% и 10-кратно разбавленную дистиллированной водой), чтобы довести рН до 3,0. После этого образец обрабатывали при 22 °С в течение 1 ч, а потом нейтрализовали 2 М основанием Trizma.

На третьей стадии фракции связывали в колонке с бутил-сефарозой (Бутил 4 быстропоточная; GE), предварительно уравновешенной раствором 20 мМ Трис (трис(гидроксиметил)аминометан), 1,4 М NaCl, 300 мМ Arg и при рН 7,4, а потом элюировали раствором 20 мМ Трис и при рН 8,0 для сбора.

На четвертой стадии с помощью полученных элюированных фракций проводили анионообменную хроматографию со смолой Capto Q ImpRes (GE) с помощью раствора 20 мМ Трис и при рН 8,0. В качестве растворителя для элюирования применяли раствор 20 мМ Трис, 140 мМ NaCl с рН 8,0.

На конечной стадии элюированные перед этим в анионообменной смоле фракции добавляли в колонку с сефарозой SP быстропоточной (GE), уравновешенной 50 мМ ацетатом натрия с рН 5,0, для проведения катионообменной хроматографии при разнице концентрации соли от 150 мМ до 500 мМ.

Наконец, в результате, материал интерферона-бета, полученный с выходом 32%, демонстрировал чистоту 95% или выше, значение HCP 100 млн^-1, что являлось эталонным значением или меньше, и в результате анализа ИЭФ и SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) показано, что был получен конечный продукт, не содержащий какого-либо специфического вещества.

Сравнительный пример 1: Очистка в соответствии с обычным способом очистки белка интерферон-бета

Полученные после культивирования фракции интерферона-бета связывали в колонке с Голубой Сефарозой 6 быстропоточной (GE), предварительно уравновешенной раствором 10 мМ фосфата натрия, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl и при рН 7,4, и в достаточной мере промывали раствором 700 мМ тиоцианата натрия. После этого фракции интерферона-бета элюировали раствором 20 мМ фосфата натрия, 1,4 М NaCl, 35% пропиленгликоля и при рН 7,0 для сбора.

Фракции, полученные описанным выше способом, разбавляли 5-кратно раствором 20 мМ фосфата натрия и при рН 2,7 и в качестве второй обработки подвергали катионообменной хроматографии с помощью смолы сефарозы СМ быстропоточной (GE). Применяемый в этот раз растворитель для элюирования представлял собой 50 мМ NaPi, 0,145 M NaCl, 10% ПГ (пропиленгликоль) и при рН 7,0.

После этого элюированный образец интерферона-бета элюировали с помощью 30% ацетонитрила в качестве органического растворителя и 0,1% трифторуксусной кислоты в качестве буферного раствора через колонку ВЭЖХ для обращенно-фазовой хроматографии (VYDAC C4; Agilent). В этот раз 20 мМ одноосновный фосфат натрия с рН 2,9 предварительно помещали в контейнер для сбора элюированного образца таким образом, что образец одновременно элюировали и разбавляли, и получали интерферон-бета.

В предыдущем способе 7-кратно разбавленный элюирующий образец интерферона-бета концентрировали примерно в 7 раз через систему TFF от Millipore (тангенциальная поточная фильтрация; Pellicon Biomax 10; Millipore) для ультрафильтрации и концентрирования, чтобы очистить его наиболее эффективным способом при уменьшении емкости. В этот раз в качестве обменного раствора применяли 20 мМ фосфат натрия с рН 2,9, а концентрация концентрата обычно зависела от свойств смолы для эксклюзионной хроматографии.

В качестве последней стадии удаляли ненужные вещества с помощью эксклюзионной хроматографии (Sephacryl 100HR; GE), и в этот раз элюированный образец собирали по 25 мл, и, наконец, получали фракции, включающие интерферон-бета.

Пример 3: Оценка способа очистки

3-1. Оценка активности, выхода и т. д.

Способы очистки по примеру 2 и сравнительному примеру 1 оценивали с точки зрения выхода, модификации белка, удельной активности, содержания и общей активности.

Для количественного определения белка применяли УФ способ измерения. Нулевую точку устанавливали добавлением раствора 0,5 М NaOH и элюирующего растворителя для эксклюзионной хроматографии в соотношении 1:1, а полученный в результате эксклюзионной хроматографии продукт и 0,5 М NaOH смешивали в соотношении 1:1 и измеряли при УФ длине волны 290 нм. Проводили измерения трижды и вычисляли согласно следующему уравнению.

- (Среднее из 3 измеренных значений ÷ коэффициент экстинкции) × разбавление (мг/мл)

Выход основан на элюате (100%), проходящем через голубую сефарозу, а его относительное содержание измерено посредством иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью первичного антитела, специфичного к интерферону-бета, а применяемый в этот раз ИФА представлял собой следующее. После того, как раствор конъюгированного с ферментом антитела распределили в планшете для измерений в соответствии с концентрацией, стандартный раствор и тестируемый раствор, подлежащие измерению, добавляли в двух повторностях по меньшей мере в 8 разбавлениях. После реакции в течение определенного времени проводили промывку, а после для индуцирования реакции добавляли раствор субстрата, вызывающий реакцию окрашивания. После окончания реакции измеряли поглощение при 450 нм.

Модификацию белка измеряли путем проведения пептидного картирования с помощью оборудования для ВЭЖХ. Аналитический образец вводили с помощью хроматографической системы и дозатора, а структуру белка и денатурацию аминокислоты, соответствующие значению удерживания и интегральному значению, подтверждали с учетом значений, измеренных при длине волны 214 нм.

С помощью анализа на цитопатический эффект (ЦПЭ) удельную активность измеряли следующим образом. Стандартный материал для измерения удельной активности получали следующим образом: интерферон-бета, приобретенный Национальным Институтом Биологических Стандартов и Контроля (NBSC), смешивали в среде для культивирования МЕМ для получения стандартного исходного раствора соответствующей активности (2000 МЕ/мл), а потом получали путем последовательного разбавления стандартного раствора серию активностей (МЕ/мл) от 200 до 0,390625 МЕ/мл.

Каждый очищенный образец разбавляли с помощью среды для культивирования МЕМ так, что ожидаемая активность становилась 50 МЕ/мл (объем составлял 1500 мкл или больше), и последовательно разбавляли от 50 до 0,390625 МЕ/мл для получения образца для измерения.

Образец для измерения и стандартный материал распределяли в 96-луночном планшете для культуры, соответственно, и добавляли клетки А549 в лунки в количестве 3×10⁴ клеток/лунку и потом инкубировали при 37 °С в условиях 5% СО₂ в течение 22 ч. Среду убирали из планшета, а раствор вируса (1000 TCID50/мл) распределяли в каждую лунку и инкубировали при 37 °С в условиях 5% СО₂ в течение 22 ч. Раствор удаляли из планшета, а потом окрашивали раствором Кристаллического фиолетового при комнатной температуре и обесцвечивали 2-метоксиэтанолом, после чего измеряли поглощение при 570 нм для расчета удельной активности.

Результаты соответствующих параметров анализа представлены в следующей таблице.

Таблица 2 Параметры анализа Сравнительный пример 1 Пример 2 Общее содержание конечного продукта (УФ) 16,5 мг 26,4 мг Выход (ИФА, Первый) 10,9% 19% Выход (ИФА, Второй) 11,5% 20,1% Форма с удаленным N'-Met (Пептидное картирование) 3,6% 2,8% Удельная активность (CPE/УФ) 327 ММЕ/мг 247 ММЕ/мг Общая активность 5395 ММЕ 6520 ММЕ

В результате измерения в способе по сравнительному примеру 1 общее содержание составляло 16,5 мг, выход составлял около 11% и форма с удаленным N'-Met составляла 3,6%. Удельная активность составляла 327 ММЕ/мг и была выше, чем в способе по настоящему изобретению, а содержание очищенного продукта составляло только около 16,5 мг, а общая активность составляла только 5395 ММЕ.

Напротив, в способе по настоящему изобретению общее содержание составляло 26,4 мг, выход составлял около 20%, форма с удаленным Met составляла 2,8%, а общая активность была высокой и составляла 6520 ММЕ.

Таким образом, можно видеть, что для того, чтобы обеспечить превосходное качество и выход и более высокую активность, дигликозилированный интерферон-бета можно выделять/очищать способом по настоящему изобретению.

3-2. Оценка примесей

При очистке по сравнительному примеру 1 и примеру 2 примеси исследовали на предмет содержания белка, полученного из клеток CHO (CHO-HCP), содержания эндотоксина и с помощью картины ИЭФ.

Содержание белка, полученного из клеток СНО, подлежащего отделению от целевого белка интерферона-бета, измеряли с помощью ИФА. Раствор для разбавления получали и распределяли на планшете, а аналитический образец разбавляли до конечной половины. В дополнении к разбавленному образцу стандартный раствор переносили и распределяли на планшете, включенном в аналитический набор (где конъюгированное с ферментом антитело наносили на прилагаемый к набору планшет), и для индуцирования реакции добавляли раствор субстрата, обеспечивающий реакцию окрашивания. После этого в планшете по стандартной калибровочной кривой анализировали количество белка, полученного из клеток СНО, путем измерения поглощения при длине волны 450 нм.

Анализ лизата амебоцитов Limulus (ЛАЛ) применяли для измерения остаточного уровня эндотоксина. Стандартный образец эндотоксина хорошо перемешивали с предназначенной для анализа ЛАЛ дистиллированной водой, а потом получали в концентрации для построения стандартной калибровочной кривой в тестируемой пробирке для анализа. Стандартный образец, раствор с нулевой точкой и образец для анализа для каждой полученной концентрации распределяли на планшете в одинаковом количестве. Реагент ЛАЛ хорошо растворяли в предназначенной для анализа дистиллированной воде, а потом равномерно распределяли на подготовленном планшете для индуцирования реакции. На планшете после окончания реакции измеряли уровень присутствующего в целевом материале эндотоксина путем измерения поглощения при длине волны 405 нм.

Положительный и отрицательный буферы для применения в гель-анализе ИЭФ получали и смешивали с буфером для анализа ИЭФ (рН от 3 до 10) путем расчета количества анализируемого образца и стандартного образца, которые должны быть одинаковы, чтобы сделать опытный образец для анализа. Гель ИЭФ с рН от 3 до 10 присоединяли к опытному контейнеру, а потом наполняли опытный контейнер буфером для положительного электрода, а буфером для отрицательного электрода наполняли внешнее пространство, и полученные образцы вводили в гель. Для образцов в полученном опытном контейнере создавали напряжение порядка 200 В в течение 1 ч и 500 В в течение 30 мин, а потом готовый гель отделяли и подвергали окрашиванию Кумасси и обесцвечиванию, а изоэлектрические точки белка определяли с помощью хемолюминесцентного анализатора.

Таблица 3 Параметры анализа Сравнительный пример 1 Пример 2 CHO-HCP 65 млн^-1 42 млн^-1 Эндотоксин 0,00 ЕЭ (единица эндотоксина)/мкг 0,00 ЕЭ/мкг Результат ИЭФ (Фиг. 1) Подтвержденный основной вариант Неподтвержденный основной вариант

В результате содержание белка в клетках CHO в сравнительном примере 1 составляло 65 млн^-1, а 42 млн^-1 - в соответствии со способом по настоящему изобретению. Хотя содержания белка в сравнительном примере 1 и настоящем изобретении было представлено на уровне до 100 млн^-1 или меньше в качестве общего эталонного значения, в настоящем изобретении путем проведения катионообменной хроматографии, следующей за анионообменной хроматографией, подтвердили, что содержание белка было немного ниже.

В обоих случаях эндотоксин не содержался, и в результате анализа ИЭФ (Фиг. 1) в сравнительном примере 1 было обнаружено следовое количество основного варианта около примерно рН 7,7 (стрелка), тогда как в способе по настоящему изобретению основной вариант не обнаружился, и способ представлял собой способ очистки с более высокой чистотой.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Как описано выше, способ очистки белка интерферон-бета, предложенный в настоящем изобретении, значительно превосходит по выходу очистки дигликозилированного белка интерферон-бета, прост в управлении производством и управлении качеством при масштабном культивировании, и им можно очищать дигликозилированный интерферон-бета с превосходным качеством, соответствующим регуляторным требованиям для применения в качестве лекарственных средств, и поэтому имеет широкое промышленное применение.

Изобретение относится к способу очистки дигликозилированного белка интерферон-бета и, более конкретно, к способу очистки дигликозилированного белка интерферон-бета, согласно которому (а) получают культуральный раствор, содержащий интерферон-бета, экспрессированный в клетке-хозяине; (b) проводят аффинную хроматографию в отношении культурального раствора, полученного на стадии (а); (c) инактивацию низким рН полученного на стадии (b) раствора, где указанный низкий рН представляет собой рН 4,0 или меньше; (d) проводят хроматографию гидрофобного взаимодействия в отношении полученного на стадии (c) раствора; (e) проводят анионообменную хроматографию в отношении полученного на стадии (d) раствора; и (f) проводят катионообменную хроматографию в отношении полученного на стадии (е) раствора. Способ обеспечивает достаточное количество белка и высокую чистоту и снижает возникновение модификации гликозилирования или других модификаций интерферон-бета. 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 2 пр.

1. Способ очистки дигликозилированного белка интерферон-бета, включающий следующие стадии:

(а) получение культурального раствора, содержащего интерферон-бета, экспрессированный в клетке-хозяине;

(b) проведение аффинной хроматографии в отношении культурального раствора, полученного на стадии (а);

(c) инактивация низким рН полученного на стадии (b) раствора, где указанный низкий рН представляет собой рН 4,0 или меньше;

(d) проведение хроматографии гидрофобного взаимодействия в отношении полученного на стадии (c) раствора;

(e) проведение анионообменной хроматографии в отношении полученного на стадии (d) раствора; и

(f) проведение катионообменной хроматографии в отношении полученного на стадии (е) раствора.

2. Способ по п. 1, где белок интерферон-бета состоит из пептидной последовательности SEQ ID NO: 1.

3. Способ по п. 1, где клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка (CHO).

4. Способ по п. 1, где аффинную хроматографию проводят с помощью голубой сефарозы в качестве смолы.

5. Способ по п. 1, где хроматографию гидрофобного взаимодействия проводят с помощью бутил-сефарозы в качестве смолы.

6. Способ по п. 1, где анионообменную хроматографию проводят с помощью смолы Q в качестве смолы.

7. Способ по п. 1, где катионообменную хроматографию проводят с помощью сефарозы SP в качестве смолы.

8. Способ по п. 2, где белок интерферон-бета имеет сахарные цепи в аминокислотных положениях 25 и 80.

9. Способ по п. 1, где белок интерферон-бета включает две любые структуры сахарной цепи из A2G2, FA2G2, FA2G2S1, FA2G2S2, FA2G2S*2, FA3G3S1, FA3G3S3, FA3G3S*3, FA4G4S1, FA4G4S3, FA4G4S4, FA4G4S*3, FA4G4S*4, FA4G4Lac1S3, FA4G4Lac1S*3, FA4G4Lac1S4, FA4G4Lac2S3 и FA4G4Lac1S*3.