СНИЖЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКОВЫХ ПРИМЕСЕЙ В КОМПОЗИЦИЯХ, СОДЕРЖАЩИХ ИНТЕРЕСУЮЩИЙ ВИТАМИН К-ЗАВИСИМЫЙ БЕЛОК Российский патент 2012 года по МПК C07K1/16 C07K14/745 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям витамин К-зависимых белков, имеющим очень низкое или пренебрежимо малое содержание белков-контаминантов. Настоящее изобретение также относится к способу, пригодному в приготовлении таких композиций витамин К-зависимых белков. Такие способы можно применять как по одному, так и в последовательной комбинации с целью уменьшения относительного содержания белков-контаминантов. Настоящее изобретение имеет значение особенно в приготовлении композиций факторов свертывания крови, выбранных из полипептидов фактора Х (FX/FXa), полипептидов фактора IX (FIX/FIXa), полипептидов фактора VII (FVII/FVIIa) и антикоагулирующего белка С, в частности полипептидов фактора VII.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

При получении рекомбинантных белков из культур микроорганизмов или клеточных линий конечная стадия получения представляет собой выделение и возможно концентрацию представляющего интерес продукта. Культуральная среда, в которой выращены клетки и которая содержит секретируемые белки, и, в частности, клеточные лизаты, содержащие внутриклеточные белки, представляющие интерес, также содержат в большей или меньшей степени другие белки, продуцируемые клетками, не считая других контаминантов, таких как компоненты среды, нуклеиновые кислоты и тому подобное. Поэтому, для того чтобы получить очищенный белковый продукт, необходимо отделить белок, представляющий интерес, от других белков и полипептидов и других примесей в неочищенном веществе, содержащем белок, представляющий интерес.

Часто трудно удалить белок-контаминант, содержащий домены такой же природы, как и полипептид, представляющий интерес.

Витамин К-зависимые белки отличаются от других белков тем, что имеют общую структурную особенность в амино-концевой части молекулы. N-конец этих белков, также называемый Gla-доменом, имеет высокое содержание необычной аминокислоты, γ-карбоксиглутаминовой кислоты, которая синтезируется из глутамата путем витамин К-зависимой реакции, катализируемой ферментом γ-глутамилкарбоксилазой. Из-за присутствия приблизительно 2-12 Gla-остатков Gla-домен характеризуется способностью связывать двухвалентные катионы, такие как Са²⁺. При связывании ионов металла эти белки подвергаются конформационным изменениям, которые могут быть измерены с помощью нескольких методик, таких как методики, основанные на явлениях циркулярного дихроизма и флуоресценции.

Открытие индуцированных металлом конформационных изменений Gla-содержащих белков (Nelsestuen et al., J. Biol. Chem. 1976; 251, 6886-6893) вместе с идентификацией конформационно-специфических поликлональных антител (Furie et al., J. Biol. Chem. 1978; 253, 8980-8987) открыло путь для использования конформационно-специфической иммуноаффинной хроматографии. Данные антитела могли узнавать и связывать Gla-домен в присутствии ионов Са²⁺ и высвобождать белок при удалении ионов Са²⁺ с использованием Са²⁺-хелатирующего агента, такого как ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) или цитрат.

В 1980-х годах была разработана конформационно-специфическая псевдоаффинная хроматография, использующая уникальное свойство Gla-содержащих белков подвергаться конформационным изменениям, индуцированным металлом. Псевдоаффинная хроматография отличается от традиционной аффинной хроматографии тем, что в ней не используется иммобилизованный аффинный лиганд и ее выполняют на традиционной хроматографической матрице (Yan S.В., J. Mol. Recog. 1996; 9, 211-218). Gla-белок может быть адсорбирован на анионообменном веществе путем удаления ионов двухвалентного металла. Последующую элюцию выполняют путем добавления к буферу для элюции Са²⁺.

В 1986 году Bjørn и Thim описали очистку рекомбинантного фактора VII на анионообменном веществе, основанную на использовании свойства Gla-домена фактора VII связывать Са²⁺ (Bjørn S. and Thim L., Research Dislosure, 1986, 26960-26962). Адсорбцию выполняли в буфере без Са²⁺, а элюцию фактора VII осуществляли с использованием Са²⁺-содержащего буфера с низкой ионной силой и в мягких условиях.

Yan с соавт. использовали те же самые принципы для очистки рекомбинантного человеческого белка С (Yan S.В. et al., Bio/technology. 1990; 8, 655-661).

Хотя присутствие Gla-домена дает преимущество при отделении Gla-содержащих белков от других белков, авторы настоящего изобретения заметили, что сходные свойства и поведение Gla-содержащих белков затрудняет их отделение друг от друга. Некоторые конформационно-специфические антитела против одних Gla-белков показывают перекрестную реактивность в отношении других Gla-белков (Furie В. and Furie В., J. Biol. Chem. 1979; 254, 9766-9771; Church et al., J. Biol. Chem. 1988; 263, 6259-6267).

Brown с соавт. (Brown et al., J. Biol. Chem. 2000; 275, 19795-19802) описали моноклональные антитела, специфичные к Gla-остаткам. Данные антитела могли узнавать все протестированные Gla-белки: фактор VII, фактор IX, фактор II, белок С, белок S, GAS-6, Gla-белок костного матрикса, конантокин G.

Белки с GLA-доменом включают следующие белки: GAS-6, белок S, фактор II (протромбин), тромбин, фактор Х/Ха, фактор IX/IXa, белок С, фактор VII/VIIa, белок Z, трансмембранный Gla-белок 1 (transmembrane gamma-carboxyglutamic acid protein 1), трансмембранный Gla-белок 2 (transmembrane gamma-carboxyglutamic acid protein 2), трансмембранный Gla-белок 3 (transmembrane gamma-carboxyglutamic acid protein 3), трансмембранный Gla-белок 4 (transmembrane gamma-carboxyglutamic acid protein 4), матриксный Gla-белок и остеокальцин, но не ограничены ими.

В US 5633350 описан способ отделения витамин К-зависимых белков от сопутствующих белков, не являющихся витамин К-зависимыми.

Необходимость в эффективном отделении представляющего интерес витамин К-зависимого белка, такого как представляющий интерес содержащий Gla-домен полипептид, от белков-контаминантов является особенно важной проблемой, когда имеют дело с очисткой таких полипептидов, продуцированных в клеточных культурах, так как клетка-хозяин (которая может не относиться к линии клеток человека) может продуцировать значительные количества белков-контаминантов, которые могут вызывать нежелательные иммуногенные реакции при использовании данного полипептида.

Соответственно, задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить подходящие методики уменьшения содержания белков-контаминантов в композициях, содержащих представляющий интерес витамин К-зависимый белок, или даже их удаления. Другая задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить композиции, содержащие представляющий интерес витамин К-зависимый белок, с очень низким или даже пренебрежимо малым содержанием белков-контаминантов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к различным способам уменьшения содержания белка(ов)-контаминанта(ов) в композициях, содержащих представляющий интерес витамин К-зависимый белок, или даже их удаления.

Представляющие интерес витамин К-зависимые белки

Настоящее изобретение в широком аспекте относится к очистке представляющего интерес витамин К-зависимого белка и к конкретным очищенным композициям, содержащим такие белки. Термин "представляющий интерес" использован в данном описании в качестве указателя для конкретного вида (витамин К-зависимого белка), который является существенным для получения его в наиболее чистой форме, например, с целью применения данного витамин К-зависимого белка в терапевтическом контексте.

Приведенные в данном описании способы в принципе можно применять для очистки любого из витамин К-зависимых белков, включающих GAS-6, белок S, фактор II (протромбин), тромбин, фактор Х/Ха, фактор IX/IXa, белок С, фактор VII/VIIa, белок Z, трансмембранный Gla-белок 1, трансмембранный Gla-белок 2, трансмембранный Gla-белок 3, трансмембранный Gla-белок 4, матриксный Gla-белок и остеокальцин, но не ограниченных ими, в частности для очистки витамин К-зависимых факторов свертывания крови, выбранных из полипептидов фактора VII, полипептидов фактора IX, полипептидов фактора Х и активированного белка С. В одном конкретном воплощении данный способ применен для очистки представляющих интерес рекомбинантных витамин К-зависимых белков, продуцированных в условиях клеточной культуры, в частности в условиях культур клеток, не принадлежащих человеку.

В одном конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX, такой как FIX или FIXa.

В другом конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII, такой как полипептид, родственный фактору VII, или производное фактора VII, или конъюгат фактора VII, в частности полипептид человеческого фактора VII, в частности человеческий фактор VII дикого типа или человеческий фактор VIIa дикого типа.

В контексте данного описания термины "полипептид фактора VII" и "FVII-полипептид" означают любой белок, содержащий аминокислотную последовательность 1-406 человеческого фактора VIIa дикого типа (например, полипептид, имеющий данную аминокислотную последовательность, раскрыт в патенте США №4784950), его варианты, а также полипептиды, родственные фактору VII, производные фактора VII и конъюгаты фактора VII. Они включают варианты фактора VII, полипептиды, родственные фактору VII, производные фактора VII и конъюгаты фактора VII, проявляющие по существу такую же биологическую активность, как человеческий фактор VIIa дикого типа, или улучшенную по сравнению с ним биологическую активность.

Термины "фактор VII" или "FVII" предназначены охватить полипептиды фактора VII в их нерасщепленной (зимогенной) форме, а также полипептиды фактора VII, которые подверглись протеолитическому процессингу с получением их соответствующих биоактивных форм, которые могут быть названы фактором VIIa. Обычно фактор VII расщепляется между остатками 152 и 153 с получением фактора VIIa. Такой вариант фактора VII может проявлять другие свойства по сравнению с человеческим фактором VII, включая стабильность, связывание с фосфолипидами, измененную специфическую активность и тому подобное.

В контексте данного описания "человеческий фактор VIIa дикого типа" представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, раскрытую в патенте США №4784950.

В контексте данного описания термин "полипептиды, родственные фактору VII" охватывает полипептиды, включая варианты (или аналоги), биологическая активность которых по отношению к фактору VIIa по существу модифицирована, например уменьшена относительно активности фактора VIIa дикого типа. Эти полипептиды включают фактор VII или фактор VIIa, в аминокислотную последовательность которых введены конкретные изменения, которые модифицируют или нарушают биоактивность полипептида, но не ограничены ими.

Термин "производное фактора VII" в контексте данного описания предназначен для обозначения полипептида фактора VII, проявляющего по существу такую же биологическую активность, как фактор VII дикого типа, или улучшенную по сравнению с ним биологическую активность, в котором одна или более чем одна аминокислота родительского пептида генетически, и/или химически, и/или ферментативно модифицирована, например путем алкилирования, гликозилирования, ПЭГилирования, гликоПЭГилирования, ацилирования, образования эфира или образования амида или тому подобного. Он включает ПЭГилированный человеческий фактор VIIa, цистеин-ПЭГилированный человеческий фактор VIIa и их варианты, но не ограничен ими. Неограничивающие примеры производных фактора VII включают гликоПЭГилированные производные фактора VII, такие как раскрыто в WO 03/31464 и заявках на патент США US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557 и US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.); конъюгаты фактора VII, такие как раскрыто в WO 01/04287, заявке на патент США 20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) и WO 02/02764, заявке на патент США 20030211094 (University of Minnesota).

Термин "улучшенная биологическая активность" относится к полипептидам фактора VII (1) по существу с такой же протеолитической активностью, как у рекомбинантного человеческого фактора VIIa дикого типа, или увеличенной по сравнению с ним протеолитической активностью, или (2) к полипептидам фактора VII по существу с такой же TF-связывающей активностью, как у рекомбинантного человеческого фактора VIIa дикого типа, или увеличенной по сравнению с ним TF-связывающей активностью, или (3) к полипептидам фактора VII по существу с таким же временем полужизни в плазме крови, как у рекомбинантного человеческого фактора VIIa дикого типа, или увеличенным по сравнению с ним временем полужизни. Термин "ПЭГилированный человеческий фактор VIIa" означает человеческий фактор VIIa, содержащий молекулу PEG, конъюгированную с полипептидом человеческого фактора VIIa. Необходимо понимать, что молекула PEG может быть присоединена к любой части полипептида фактора VIIa, включая любой аминокислотный остаток или углеводную группировку полипептида фактора VIIa. Термин "цистеин-ПЭГилированный человеческий фактор VIIa" означает фактор VIIa, содержащий молекулу PEG, конъюгированную с сульфгидрильной группой цистеина, введенного в человеческий фактор VIIa.

Неограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющих по существу такую же протеолитическую активность, как рекомбинантный человеческий фактор VIIa дикого типа, или увеличенную по сравнению с ним протеолитическую активность, включают S52А-фактор VIIa, S60А-фактор VIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); варианты фактора VIIa, проявляющие увеличенную протеолитическую стабильность, такие как раскрыто в патенте США №5580560; фактор VIIa, который протеолитически расщеплен между остатками 290 и 291 или между остатками 315 и 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); окисленные формы фактора VIIa (Kornfelt et at., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); варианты фактора VII, такие как раскрыто в PCT/DK02/00189 (соответствует WO 02/077218); и варианты фактора VII, проявляющие увеличенную протеолитическую стабильность, такие как раскрыто в WO 02/38162 (Scripps Research Institute); варианты фактора VII, содержащие модифицированный Gla-домен и проявляющие повышенное связывание с мембраной, такие как раскрыто в WO 99/20767, патентах США US 6017882 и US 6747003, заявке на патент США 20030100506 (University of Minnesota) и WO 00/66753, заявках на патент США US 20010018414, US 2004220106 и US 200131005, патентах США US 6762286 и US 6693075 (University of Minnesota); и варианты фактора VII, такие как раскрыто в WO 01/58935, патенте США US 6806063, заявке на патент США 20030096338 (Maxygen ApS), WO 03/93465 (Maxygen ApS) и WO 04/029091 (Maxygen ApS).

Неограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющих увеличенную биологическую активность по сравнению с фактором VIIa дикого типа, включают варианты фактора VII, такие как раскрыто в WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635 (соответствует WO 03/027147), заявке на патент Дании РА 200201423 (соответствует WO 04/029090), заявке на патент Дании РА 200101627 (соответствует WO 03/027147); WO 02/38162 (Scripps Research Institute); и варианты фактора VIIa с повышенной активностью, такие как раскрыто в JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.).

Соответственно, варианты замен в полипептиде фактора VII включают замены в позициях Р10, К32, L305, М306, D309, L305, L305, F374, V158, М298, V158, Е296, К337, М298, М298, S336, S314, К316, К316, F374, S52, S60, R152, S344, Т106, К143, N145, V253, R290, А292, G291, R315, V317 и замены, вставки или делеции в аминокислотной последовательности от Т233 до N240, или от R304 до С329; или от I153 до R223, или их комбинации, в частности такие варианты, как P10Q, К32Е, L305V, M306D, D309S, L305I, L305T, F374P, V158T, M298Q, V158D, E296V, К337А, M298Q, М298К, S336G, S314E, К316Н, K316Q, F374Y, S52A, S60A, R152E, S344A, T106N, K143N, N145T, V253N, R290N, А292Т, G291N, R315N, V317T и замены, вставки или делеции в аминокислотной последовательности от Т233 до N240, или от R304 до С329, или от I153 до R223, или их комбинации; но не ограничены ими.

Выражение "полипептиды" в связи с терминами "полипептиды фактора X" и "полипептиды фактора IX" предназначено охватывать любой белок, содержащий аминокислотную последовательность человеческого фактора Х дикого типа и человеческого фактора IX дикого типа соответственно, а также их соответствующие "аналоги", "варианты", "родственные полипептиды", "производные" и "конъюгаты", где выражения "варианты", "родственные полипептиды", "производные" и "конъюгаты" являются такими, как определено для фактора VII, с соответствующими изменениями.

Композиции

В контексте данного описания выражение "композиция" предназначено для обозначения жидкой композиции, такой как водная жидкая композиция, то есть композиция, содержащая менее 5% неводных растворителей.

Термин "исходная композиция" относится к композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, до обработки, такой как стадия очистки, согласно настоящему изобретению. Данный термин использован для того, чтобы отличить "исходную композицию" от "вторичной композиции", которая относится к той же самой композиции, но после такой обработки, например после стадии очистки.

Представляющий интерес витамин К-зависимый белок чаще всего представляет собой рекомбинантный белок, продуцированный в условиях клеточной культуры, то есть представляющий интерес витамин К-зависимый белок либо получен прямо в виде компонента супернатанта клеточной культуры, либо получен из супернатанта клеточной культуры после одной или более чем одной стадии предварительной обработки. При применении настоящего изобретения на практике клетки представляют собой эукариотические клетки, такие как стабильная линия эукариотических клеток, включая клеточные линии СНО (например, АТСС CCL 61), COS-1 (например, АТСС CRL 1650), почек детеныша хомяка (ВНК) и НЕК293 (например, АТСС CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977), но без ограничения ими. Предпочтительной клеточной линией ВНК является клеточная линия tk^- ts13 ВНК (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), называемая далее в данном описании клетки ВНК 570. Клеточная линия ВНК 570 доступна в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852) под АТСС-регистрационным номером CRL 10314. Клеточная линия tk^- ts13 ВНК также доступна в АТСС под регистрационным номером CRL 1632. Предпочтительной клеточной линией СНО является клеточная линия СНО К1, доступная в АТСС под регистрационным номером ССI61.

Другие подходящие клеточные линии включают Rat Hep I (гепатома крыс; АТСС CRL 1600), Rat Hep II (гепатома крыс; АТСС CRL 1548), ТСМК (АТСС CCL 139), Human lung (АТСС НВ 8065), NCTC 1469 (АТСС CCL 91); клетки DUKX (клеточная линия СНО) (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) (клетки DUKX также называются клетки DXB11) и DG44 (клеточная линия СНО) (Сеll, 33: 405, 1983 и Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986), но не ограничены ими. Полезными являются также клетки 3Т3, клетки Namalwa, миеломы и клетки, полученные от слияния миелом с другими клетками. В некоторых воплощениях клетки могут представлять собой мутантные или рекомбинантные клетки, такие как, например, клетки, которые экспрессируют качественно или количественно другой спектр ферментов, которые катализируют посттрансляционную модификацию белков (например, ферментов гликозилирования, таких как гликозилтрансферазы и/или гликозидазы, или ферментов процессинга, таких как пропептиды), по сравнению с типом клеток, от которого они произошли. Подходящие линии клеток насекомых также включают клеточные линии Lepidoptera, такие как клетки Spodoptera frugiperda или клетки Trichoplusia ni (смотри, например, US 5077214), но не ограничены ими.

Обычно общее содержание белков-контаминантов в исходной (например, в неочищенной) композиции составляет по меньшей мере 200 млн^-1, например по меньшей мере 300 млн^-1, например по меньшей мере 400 млн^-1 или по меньшей мере 500 млн^-1.

Общее содержание контаминантов белка S в исходной (например, в неочищенной) композиции также обычно составляет по меньшей мере 200 млн^-1, например по меньшей мере 300 млн^-1, например по меньшей мере 400 млн^-1 или по меньшей мере 500 млн^-1.

Типичные белки-контаминанты

В контексте данного описания термины "белок-контаминант" и "белки-контаминанты" и тому подобные предназначены для обозначения белковых или полипептидных компонентов, составляющих примеси по отношению к представляющему интерес витамин К-зависимому белку. Соответственно, представляющий интерес витамин К-зависимый белок, очевидно, не должен рассматриваться в качестве белка-контаминанта, хотя определения "витамин К-зависимого белка" как такового и "белков-контаминантов" соответственно частично перекрываются. В одном воплощении белок-контаминант представляет собой витамин К-зависимый белок (но не представляющий интерес витамин К-зависимый белок).

Так как витамин К-зависимые белки обычно продуцируются в клеточных культурах, конкретные группы белков-контаминантов представляют собой белки клетки-хозяина. "Белки клетки-хозяина" представляют собой белки, продуцируемые клеткой-хозяином, экспрессирующей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, и обычно рассматриваются как примеси. Белки клетки-хозяина могут представлять собой белки человека, если для получения представляющего интерес витамин К-зависимого белка использована линия клеток человека, или белки, не принадлежащие человеку, если для получения белка, представляющего интерес, использована линия клеток, не принадлежащих человеку. Соответственно, в одном аспекте изобретения белок-контаминант представляет собой белок клетки-хозяина, такой как витамин К-зависимый белок.

Конкретный важный класс белков клетки-хозяина представляют собой белки, содержащие Gla-домен, такие как GAS-6, белок S, фактор II (протромбин), тромбин, фактор Х/Ха, фактор IX/IXa, белок С, фактор VII/VIIa, белок Z, трансмембранный Gla-белок 1, трансмембранный Gla-белок 2, трансмембранный Gla-белок 3, трансмембранный Gla-белок 4, матриксный Gla-белок и остеокальцин. Количество Gla-остатков в этих белках находится в диапазоне от 2 до 12. Так как синтез Gla-остатков требует витамина К, белки, содержащие Gla-остатки, также называются витамин К-зависимыми белками.

В контексте настоящего изобретения конкретный важный белок клетки-хозяина представляет собой белок S. В конкретном воплощении белок S представляет собой белок S хомяка. Соответственно, способы и композиции, определенные в данном описании, в особенности сфокусированы на уменьшении содержания белка S.

Уменьшение содержания белков-контаминантов

Основной аспект настоящего изобретения составляют способ(ы), обеспечивающие удаление белка-контаминанта (в частности, белка S) из композиций, содержащих представляющий интерес витамин К-зависимый белок (в частности, полипептид фактора VII).

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу уменьшения содержания одного или более чем одного белка-контаминанта в композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, включающему по меньшей мере стадии (1) контактирования композиции с твердофазным веществом, которое способно связывать один или более чем один белок-контаминант и/или представляющий интерес витамин К-зависимый белок, и (2) сбора получающейся композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, в результате чего уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 5 раз.

В наиболее важных воплощениях общее содержание белков-контаминантов в получающейся вторичной (например, очищенной) композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, уменьшено настолько, что составляет самое большее 100 млн^-1.

Как отмечено выше, представляющий интерес витамин К-зависимый белок обычно представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови, выбранный из полипептидов фактора VII, полипептидов фактора IX, полипептидов фактора Х и активированного белка С. В еще одном конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX. В еще одном конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII. В другом конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора X.

В конкретном воплощении преобладающее количество белков-контаминантов составляют полипептиды, содержащие Gla-домен, в частности белок S, а представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII. В одном воплощении белок-контаминант представляет собой белок S хомяка. В другом воплощении белок-контаминант представляет собой белок S и представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX. В одном воплощении белок-контаминант представляет собой белок S хомяка.

В одном воплощении изобретение относится к способам отделения представляющего интерес витамин К-зависимого белка, содержащего 2-16 Gla-остатков, от других витамин К-зависимых белков-контаминантов, содержащих 2-16 Gla-остатков.

В другом воплощении изобретения предложен способ отделения белков с антикоагулянтным действием, таких как белок S и белок С, от белков с коагулянтным действием. В одном аспекте представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой фактор свертывания крови, а белок-контаминант с антикоагулянтным действием представляет собой белок S.

В другом воплощении изобретения предложен способ отделения белков-контаминантов, не принадлежащих человеку, от витамин К-зависимого белка человека. В одном аспекте изобретения данные белки-контаминанты, не принадлежащие человеку, также представляют собой витамин К-зависимые белки. В еще одном аспекте данные белки-контаминанты, не принадлежащие человеку, представляют собой белки хомяка.

Таким образом, способ по изобретению позволяет получить уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, который уменьшен по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 25 раз, или по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 250 раз, или по меньшей мере в 500 раз, или по меньшей мере в 750 раз, или по меньшей мере в 1000 раз, или по меньшей мере в 2000 раз.

В частности, общее содержание белков-контаминантов в получающейся вторичной (например, очищенной) композиции, такой как обработанный супернатант клеточной культуры, составляет самое большее 100 млн^-1, например самое большее 90 млн^-1, или самое большее 80 млн^-1, или самое большее 70 млн^-1, или самое большее 60 млн^-1, или самое большее 50 млн^-1, или самое большее 40 млн^-1, или самое большее 30 млн^-1, или самое большее 20 млн^-1, или самое большее 10 млн^-1, или самое большее 5 млн^-1; или общее содержание контаминантов белка S в получающейся вторичной (например, очищенной) композиции, такой как обработанный супернатант клеточной культуры, представляет собой самое большее 100 млн^-1, например самое большее 90 млн^-1, или самое большее 80 млн^-1, или самое большее 70 млн^-1, или самое большее 60 млн^-1, или самое большее 50 млн^-1, или самое большее 40 млн^-1, или самое большее 30 млн^-1, или самое большее 20 млн^-1, или самое большее 10 млн^-1, или самое большее 5 млн^-1, или самое большее 1 млн^-1.

Типичные супернатанты клеточных культур могут содержать значительное количество белков-контаминантов (в частности, белка S), соответственно, общее содержание белков-контаминантов в (например, неочищенном) супернатанте клеточной культуры обычно составляет по меньшей мере 500 млн^-1, например по меньшей мере 750 млн^-1, или по меньшей мере 1000 млн^-1, или по меньшей мере 2000 млн^-1; или общее содержание контаминантов белка S (примесей белка S) в (например, неочищенном) супернатанте клеточной культуры составляет по меньшей мере 500 млн^-1, например по меньшей мере 750 млн^-1, или по меньшей мере 1000 млн^-1, или по меньшей мере 2000 млн^-1.

Соответственно, в одном аспекте вышеизложенное относится к способу уменьшения содержания одного или более чем одного контаминанта белка S (примеси белка S) в композиции, содержащей полипептид фактора VII, включающему по меньшей мере стадии (1) контактирования композиции с твердофазным веществом, которое способно связывать контаминант(ы) белка S (примеси белка S) и/или полипептид фактора VII, и (2) сбора получающейся композиции, содержащей полипептид фактора VII, в результате чего уровень контаминанта(ов) белка S (примеси белка S), выраженный в виде миллионных долей относительно полипептида фактора VII, уменьшен по меньшей мере в 2 раза, например по меньшей мере в 5 раз.

Твердофазные вещества, полезные в данном изобретении, представляют собой твердофазные вещества, обычно используемые в хроматографических методиках и процессах, методиках и процессах аффинного захвата и в их конкретных вариантах, как будет очевидно далее.

В одном основном варианте вышеизложенного твердофазное вещество связывает относительно большее количество белка-контаминанта по сравнению с представляющим интерес витамин К-зависимым белком. В одном аспекте представляющий интерес витамин К-зависимый белок не связывается с твердой фазой и проскакивает через хроматографическую колонку, тогда как белок-контаминант связывается с твердой фазой, что приводит к отделению представляющего интерес витамин К-зависимого белка от белка-контаминанта. В частности, твердофазное вещество специфически связывает по меньшей мере один из контаминантов, например, за счет высокого аффинитета или путем ковалентного связывания указанного(ых) контаминанта(ов), например путем образования дисульфидных связей с тиольными группировками указанного(ых) контаминанта(ов).

В одном воплощении твердофазное вещество представляет собой ионообменную смолу, такую как анионообменная смола. Обычно используемые анионообменные смолы включают Q-смолу, четвертичный амин и DEAE-смолу, ДиЭтилАминоЭтан. Анионообменные смолы имеются в продаже, например Mono Q (Amersham Biosciences), Source 15Q или 30Q (Amersham Biosciences), Poros 20HQ или 50HQ (Perseptive Biosystems), Toyopearl Q650S (Toso Haas) и другие.

Элюция с анионообменной смолы может быть выполнена путем увеличения электропроводности буфера для элюции, например путем увеличения концентрации солей в буфере для элюции или путем уменьшения рН буфера для элюции. В одном конкретном воплощении изобретения элюцию выполняют путем увеличения концентрации СаСl₂. В другом конкретном воплощении элюцию выполняют путем увеличения концентрации МgСl₂. Элюция может быть осуществлена с использованием ступенчатого или градиентного элюирования.

Наиболее широко используемая катионообменная смола содержит карбоксиметильную (СМ) или сульфопропильную (SP) группу. Примеры таких катионообменников включают Toyopearl СМ-650 или Toyopearl SP-650 (Toso Haas), Source 15 S или 30 S, CM или SP Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences), Obelix (Amersham Biosciences), но не ограничены ими.

В другом воплощении твердофазное вещество представляет собой матрикс, замещенный гидрофобными лигандами, такими как этил-, бутил-, фенил- или гексил-группы. Данный тип хроматографии называется хроматографией гидрофобного взаимодействия (НIС) и использует гидрофобные свойства белков. Адсорбция стимулируется гидрофобными взаимодействиями между неполярными областями на белке и иммобилизованными на твердофазном носителе гидрофобными лигандами. Адсорбцию выполняют при высокой концентрации соли в водной подвижной фазе, а элюцию осуществляют путем уменьшения концентрации соли. В одном конкретном воплощении вещество представляет собой матрикс, замещенный бутильным или фенильным лигандом.

В другом аспекте изобретения твердофазное вещество несет аффинные лиганды. В одном воплощении твердофазное вещество несет моноклональные антитела против по меньшей мере одного из белков-контаминантов, в частности против белка S. Это проиллюстрировано в разделе "Примеры". В другом аспекте твердофазное вещество несет иммобилизованные триазиновые лиганды, такие как триазановые лиганды, описанные в WO 97/10887 (например, триазановые лиганды, описание которых приведено, начиная со страницы 5, линия 21, и далее по страницу 13, линия 6) или в US 6117996 (например, в параграфе 4-21), содержание которых включено в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Белок S циркулирует в плазме либо в свободном состоянии, либо в комплексе с С4bр. В-цепь С4bр содержит сайт для взаимодействия с белком S. Соответственно, он является важным для настоящего изобретения, в котором использованы типы С4bр, содержащие В-цепь. В одном воплощении изобретения для иммобилизации на твердом матриксе использована вся молекула С4bр. В другом воплощении для иммобилизации на твердом матриксе использована В-цепь или последовательность В-цепи, которая способна связывать белок S.

В другом варианте твердофазное вещество несет иммобилизованный белок С. В другом варианте твердофазное вещество несет иммобилизованный триазиновый лиганд. В другом варианте твердофазное вещество несет С4-связывающий белок. Белок S связывается с белком С и С4bр с гораздо большим аффинитетом, чем с другими витамин К-зависимыми белками. Поэтому содержание белка S может быть уменьшено путем связывания белка S с иммобилизованным белком С или С4bр. Альтернативно, для иммобилизации на твердой фазе можно использовать выбранные последовательности белка С и С4bр, ответственные за связывание с белком S.

С4b-связывающий белок (С4bр) участвует в регуляции системы комплемента. Он представляет собой мультимерный белок, содержащий 7 идентичных альфа-цепей и одну бета-цепь. Альфа- и бета-цепи имеют молекулярные массы 70 кДа и 45 кДа соответственно. Обе субъединицы принадлежат суперсемейству белков, состоящих преимущественно из тандемно расположенных коротких консенсусных повторов (SCR), приблизительно 60 аминокислотных остатков в длину.

В другом воплощении твердофазное вещество связывает по меньшей мере один из контаминантов путем ковалентного захвата. Белок S имеет одну свободную цистеиновую группировку, тогда как фактор VII не имеет ни одной. Данная свободная цистеиновая группировка затем может быть селективно присоединена к активированному, содержащему тиольную группу веществу или матриксу путем тиол-дисульфидного обмена с образованием смешанного дисульфида. Таким образом можно было бы уменьшить содержание белка S, например, путем ковалентной хроматографии, размерно-эксклюзионной хроматографии или с помощью методик с использованием мембран. Следует понимать, что вариант данного воплощения представляет собой вариант, где твердофазное вещество не участвует, то есть где образование дисульфида (например, путем образования димеров) позволяет отделить белок-контаминант от представляющего интерес витамин К-зависимого белка другими средствами, например путем размерно-эксклюзионной хроматографии или с помощью методик с использованием мембран.

В одном конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой компонент супернатанта клеточной культуры, см. раздел "Примеры".

В другом воплощении способа, дополнительно определенного выше, твердофазное вещество связывает относительно большее количество представляющего интерес витамин К-зависимого белка по сравнению с белком(ами)-контаминантом(ами). Более конкретно, твердофазное вещество специфически связывает представляющий интерес витамин К-зависимый белок.

В одном варианте твердофазное веществе несет моноклональные антитела против представляющего интерес витамин К-зависимого белка или его аналога.

В другом варианте твердофазное вещество несет ингибитор указанного представляющего интерес витамин К-зависимого белка, например ингибитор бензамидин- или гуанидин-типа, такой как ингибиторы, содержащие мотив -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R², где

Z¹ и Z² независимо выбраны из группы, состоящей из -O-, -S-, -NR^H- и одинарной связи, где R^H выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4-алкила, арила и арилметила, и R¹ и R² независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, возможно замещенного C_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного арила, возможно замещенного гетероциклила, или

Z² и R² являются такими, как определено выше, и -C=N-Z¹-R¹ образует часть гетероциклического кольца, или

Z¹ и R¹ являются такими, как определено выше, и -C-NH-Z²-R² образует часть гетероциклического кольца, или

-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R² образует гетероциклическое кольцо, где -Z¹-R¹-R²-Z²- представляет собой бирадикал.

В еще одних вариантах твердофазное вещество несет металл, который способен образовывать хелатные комплексы с указанным представляющим интерес витамин К-зависимым белком (где последующая элюция может быть выполнена путем изменения рН или буфером, подобным имидазолу), или несет иммобилизованный тканевый фактор (тромбопластин) (в данном случае обнаружено, что полипептиды фактора VII связываются с тканевым фактором с гораздо большим аффинитетом, чем белки-контаминанты, подобные белку S, по этой причине можно будет уменьшить содержание, например, белка S путем связывания, например, полипептида фактора VII с иммобилизованным тканевым фактором (смотри также US 6573056), или несет иммобилизованный гепарин (смотри раздел "Примеры"), или несет фосфатидилсерин (фосфатидилсерин связывается с Gla-доменом белков, содержащих Gla-домен, подобных витамин К-зависимым белкам, только в отсутствие кальция; в присутствии кальция фосфатидилсерин связывается с EGF-доменом (фактор VII имеет 2 EGF-петли, а белок S имеет 4 EGF-петли), соответственно, фактор VII и белки-контаминанты, подобные белку S, можно будет разделить вследствие различной аффинности к фосфатидилсерину, особенно в присутствии кальция).

В другом воплощении твердофазное вещество представляет собой гидроксиапатит.

В другом воплощении способа, дополнительно определенного выше, твердофазное вещество представляет собой вещество хроматографической матрицы. Примерами подходящих твердофазных веществ являются, например, твердофазные вещества, выбранные из анионообменных веществ, катионообменных веществ, гидроксиапатита, гидрофобных твердофазных веществ и так далее, см. раздел "Примеры".

Различные конкретные аспекты изобретения будут описаны дальше.

Иммуноаффинное использование моноклонального антитела против белка-контаминанта

Согласно данному аспекту настоящего изобретения по меньшей мере один из белков-контаминантов связывается с твердофазным веществом, несущим моноклональные антитела. Соответственно, композиция может быть просто приведена в контакт с указанным твердофазным веществом и затем отделена от этого твердофазного вещества, с тем чтобы получить по меньшей мере менее загрязненную композицию.

Присоединение моноклональных антител к твердофазному веществу может быть выполнено через реакционноспособные группы, расположенные на твердофазном веществе. Наиболее часто используемые матриксы представляют собой носители, активированные бромцианом (CNBr) или N-гидроксисукцинимидом (NHS) (Wilchek M. et al., Reactive & Functional Polymers. 1999, 41, 263-268). Что касается CNBr- и NHS-активированных носителей, присоединение имеет место через первичные амино-группы антитела и приводит к образованию связи с CNBr-группой через остаток изомочевины и амидной связи с NHS-группой.

Раствор антитела разбавляют подходящим буфером для связывания или диализируют в этом же буфере, например, 0,2 M NaHCO₃, 0,5 M NaCl pH 8,3, могут быть использованы буферные агенты с первичными амино-группами. Значение pH, при котором происходит присоединение, зависит от антитела и активированного носителя, но обычно может быть использован pH 6-9. Чтобы сохранить стабильность активированного носителя до использования, его промывают 1 мМ HCl, охлажденной до 0°С, в количестве 10-15 объемов носителя. Сразу после этого промытый носитель переносят в раствор антитела и мягко перемешивают и доводят до желаемого уровня pH. Смесь для связывания оставляют при слабом вращении либо на несколько часов при комнатной температуре, либо на ночь при 4°С. После того как присоединение закончено, любые непрореагировавшие группы на носителе блокируют путем выдерживания, например, в буфере pH 8-9, содержащем Трис, этаноламин или глицин, в течение нескольких часов при комнатной температуре. После блокирования носитель промывают с использованием методики, согласно которой меняют высокий и низкий pH, например, буфером для блокирования и ацетатным буфером pH 3-4.

Одно конкретное воплощение относится к способу уменьшения содержания одного или более чем одного белка-контаминанта в исходной композиции (такой, как супернатант клеточной культуры), содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, включающему стадию (1) контактирования исходной (например, неочищенной) композиции с твердофазным веществом, несущим моноклональные антитела против по меньшей мере одного из белков-контаминантов, и (2) отделения получающейся таким образом вторичной композиции от указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить композицию, где уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 5 раз.

Соответственно, было обнаружено, что очень полезно использовать супернатант клеточной культуры прямо, то есть без стадий какой-либо предварительной очистки. Это может быть обусловлено тем фактом, что белок(ки)-контаминант(ы) могут быть, по меньшей мере частично, расщеплены представляющим интерес витамин К-зависимым белком, если супернатант клеточной культуры подвергается процессингу до применения настоящего способа, в результате чего возникает более сложная смесь белков-контаминантов. Соответственно, когда имеет место такая сложная смесь, уменьшение содержание белков-контаминантов может оказаться даже более трудным.

Таким образом, следует понимать, что в настоящем изобретении также предложен альтернативный способ, где применяют те же самые стадии, но где жидкая композиция, содержащая представляющий интерес витамин К-зависимый белок, необязательно представляет собой компонент супернатанта клеточной культуры, полученный прямо из клеточной культуры.

Белок(ки)-контаминант(ы) обычно представляет(ют) собой белки клетки-хозяина, и, соответственно, обычно используют моноклональное антитело против белка-контаминанта, выбранного из таких белков клетки-хозяина, как белки-контаминанты, содержащий Gla-домен, в частности против белка-контаминанта, выбранного из GAS-6, белка S, фактора II (протромбина), фактора Х/Ха, фактора IX/IXa, белка С, фактора VIIa, белка Z, трансмембранного Gla-белка 1, трансмембранного Gla-белка 2, трансмембранного Gla-белка 3, трансмембранного Gla-белка 4, матриксного Gla-белка и остеокальцина, более конкретно против белка S.

Как отмечено в данном описании выше, представляющий интерес витамин К-зависимый белок обычно представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови, выбранный из полипептидов фактора VII, полипептидов фактора IX, полипептидов фактора Х и активированного белка С. В одном более конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX. В другом более конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.

В одном воплощении преобладающее количество белков-контаминантов составляют полипептиды, содержащие Gla-домен, в частности белок S, и представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.

Таким образом, данный способ делает возможным получение уровня белка(ов)-контаминанта(ов), выраженного в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, который уменьшен по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 25 раз, или по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 250 раз, или по меньшей мере в 500 раз, или по меньшей мере в 750 раз, или по меньшей мере в 1000 раз, или по меньшей мере в 2000 раз.

В частности, общее содержание белков-контаминантов во вторичной (очищенной) композиции составляет самое большее 100 млн^-1, например самое большее 90 млн^-1, или самое большее 80 млн^-1, или самое большее 70 млн^-1, или самое большее 60 млн^-1, или самое большее 50 млн^-1, или самое большее 40 млн^-1, или самое большее 30 млн^-1, или самое большее 20 млн^-1, или самое большее 10 млн^-1, или самое большее 5 млн^-1; или общее содержание контаминантов белка S во вторичной (очищенной) композиции составляет самое большее 100 млн^-1, например самое большее 90 млн^-1, или самое большее 80 млн^-1, или самое большее 70 млн^-1, или самое большее 60 млн^-1, или самое большее 50 млн^-1, или самое большее 40 млн^-1, или самое большее 30 млн^-1, или самое большее 20 млн^-1, или самое большее 10 млн^-1, или самое большее 5 млн^-1.

Типичные супернатанты клеточных культур могут содержать значительное количество белков-контаминантов (в частности, белка S), соответственно, общее содержание белков-контаминантов в супернатанте клеточной культуры (таком, как неочищенный супернатант клеточной культуры) обычно составляет по меньшей мере 500 млн^-1, например по меньшей мере 750 млн^-1, или по меньшей мере 1000 млн^-1, или по меньшей мере 2000 млн^-1; или общее содержание контаминантов белка S в неочищенном супернатанте клеточной культуры составляет по меньшей мере 500 млн^-1, например по меньшей мере 750 млн^-1, или по меньшей мере 1000 млн^-1, или по меньшей мере 2000 млн^-1.

Конкретное воплощение данного аспекта настоящего изобретения относится к способу уменьшения содержания контаминантов белка S в супернатанте клеточной культуры, содержащем полипептид фактора VII, включающему стадию (1) контактирования исходной композиции, такой как супернатант клеточной культуры, с твердофазным веществом, несущим моноклональные антитела против контаминанта(ов) белка S, и (2) отделения получающейся таким образом вторичной композиции от указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить композицию, где уровень контаминанта(ов) белка S, выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес полипептида фактора VII, уменьшен по меньшей мере в 50 раз.

Иммобилизованный белок С

Согласно данному аспекту настоящего изобретения по меньшей мере один из белков-контаминантов связывается твердофазным веществом, несущим иммобилизованный белок С. Соответственно, композиция может быть просто приведена в контакт с указанным твердофазным веществом и затем отделена от данного твердофазного вещества, с тем чтобы получить по меньшей мере менее загрязненную композицию.

Более конкретно, в изобретении предложен способ уменьшения содержания белков-контаминантов в композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, включающий стадию (1) контактирования исходной композиции с твердофазным веществом, несущим иммобилизованный белок С, и (2) отделения получающейся таким образом вторичной композиции от указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить композицию, где уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 5 раз, такой как способ уменьшения содержания белка S в композиции, содержащей полипептид фактора VII, включающий стадию (1) контактирования исходной композиции с твердофазным веществом, несущим иммобилизованный белок С, и (2) отделения получающейся таким образом вторичной композиции от указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить композицию, где уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 10 раз.

Следует понимать, что вышеупомянутые способы уменьшения содержания белка(ов)-контаминанта(ов) можно применять по одному или в комбинации, например в комбинации. Отдельные стадии хроматографии можно проводить в любом подходящем порядке. Исходя из предварительных исследований можно считать, что следующие комбинации обеспечивают в целом идеальное уменьшение содержания белка(ов)-контаминанта(ов):

- катионообменная хроматография → иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка-контаминанта → анионообменная хроматография

- катионообменная хроматография → хроматография гидрофобного взаимодействия → анионообменная хроматография

- катионообменная хроматография → хроматография гидрофобного взаимодействия → иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка-контаминанта → анионообменная хроматография

- анионообменная хроматография → иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка, представляющего интерес → иммуноаффинное использование моноклональных антител против контаминантов → анионообменная хроматография → хроматография гидрофобного взаимодействия

- анионообменная хроматография → хроматография гидрофобного взаимодействия → катионообменная хроматография

- анионообменная хроматография → хроматография гидрофобного взаимодействия → иммуноаффинное использование моноклональных антител против белков-контаминантов → катионообменная хроматография

- анионообменная хроматография → иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка, представляющего интерес → анионообменная хроматография → хроматография гидрофобного взаимодействия

- катионообменная хроматография → гидроксиапатит → анионообменная хроматография

- катионообменная хроматография → гидроксиапатит → иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка-контаминанта → анионообменная хроматография

- иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка, представляющего интерес → хроматография гидрофобного взаимодействия → анионообменная хроматография → иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка-контаминанта → анионообменная хроматография

- иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка, представляющего интерес → анионообменная хроматография → хроматография гидрофобного взаимодействия → иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка-контаминанта → анионообменная хроматография

- гидроксиапатит → хроматография гидрофобного взаимодействия → катионообменная хроматография → анионообменная хроматография

- гидроксиапатит → иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка-контаминанта → катионообменная хроматография → анионообменная хроматография

- иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка-контаминанта → хроматография гидрофобного взаимодействия → анионообменная хроматография

- иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка-контаминанта → хроматография гидрофобного взаимодействия → гель-фильтрация → анионообменная хроматография

- иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка-контаминанта → катионообменная хроматография → хроматография гидрофобного взаимодействия → анионообменная хроматография

- иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка, представляющего интерес → анионообменная хроматография → хроматография гидрофобного взаимодействия → катионообменная хроматография

В конкретном воплощении иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка, представляющего интерес, применяют в качестве первой стадии способа очистки. Соответственно, было обнаружено, что очень полезно использовать супернатант клеточной культуры прямо, то есть без стадий какой-либо предварительной очистки. Следует понимать, что содержание белка(ов)-контаминанта(ов) обычно уменьшается по меньшей мере в 2 раза, например по меньшей мере в 5 раз, на каждой из стадий описанных выше многостадийных методик.

Новые композиции, содержащие представляющий интерес витамин К-зависимый белок

Считается, что способы по настоящему изобретению приводят к возникновению композиций витамин К-зависимых белков, в частности полипептидов фактора VII, которые сами по себе являются новыми.

Следовательно, другой аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, продуцированный в условиях клеточной культуры, где общее содержание белков-контаминантов составляет самое большее 100 млн^-1 исходя из содержания представляющего интерес витамин К-зависимого белка. В большинстве его воплощений содержание белков-контаминантов находится в диапазоне 0,01-100 млн^-1, например в диапазоне 0,01-50 млн^-1, например 0,05-25 млн^-1, или 0,05-20 млн^-1, или 0,05-15 млн^-1, или 0,05-10 млн^-1, или 0,05-5 млн^-1.

Альтернативный аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей полипептид фактора VII, полученный из бессывороточной культуры клеток, не принадлежащих человеку, где общее содержание контаминантов белка S составляет самое большее 100 млн^-1 исходя из содержания полипептида фактора VII. В большинстве его воплощений содержание белков-контаминантов находится в диапазоне 0,01-100 млн^-1, например в диапазоне 0,01-50 млн^-1, например 0,05-25 млн^-1, или 0,05-20 млн^-1, или 0,05-15 млн^-1, или 0,05-10 млн^-1, или 0,05-5 млн^-1.

В вышеизложенных аспектах представляющий интерес витамин К-зависимый белок обычно представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови, выбранный из полипептидов фактора VII, полипептидов фактора IX, полипептидов фактора Х и активированного белка С. В одном более конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX. В другом более конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.

Более конкретное воплощение вышеизложенного относится к композиции, содержащей полипептид фактора VII, продуцированный в условиях клеточной культуры, где общее содержание контаминантов белка S составляет самое большее 100 млн^-1 исходя из содержания полипептида фактора VII.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими воплощениями.

1. Способ уменьшения содержания одного или более чем одного белка-контаминанта в композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, включающий по меньшей мере стадии (1) контактирования исходной композиции с твердофазным веществом, которое способно связывать один или более чем один белок-контаминант и/или представляющий интерес витамин К-зависимый белок, и (2) сбора получающейся вторичной композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, в результате чего уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен в указанной получающейся вторичной композиции по сравнению с указанной исходной композицией по меньшей мере в 2 раза, например по меньшей мере в 5 раз, например по меньшей мере в 10 раз, например по меньшей мере в 20 раз, например по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 100 раз.

2. Способ по воплощению 1, где общее содержание белков-контаминантов в получающейся вторичной композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, составляет самое большее 100 млн^-1.

3. Способ по любому из воплощений 1-2, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови, выбранный из полипептидов фактора VII, полипептидов фактора IX, полипептидов фактора Х и активированного белка С.

4. Способ по воплощению 1-3, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX.

5. Способ по воплощению 1-3, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII, такой как человеческий фактор VIIa дикого типа.

6. Способ по воплощению 5, где полипептид фактора VII содержит аминокислотную замену, выбранную из P10Q и К32Е.

7. Способ по любому из воплощений 1-6, где преобладающее количество белков-контаминантов составляют полипептиды, содержащие Gla-домен, в частности белок S, и где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.

8. Способ по любому из воплощений 1-7, где уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 25 раз, или по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 250 раз, или по меньшей мере в 500 раз, или по меньшей мере в 750 раз, или по меньшей мере в 1000 раз, или по меньшей мере в 2000 раз, или по меньшей мере в 5000 раз.

9. Способ по любому из воплощений 1-8, где общее содержание белков-контаминантов в получающейся вторичной композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, составляет самое большее 100 млн^-1, например самое большее 50 млн^-1, например самое большее 10 млн^-1, например самое большее 5 млн^-1, например самое большее 2 млн^-1, например самое большее 1 млн^-1.

10. Способ по любому из воплощений 1-9, где общее содержание белков-контаминантов в исходной композиции составляет по меньшей мере 500 млн^-1.

11. Способ по любому из воплощений 1-10, где общее содержание контаминантов белка S в исходной композиции составляет по меньшей мере 500 млн^-1.

12. Способ уменьшения содержания одного или более чем одного контаминанта белка S в композиции, содержащей полипептид фактора VII, включающий по меньшей мере стадии (1) контактирования исходной композиции с твердофазным веществом, которое способно связывать контаминант(ы) белка S и/или полипептид фактора VII, и (2) сбора получающейся вторичной композиции, содержащей полипептид фактора VII, в результате чего уровень контаминанта(ов) белка S, выраженный в виде миллионных долей относительно полипептида фактора VII, уменьшен по меньшей мере в 2 раза, например в 5 раз.

13. Способ по любому из воплощений 1-11 и 12, где твердофазное вещество связывает относительно большее количество белка-контаминанта по сравнению с представляющим интерес витамин К-зависимым белком.

14. Способ по воплощению 13, где твердофазное вещество специфически связывает по меньшей мере один из контаминантов, например, за счет высокого аффинитета или путем ковалентного связывания указанного(ых) контаминанта(ов), например путем образования дисульфидных связей с тиольными группировками указанного(ых) контаминанта(ов).

15. Способ по любому из воплощений 13 и 14, где твердофазное вещество несет моноклональные антитела против по меньшей мере одного из белков-контаминантов.

16. Способ по воплощению 15, где композиция, содержащая представляющий интерес витамин К-зависимый белок, представляет собой компонент супернатанта клеточной культуры.

17. Способ по воплощению 14, где твердофазное вещество несет иммобилизованный белок С.

18. Способ по любому из воплощений 1-11 и 12, где твердофазное вещество связывает относительно большее количество представляющего интерес витамин К-зависимого белка по сравнению с белком(ами)-контаминантом(ами).

19. Способ по воплощению 18, где твердофазное вещество специфически связывает представляющий интерес витамин К-зависимый белок.

20. Способ по любому из воплощений 18 и 19, где твердофазное вещество несет моноклональные антитела против представляющего интерес витамин К-зависимого белка или его аналога.

21. Способ по любому из воплощений 18 и 19, где твердофазное вещество представляет собой триазиновый лиганд, обладающий аффинностью к представляющему интерес витамин К-зависимому белку или его аналогу.

22. Способ по любому из воплощений 18 и 19, где твердофазное вещество несет ингибитор указанного представляющего интерес витамин К-зависимого белка, или несет металл, который способен образовывать хелатные комплексы с указанным представляющим интерес витамин К-зависимым белком, или несет иммобилизованный тканевый фактор (тромбопластин), или несет иммобилизованный гепарин.

23. Способ по воплощению 22, где ингибитор указанного представляющего интерес витамин К-зависимого белка представляет собой ингибитор бензамидин- или гуанидин-типа, такой как ингибиторы, содержащие мотив -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R², где

Z¹ и Z² независимо выбраны из группы, состоящей из -O-, -S-, -NR^H- и одинарной связи, где R^H выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4-алкила, арила и арилметила, и R¹ и R² независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, возможно замещенного С_1-6-алкила, возможно замещенного C_2-6-алкенила, возможно замещенного арила, возможно замещенного гетероциклила, или

Z² и R² являются такими, как определено выше, и -C=N-Z¹-R¹ образует часть гетероциклического кольца, или

Z¹ и R¹ являются такими, как определено выше, и -C-NH-Z²-R² образует часть гетероциклического кольца, или

-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R² образует гетероциклическое кольцо, где -Z¹-R¹-R²-Z²-представляет собой бирадикал.

24. Способ по любому из воплощений 1-11 и 12, где твердофазное вещество представляет собой вещество хроматографической матрицы.

25. Способ по любому из воплощений 1-11 и 12, где твердофазное вещество связано с мембраной.

26. Способ по воплощению 22-23, где твердофазное вещество представляет собой анионообменное вещество.

27. Способ по воплощению 26, где элюцию с анионообменного вещества выполняют путем увеличения концентрации соли кальция, такой как СаСl₂.

28. Способ по воплощению 26, где элюцию с анионообменного вещества выполняют путем увеличения концентрации соли магния, такой как МgСl₂.

29. Способ по воплощению 24, где твердофазное вещество представляет собой катионообменное вещество.

30. Способ по воплощению 24, где твердофазное вещество представляет собой гидроксиапатит.

31. Способ по воплощению 24, где твердофазное вещество представляет собой гидрофобное твердофазное вещество.

32. Способ уменьшения содержания одного или более чем одного белка-контаминанта в композиции (в частности, в супернатанте клеточной культуры), содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, включающий стадию (1) контактирования исходной композиции с твердофазным веществом, несущим моноклональные антитела против по меньшей мере одного из белков-контаминантов, и (2) отделения получающейся вторичной композиции от указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить композицию, где уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 5 раз.

33. Способ по воплощению 32, где моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело против белка-контаминанта, выбранного из белков клетки-хозяина, таких как белки-контаминанты, содержащие Gla-домен, в частности против белка-контаминанта, выбранного из GAS-6, белка S, фактора II (протромбина), тромбина, фактора Х/Ха, фактора IX/IXa, белка С, фактора VII/VIIa, белка Z, трансмембранного Gla-белка 1, трансмембранного Gla-белка 2, трансмембранного Gla-белка 3, трансмембранного Gla-белка 4, матриксного Gla-белка и остеокальцина, более конкретно против белка S.

34. Способ по любому из воплощений 27-28, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови, выбранный из полипептидов фактора VII, полипептидов фактора IX, полипептидов фактора Х и активированного белка С.

35. Способ по воплощению 29, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX.

36. Способ по воплощению 29, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.

37. Способ по любому из воплощений 32-36, где преобладающее количество белков-контаминантов составляют полипептиды, содержащие Gla-домен, в частности белок S, и где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.

38. Способ по любому из воплощений 32-37, где преобладающее количество белков-контаминантов составляет белок S хомяка.

39. Способ по любому из воплощений 32-38, где уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 25 раз, или по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 250 раз, или по меньшей мере в 500 раз, или по меньшей мере в 750 раз, или по меньшей мере в 1000 раз, или по меньшей мере в 2000 раз.

40. Способ по любому из воплощений 32-39, где общее содержание белков-контаминантов в получающейся вторичной композиции составляет самое большее 100 млн^-1.

41. Способ по любому из воплощений 32-40, где общее содержание контаминантов белка S в получающейся вторичной композиции составляет самое большее 100 млн^-1.

42. Способ по любому из воплощений 32-41, где общее содержание белков-контаминантов в исходной композиции составляет по меньшей мере 500 млн^-1.

43. Способ по любому из воплощений 32-42, где общее содержание контаминантов белка S в исходной композиции составляет по меньшей мере 500 млн^-1.

44. Способ уменьшения содержания контаминантов белка S в композиции, такой как супернатант клеточной культуры, содержащей полипептид фактора VII, включающий стадию (1) контактирования исходной композиции, такой как супернатант клеточной культуры, с твердофазным веществом, несущим моноклональные антитела против контаминанта(ов) белка S, и (2) отделения получающейся вторичной композиции от указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить композицию, где уровень контаминанта(ов) белка S, выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес полипептида фактора VII, уменьшен по меньшей мере в 50 раз.

45. Способ уменьшения содержания белков-контаминантов в композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, включающий стадию (1) контактирования исходной композиции с твердофазным веществом, несущим иммобилизованный белок С, и (2) отделения получающейся вторичной композиции от указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить композицию, где уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 5 раз.

46. Способ по воплощению 45, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови, выбранный из полипептидов фактора VII, полипептидов фактора IX, полипептидов фактора Х и активированного белка С.

47. Способ по воплощению 46, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX.

48. Способ по воплощению 46, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.

49. Способ по любому из воплощений 45-48, где преобладающее количество белков-контаминантов составляют полипептиды, содержащие Gla-домен, в частности белок S, и где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.

50. Способ по любому из воплощений 45-49, где уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 25 раз, или по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 250 раз, или по меньшей мере в 500 раз, или по меньшей мере в 750 раз, или по меньшей мере в 1000 раз, или по меньшей мере в 2000 раз.

51. Способ по любому из воплощений 45-50, где общее содержание белков-контаминантов в указанной получающейся вторичной композиции составляет самое большее 100 млн^-1.

52. Способ по любому из воплощений 45-51, где общее содержание контаминантов белка S в указанной получающейся вторичной композиции составляет самое большее 100 млн^-1.

53. Способ по любому из воплощений 45-52, где общее содержание белков-контаминантов в указанной исходной композиции составляет по меньшей мере 500 млн^-1.

54. Способ по любому из воплощений 45-53, где общее содержание контаминантов белка S в указанной исходной композиции составляет по меньшей мере 500 млн^-1.

55. Способ уменьшения содержания белка S в композиции, содержащей полипептид фактора VII, включающий стадию (1) контактирования исходной композиции с твердофазным веществом, несущим иммобилизованный белок С, и (2) отделения получающейся вторичной композиции от указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить композицию, где уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 10 раз.

56. Способ уменьшения содержания одного или более чем одного белка-контаминанта в супернатанте клеточной культуры, содержащем представляющий интерес витамин К-зависимый белок, включающий стадию (1) контактирования супернатанта клеточной культуры с твердофазным веществом, несущим моноклональные антитела против представляющего интерес витамин К-зависимого белка или его аналога, (2) возможно промывания указанного твердофазного вещества и (3) элюирования представляющего интерес витамин К-зависимого белка с указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить получающуюся композицию, где уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 5 раз.

57. Способ по воплощению 56, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови, выбранный из полипептидов фактора VII, полипептидов фактора IX, полипептидов фактора Х и активированного белка С.

58. Способ по воплощению 57, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX.

59. Способ по воплощению 57, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.

60. Способ по любому из воплощений 56-59, где преобладающее количество белков-контаминантов составляют полипептиды, содержащие Gla-домен, в частности белок S, и где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.

61. Способ по любому из воплощений 56-60, где уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 25 раз, или по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 250 раз, или по меньшей мере в 500 раз, или по меньшей мере в 750 раз, или по меньшей мере в 1000 раз, или по меньшей мере в 2000 раз.

62. Способ по любому из воплощений 56-61, где общее содержание белков-контаминантов в указанной конечной композиции составляет самое большее 100 млн^-1.

63. Способ по любому из воплощений 56-62, где общее содержание контаминантов белка S в указанной получающейся композиции составляет самое большее 100 млн^-1.

64. Способ по любому из воплощений 56-63, где общее содержание белков-контаминантов в супернатанте клеточной культуры составляет по меньшей мере 500 млн^-1.

65. Способ по любому из воплощений 56-64, где общее содержание контаминантов белка S в супернатанте клеточной культуры составляет по меньшей мере 500 млн^-1.

66. Способ уменьшения содержания белков-контаминантов в супернатанте клеточной культуры, содержащем полипептид фактора VII, включающий стадию (1) контактирования супернатанта клеточной культуры с твердофазным веществом, несущим моноклональные антитела против полипептида фактора VII или его аналога, (2) возможно промывания указанного твердофазного вещества и (3) элюирования полипептида фактора VII с указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить получающуюся композицию, где уровень белков-контаминантов, выраженный в виде миллионных долей относительно полипептида фактора VII, уменьшен по меньшей мере в 100 раз.

67. Способ уменьшения содержания белка S в супернатанте клеточной культуры, содержащем полипептид фактора VII, включающий стадию (1) контактирования супернатанта клеточной культуры с твердофазным веществом, несущим моноклональные антитела против полипептида фактора VII или его аналога, (2) возможно промывания указанного твердофазного вещества и (3) элюирования полипептида фактора VII с указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить получающуюся композицию, где уровень белка S, выраженный в виде миллионных долей относительно полипептида фактора VII, уменьшен по меньшей мере в 100 раз.

68. Композиция, содержащая представляющий интерес витамин К-зависимый белок, продуцированный в условиях клеточной культуры, где общее содержание белков-контаминантов составляет самое большее 100 млн^-1 исходя из содержания представляющего интерес витамин К-зависимого белка.

69. Композиция по воплощению 68, где содержание белков-контаминантов находится в диапазоне 0,01-100 млн^-1, например в диапазоне 0,01-50 млн^-1, например 0,05-25 млн^-1, или 0,05-20 млн^-1, или 0,05-15 млн^-1, или 0,05-10 млн^-1, или 0,05-5 млн^-1.

70. Композиция, содержащая полипептид фактора VII, полученный из бессывороточной культуры клеток, не принадлежащих человеку, где общее содержание контаминантов белка S составляет самое большее 100 млн^-1 исходя из содержания полипептида фактора VII.

71. Композиция, содержащая полипептид фактора IX, полученный из бессывороточной культуры клеток, не принадлежащих человеку, где общее содержание контаминантов белка S составляет самое большее 100 млн^-1 исходя из содержания полипептида фактора IX.

72. Композиция по любому из воплощений 67-71, где содержание контаминантов белка S находится в диапазоне 0,01-100 млн^-1, например в диапазоне 0,01-50 млн^-1, например 0,05-25 млн^-1, или 0,05-20 млн^-1, или 0,05-15 млн^-1, или 0,05-10 млн^-1, или 0,05-5 млн^-1.

73. Композиция по любому из воплощений 67-72, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови, выбранный из полипептидов фактора VII, полипептидов фактора IX, полипептидов фактора Х и активированного белка С.

74. Композиция по воплощению 73, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX.

75. Композиция по воплощению 73, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.

76. Композиция, содержащая полипептид фактора VII, продуцированный в условиях клеточной культуры, где общее содержание контаминантов белка S составляет самое большее 100 млн^-1, например находится в диапазоне 0,01-100 млн^-1, исходя из содержания полипептида фактора VII.

ПРИМЕРЫ

Моноклональные антитела против белка S хомяка

Данные антитела созданы с использованием RBF мышей, иммунизированных пулом белка S хомяка, выделенным из продукции SF-фактора VIIa, и путем использования методики слияния, включающей клетки миеломы FoxNy в качестве партнера при слиянии с RBF-спленоцитами. Указанные моноклональные антитела узнают любой эпитоп за пределами сайта расщепления тромбином, а также за пределами области связывания с С4ВР. Кроме того, указанные моноклональные антитела могут быть Са²⁺-независимыми, а также Са²⁺-зависимыми. Указанное моноклональное антитело может принадлежать любому классу Ig.

Са²⁺-независимые моноклональные антитела против белка S хомяка предназначены для использования в обнаружении контаминации белком S хомяка любого лекарства, продуцированного СНО-клетками. Кроме того, Са²⁺-зависимые моноклональные антитела против белка S хомяка предполагается использовать для выделения белка S хомяка из продукции лекарств, продуцированных СНО-клетками, и для его очистки и, в частности, для уменьшения (например, удаления) содержания белка S в композициях витамин К-зависимых белков.

RBF-мышей иммунизировали белком S хомяка, выделенным из продукции SF-фактора VIIa (batch HW3-029 pool, содержит <1% фактора VIIa). Через 6 недель проводили два слияния с использованием клеток миеломы FoxNy. Выделили несколько гибридом и тестировали их способность связывать белок S при различных концентрациях Са²⁺, начиная с отсутствия Са²⁺ и доводя концентрацию Са²⁺ до 35 мМ Са²⁺. Были выбраны четыре Са²⁺-независимых моноклона (ProS-1 F18, ProS-1 F22, ProS-2 F32 и ProS-2 F46), которые по результатам изотипирования относились либо к IgG1, либо к IgG2a изотипу. С целью обнаружения контаминации белком S хомяка в зависимости от Са²⁺ был разработан сэндвич-ЕLISА-анализ (сэндвич-вариант твердофазого иммуноферментного анализа) с использованием двух (ProS-1 F18 и ProS-2 F32) из этих четырех Са²⁺-независимых антител, так как эти два антитела показывали хорошую кооперацию. Относительная аффинность этих четырех Са²⁺-независимых моноклональных антител была очень низкой. Кроме того, авторы показали, что отсутствует перекрестная реактивность в отношении фактора VIIa. Один моноклон, ProS-1 F22, использовали в ELISA для обнаружения белка S человека. F22 вообще не узнавал белок S человека. По всей вероятности, это имеет место также и в случае других моноклонов. Кроме того, авторы создали три Са²⁺-зависимых антитела, ProS-2 F15, ProS-2 F35 и ProS-2 F44, ни одно из которых не связывается ни с одним белком S в присутствии 20 мМ цитрата, то есть когда отсутствует Са²⁺. Способность этих трех антител связываться с белком S изменяется в зависимости от концентрации Са²⁺ (в диапозоне от 2,5 мМ до 35 мМ Са²⁺) и резко меняется у всех антител в условиях, когда отсутствует Са²⁺. Эти три антитела заморожены до дальнейших исследований.

Определение содержания белка S хомяка, ELISA с использованием моноклональных антител

Относительное содержание белка S хомяка определяют с помощью сэндвич-ELISA с использованием двух разных моноклональных антител. Данные антитела были созданы в мышах с использованием очищенного белка S из СНО-клеток.

96-луночный микропланшет Nunc maxisorb покрывают антителом ProS-2-F32; функция этого антитела состоит в захвате антигена.

Методика покрытия состоит в следующем: по 100 мкл раствора, содержащего приблизительно 5 мкг/мл ProS-2-F32 (исходный раствор с концентрацией 1,93 мг/мл разбавляют 0,1 М Na₂HCO₃, pH 9,8 в соотношении 1:386), вносят в каждую лунку 96-луночного микропланшета Nunc maxisorb, сверху планшет заклеивают (с использованием устройства для заклеивания планшетов "plate sealer") и планшет инкубируют в течение ночи при температуре от 1 до 9°С.

На 2-й день, после первичной инкубации раствор удаляют и каждую из лунок блокируют следующим образом: в каждую ячейку добавляют 350 мкл блокирующего буфера (фосфатно-солевой буфер (PBS), 0,010 М фосфат и 0,15 М NaCl, 0,1% Tween 20 pH 7,2), сверху планшет заклеивают (с использованием "plate sealer") и планшет инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, при этом комнатная температура определена как температура в диапазоне от 18 до 25°С. По истечении времени инкубации с блокирующим раствором данный раствор удаляют и каждую лунку промывают независимо три раза с использованием 350 мкл буфера для промывания (0,010 М фосфат и 0,15 М NaCl, 0,05% Tween 20 pH 7,2).

Калибровочные стандарты и образцы разбавляют соответствующим образом в Трис-буфере, содержащем цитрат (0,010 М Трис; 0,15 М NaCl, 0,050 М цитрат, 0,1% об./об. Tween 20, рН 8,6), контроли разбавляют Трис-буфером с белком-носителем (0,010 М Трис, 0,15 М NaCl, 0,1% об./об. Tween 20, 1% BSA, рН 8,0). 100 мкл каждого из калибровочных стандартов, контролей и образцов вносят в Nunc-планшет, сверху планшет заклеивают (с использованием "plate sealer") и планшет инкубируют в течение ночи при температуре от 1 до 9°С.

На 3-й день из лунок удаляют раствор и планшет промывают 3 раза таким образом, как описано выше, с использованием PBS-буфера для промывания, и для обнаружения комплекса антиген-антитело добавляют меченое биотином антитело ProS-1-F18. Раствор меченого биотином антитела ProS-1-F18 разбавляют TBS (0,010 М Трис; 0,15 М NaCl, 0,1% Tween 20 рН 8,6) в соотношении 1:1000 и в каждую лунку добавляют по 100 мкл этого раствора, сверху планшет заклеивают (с использованием "plate sealer") и планшет инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Раствор удаляют и планшет промывают 3 раза таким образом, как описано выше, с использованием 350 мкл PBS-буфера для промывания.

Вносят 100 мкл раствора конъюгата пероксидаза хрена - авидин D, разбавленного TBS (0,010 М Трис; 0,15 М NaCl, 0,1% Tween 20 рН 8,6) в соотношении 1:10000, сверху планшет заклеивают (с использованием "plate sealer") и планшет инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет промывают 3 раза PBS-буфером для промывания и в конце добавляют 100 мкл субстрата ТМВ (тетраметилбензидина). Планшет инкубируют в темноте 10 минут при комнатной температуре, для прекращения реакции добавляют 100 мкл 2 М фосфорной кислоты и измеряют поглощение при 450 нм с использованием в качестве контроля 620 нм.

Определение содержания белка S хомяка, ELISA с использованием поликлональных антител

Содержание белка S хомяка определяли с помощью сэндвич-ELISA на основе поликлональных антител.

Покрытие первичными антителами: 96-луночный микропланшет Nunc maxisorb покрывали поликлональным антителом Rb-α-Hu Protein S (Rb-α-белок S человека) (Dakocytomation code nr. A0384). Раствор антитела, концентрация белка в котором составляла 41 мг/мл, разбавляли буфером для сенсибилизации поверхностей (бикарбонатный буфер, рН 9,6; 3,03 г Na₂CO₃; 5,98 г NaHCO₃; вода до 1 л) до концентрации 5,0 мкг/мл (соответствующей разбавлению 1:820). В каждую лунку, за исключением лунок А1 и А2, которые использовали в качестве контролей, добавляли по 100 мкл этого раствора. Планшет инкубировали в течение ночи при 4°С.

На следующее утро раствор удаляли и планшет промывали 3 раза (350 мкл) буфером для промывания (Tween/PBS). Затем планшет (за исключением лунок А1 и А2) блокировали с использованием буфера для разбавления (BSA/Tween/PBS). Для выполнения блокирования заклеенный планшет выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем его промывали 3 раза (350 мкл) буфером для промывания (Буфер для промывания (PBS/Tween, pH 7,4); 16,0 г NaCl; 0,40 г KH₂PO₄; 2,30 г Nа₂НРО₄; 0,40 г KCl; 1 мл Tween 20; вода до 2 л).

Образцы, контроли и стандарты: стандарт белка S, имеющий концентрацию 1120 мкг/мл, разбавляли буфером для разбавления (Буфер для разбавления (BSA/Tween/PBS): бычий сывороточный альбумин (Sigma, A-7030) - 0,5 г; Буфер для промывания до 100 мл) до концентрации 25 нг/мл (1: 44800). Данный стандарт дополнительно разбавляли в две стадии буфером для разбавления с получением самого низкого стандарта с концентрацией 0,78 нг/мл. Позитивный контроль, представляющий собой белок S человека (American Diagnostica, code 443), разбавляли буфером для разбавления до концентрации 2,5 нг/мл. Контроль для конъюгации вводили путем добавления в две лунки только буфера для разбавления. Образцы разбавляли буфером для разбавления с получением концентрации в диапазоне от 1 до 10 нг/мл, которая соответствует линейному участку калибровочной кривой. Все стандарты, контроли и образцы вносили в планшет с дублированием и заклеенный (с использованием "plate sealer") планшет инкубировали в течение ночи при 4°С.

Инкубация с HRP-конъюгированными вторичными антителами: из лунок удаляли раствор и планшет промывали 3 раза таким образом, как описано выше, с использованием Tween/PBS-буфера для промывания. Конъюгат Rb-α-белок S человека - HRP (пероксидаза хрена, Horseradish Peroxidase) (Dakocytomation code nr. P0419) разбавляли в 1000 раз буфером для разбавления и по 100 мкл этого раствора добавляли в каждую лунку, за исключением лунок А1 и А2. Планшет оставляли инкубироваться в шейкере в течение одного часа при комнатной температуре, затем его промывали 3 раза (350 мкл) буфером для промывания.

Детектирование: во все лунки добавляли по 100 мкл раствора субстрата. В раствор субстрата, содержащий 4 таблетки OPD (орто-фенилендиамина), по 2 мг каждая (Dakocytomation code S2045) в 12 мл ультрачистой воды, непосредственно перед использованием добавляли 5 мкл 30% Н₂О₂. Реакцию проводили в течение 15 мин, затем ее останавливали путем добавления 50 мкл 2,5 М H₂SO₄ на лунку. Прочтение планшета выполняли при 492 нм в спектрофотометре для прочтения микропланшетов.

А. Иммуноаффинное использование моноклональных антител против белка S

Пример 1

Удаление белка S выполняют на HiTrap NHS-активированной колонке (Amersham) (объем колонки (CV) - 1 мл) с закрепленными моноклональными антителами (МКА) мыши против белка S хомяка (0,4 мг МКА на мл наполненной колонки). Колонку уравновешивают 10 CV 10 мМ Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl pH 7,5 и загружают 100 CV раствора с электропроводностью 14 мСм/см, содержащего 1,49 мг/мл фактора VIIa и белок S в количестве более 300 млн^-1 (кальций хелатирован цитратом), затем промывают 10 CV 10 мМ Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl pH 7,5. Всю стадию выполняют при скорости потока 60 CV/ч и температуре 5°С. Незначительные следы белка S и фактора VIIa элюируют 20 мМ Nа₂НРО₄, 2 М NaCl pH 7,2 (подтверждают путем ДСН-ПААГ-электрофореза (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия)/окрашивания серебром), затем связанный белок S элюируют 50 мМ цитратом pH 3,0 и небольшую фракцию фактора VIIa (<1% от загруженного количества) десорбируют 50 мМ глицином pH 2,0. Колонку снова уравновешивают 10 CV Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl pH 7,5. Уровень белка S, измеренный во фракции проскока путем ELISA, составляет менее 30 млн^-1, то есть уменьшен по меньшей мере в 10 раз.

Пример 2

Удаление белка S выполняют на HiTrap NHS-активированной колонке (Amersham) (объем колонки (CV) - 1 мл) с закрепленными моноклональными антителами (МКА) мыши против белка S хомяка (0,4 мг МКА на мл наполненной колонки). Колонку уравновешивают 10 CV 15 мМ Трис, 150 мМ NaCl pH 7,5 и загружают 108 CV раствора с электропроводностью 12 мСм/см, содержащего белок S в количестве более 150 млн^-1 (присутствует 10 мМ кальций), затем промывают 10 CV 15 мМ Трис, 150 мМ NaCl pH 7,5. Загрузку и промывку проводят при скорости потока 24 CV/ч, остальную процедуру при 60 CV/ч, и температуре 5°С. Колонку очищают 15 CV 50 мМ цитрата pH 3,0, затем снова уравновешивают 10 CV 15 мМ Трис, 150 мМ NaCl pH 7,5 и в конце очищают 12 CV 50 мМ глицина рН 2,0 и снова уравновешивают 10 CV 15 мМ Трис, 150 мМ NaCl рН 7,5. Уровень белка S, измеренный во фракции проскока путем ELISA, составляет менее 15 млн^-1, то есть уменьшен по меньшей мере в 10 раз.

Пример 3

Удаление белка S выполняли с использованием в качестве сорбента CNBr-активированной сефарозы 4 FF (CNBr-activated Sepharose 4 FF от GE Healthcare) с иммобилизованным моноклональным антителом (МКА) мыши против белка S хомяка (0,8 мг МКА против белка S на мл сорбента). Колонку (1 мл) уравновешивали 10 CV 75 мМ Трис, 30 мМ три-Nа-цитрата рН 7,5 и загружали 32 CV раствора с содержанием белка S 665 нг/мл ≈ 485 нг/мг rFVIIa, затем промывали 20 CV 75 мМ Трис, 30 мМ три-Nа-цитрата рН 7,5. Колонку регенерировали 10 CV 50 мМ глицина рН 2,0 и снова уравновешивали 8 CV 75 мМ Трис, 30 мМ три-Na-цитрата рН 7,5. Уровень белка S, измеренный во фракции проскока путем ELISA, составлял 2,6 нг/мл ≈ 3 нг/мг rFVIIa, то есть был уменьшен по меньшей мере в 160 раз. Загрузку и промывку выполняли при скорости потока 7,2 CV/ч, остальную процедуру при 40 CV/ч. Температуру поддерживали на уровне 5°С.

Пример 4

В качестве альтернативы колонке, содержащей слой наполнителя, удаление белка S выполняли на эпокси-активированном мембранном модуле Sartorius (объем мембраны = 2,1 мл) с иммобилизованным моноклональным антителом (МКА) мыши против белка S хомяка (1 мг МКА против белка S на мембранный модуль). Мембрану уравновешивали 10 MV (объемами мембраны) 75 мМ Трис, 30 мМ три-Nа-цитрата рН 7,5 и загружали 14 MV раствора с содержанием белка S 683 нг/мл = 502 нг/мг rFVIIa, затем промывали 8 MV 75 мМ Трис, 30 мМ три-Nа-цитрата рН 7,5. Мембрану регенерировали 10 MV 50 мМ глицина рН 2,0 и снова уравновешивали 8 MV 75 мМ Трис, 30 мМ три-Nа-цитрата рН 7,5. Уровень белка S, измеренный во фракции проскока путем ELISA, составлял 9,1 нг/мл = 8 нг/мг rFVIIa, то есть был уменьшен по меньшей мере в 62 раза. Методику очистки на мембране выполняли при скорости потока 143 MV/ч и температуре 5°С.

Пример 5: Очистка FIX раствора

Удаление белка S выполняют на колонке NHS-активированной сефарозы FF (NHS-activated Sepharose FF column, Amersham) (объем колонки (CV) - 0,9 мл) с закрепленными моноклональными антителами (МКА) мыши против белка S хомяка (0,8 мг МКА на мл наполненной колонки). Колонку уравновешивают 10 CV 15 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7,5. BeneFIX (1000 IE; Batch no. LE 07D002AF) суспендировали в 10 мл воды, как описано в сопровождающей инструкции. На колонку загружали 5 мл данного раствора, содержащего приблизительно 2 мг FIX. Содержание белка S, измеренное путем моноклонального ELISA, составляло 230 нг/мл, в целом приблизительно 1150 нг белка S. Колонку промывали 10 CV уравновешивающего буфера и элюировали 15 мМ Трис, 2 М NaCl, pH 7,5. FIX был найден во фракциях, полученных при промывке и элюции. Содержание белка S, измеренное с помощью моноклонального ELISA, составляло 26 и 52 нг во фракциях, полученных при промывке и элюции соответственно.

Б. Анионообменная хроматография

Пример 6 - Выполнение анионообменной хроматографии при pH 8,6

Анионообменную хроматографию выполняли на колонке (1 см (внутренний диаметр) × 1,3 см (длина) = 1,0 мл (объем колонки (CV))), наполненной Amersham Q-Sepharose FF и уравновешенной 5 CV 10 мМ глицилглицина, 175 мМ NaCl, pH 8,6. Загружали 35 мл раствора, содержащего белок S в количестве более 300 млн^-1. Колонку промывали 7 CV 10 мМ глицилглицина, 175 мМ NaCl и 4 CV 10 мМ глицилглицина, 50 мМ NaCl. Элюцию выполняли с использованием линейного градиента (20 CV) 0-15 мМ СаСl₂, забуференного глицилглицином, содержащим 50 мМ NaCl. Очистку выполняли при скорости потока 40 CV/ч и при температуре 5°С. Уровень белка S, содержащегося в пуле, составлял менее 30 млн^-1, то есть был уменьшен по меньшей мере в 10 раз.

Пример 7 - Выполнение анионообменной хроматографии при pH 8,6 для очистки FIX-раствора с использованием NaCl-элюции

Анионообменную хроматографию выполняли на колонке (0,5 см (внутренний диаметр) × 5 см (длина) = 1,0 мл (объем колонки (CV))), наполненной Amersham Q-Sepharose FF и уравновешенной 10 CV 10 мМ Трис, 175 мМ NaCl, pH 8,6. BeneFIX (1000 IE; Batch no. LE 07D051AD) суспендировали в 10 мл воды, как описано в сопровождающей инструкции. 3 мл данного раствора, содержащего приблизительно 1,2 мг FIX, загружали на колонку. Содержание белка S в загружаемом растворе, измеренное путем поликлонального ELISA, составляло 280 нг/мл, в целом 840 нг. Колонку промывали 7 CV уравновешивающего буфера с последующим промыванием 3 CV 15 мМ Трис, 50 мМ NaCl, pH 8,6. Затем колонку промывали этим же буфером для промывания с увеличением концентрации СаСl₂ (3-5-7-9 мМ) в течение изократических стадий по 5 CV, с последующим промыванием 10 CV 15 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 15 мМ СаСl₂. Элюцию FIX вели 10 мМ Трис, 1 М NaCl. ДСН-ПААГ-электрофорез показывал слабую зону в последней фракции, полученной при промывании буфером, содержащим 15 мМ СаСl₂.

Количество белка S во фракции, полученной при элюции, измеренное путем поликлонального ELISA, составляло менее 1,5 нг/мл или менее 7,5 нг.

Пример 8 - Выполнение анионообменной хроматографии при pH 8,0 для очистки FVII-полипептида, содержащего аминокислотные замены P10Q и К32Е

Анионообменную хроматографию выполняли на колонке (1 см (внутренний диаметр) × 3,2 см (длина) = 2,5 мл (объем колонки (CV))), наполненной Amersham Q-Sepharose FF и уравновешенной 10 CV 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl, pH 8. К 150 мл культурального супернатанта, содержащего FVII-вариант с мутациями P10Q, К32Е, добавляли 2,2 мл раствора 0,5 М ЭДТА. Электропроводность регулировали путем добавления 260 мл WFI (воды для инъекций). Содержание белка S, измеренное путем ELISA, составляло 284 нг/мл или в целом 97 микрограммов. Колонку промывали 10 CV 10 мМ Трис, 175 мМ NaCl, pH 8, с последующим промыванием уравновешивающим буфером. Элюцию вели 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 35 мМ СаСl₂, pH 8. Содержание белка S, измеренное путем поликлонального ELISA, в элюционном пуле составляло 18 мкг. Очистку выполняли при скорости потока 24 CV/ч и при комнатной температуре.

Пример 9 - Выполнение анионообменной хроматографии при pH 6,0 с использованием элюции градиентом MgCl₂

Анионообменную хроматографию выполняли на колонке (1 см (внутренний диаметр) × 3,2 см (длина) = 2,5 мл (объем колонки (CV))), наполненной Amersham Q-Sepharose FF и уравновешенной 10 CV 10 мМ гистидина, 175 мМ NaCl, pH 6. На колонку загружали 8 мл раствора, содержащего 1,6 мг/мл FVII-полипептида. Содержание белка S, измеренное путем ELISA, составляло 360 нг/мл или в целом 2900 нг. Колонку промывали 10 CV уравновешивающего буфера с последующим промыванием 5 CV буфера для промывания (10 мМ гистидин, 50 мМ NaCl, pH 6). Элюцию вели градиентом (буфер для промывания) - (10 мМ гистидин, 50 мМ MgCl₂, pH 6). Содержание белка S, измеренное путем поликлонального ELISA, в элюционном пуле составляло 790 нг. Очистку выполняли при скорости потока 24 CV/ч и при 5°С.

Пример 10 - Выполнение анионообменной хроматографии при рН 9,0

Анионообменную хроматографию выполняли при рН 9,0 на колонке (0,5 см (внутренний диаметр) × 5,5 см (длина) = 1,0 мл (объем колонки (CV))), наполненной Amersham Source 30Q и уравновешенной 10 CV 10 мМ Трис, 2 мМ СаСl₂. Загружали 8 мл раствора, содержащего 1 мг/мл FVII и белок S в количестве более 10 млн^-1. Колонку промывали 5 CV 10 мМ Трис, 2 мМ СаСl₂. Элюцию выполняли с использованием линейного градиента (50 CV) 0-600 мМ NaCl, забуференного Трис, содержащим 2 мМ СаСl₂. Уровень белка S в собранных фракциях оценивали с использованием ELISA белка S. Белок S был элюирован на переднем фронте основного пика, который содержал >99% FVII. Очистку выполняли при скорости потока 60 CV/ч и при температуре 5°С.

В. Хроматография гидрофобного взаимодействия

Пример 11 - Выполнение хроматографии гидрофобного взаимодействия

Хроматографию гидрофобного взаимодействия выполняли при рН 6,0 на колонке (2,6 см (внутренний диаметр) × 8,5 см (длина) = 45,1 мл (объем колонки (CV))), наполненной Toso Haas TSK-Gel phenyl 5 PW и уравновешенной 10 CV 10 мМ цитрата, 17 М NН₄-ацетата. Для загрузки использовали 215 мл раствора, содержащего приблизительно 700 мкг/мл FVII и белок S в количестве более 200 млн^-1. К загружаемому раствору добавляли 1,7 М NH₄-ацетат. Колонку промывали 5 CV 10 мМ цитрата, 1,7 М NН₄-ацетата. Элюцию выполняли с использованием 20 CV линейного градиента 1,7-0 М NН₄-ацетата, забуференного цитратом. Уровень белка S, содержащегося в пуле, составлял менее 100 млн^-1, то есть был уменьшен по меньшей мере в 2 раза. Очистку выполняли при скорости потока 20 CV/ч и при температуре 5°С.

Пример 12 - Выполнение HIC в присутствии Са²⁺

Хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC, hydrophobic interaction chromatography) выполняют на колонке (1 см (внутренний диаметр) × 7 см (длина) = 5,5 мл), наполненной смолой Toyopearl MD-G Butyl. Колонку уравновешивают 10 CV 35 мМ СаСl₂, 1,5 М NaCl, 10 мМ гистидина, рН 6,0. После уравновешивания на колонку загружают 42 мл раствора, содержащего 0,1 мг/мл FVIIa. После загрузки колонку промывают 10 CV уравновешивающего буфера. Связанный FVII(a) элюируют с использованием 20 мМ ЭДТА, 50 мМ гистидина, рН 6,0. Собирают пул, содержащий FVII(a) с уменьшенным содержанием белка S.

Г-1. Иммуноаффинное использование Са²⁺-зависимых моноклональных антител против FVIIa

Пример 13 - Выполнение иммуноаффинного захвата при рН 6

Порцию супернатанта культуры СНО К1 объемом 1500 мл стабилизировали путем добавления кальция до концентрации 10 мМ Са²⁺ и путем добавления гистидинового буфера до концентрации 10 мМ, доводили с помощью HCl до рН 6,0 и фильтровали через 0,45-микронный фильтр с глухим концом. Стабилизированный культуральный супернатант загружали на колонку (1,6 см (внутренний диаметр) × 10 см (длина) = 20 мл (CV)), наполненную Pharmacia Sepharose 4B с иммобилизованным Са²⁺-зависимым моноклональным антителом против FVIIa. Перед загрузкой колонку уравновешивали 5 CV 10 мМ СаСl₂, 10 мМ гистидина, рН 6,0. После загрузки колонку промывали 10 CV 2 М NaCl, 10 мМ CaCl₂, 10 мМ гистидина, рН 6,0. Связанный FVII(a) элюировали 10 CV 30 мМ ЭДТА, 50 мМ гистидина, рН 6,0. Пул, содержащий FVII(a), собирали в диапазоне от приблизительно 0,1 AU (Absorbance Unit) (280 нм) на переднем фронте основного пика до приблизительно 0,1 AU (280 нм) на заднем фронте. В ходе всей очистки использовали скорость потока 12 CV/ч и температуру 5°. Уровни белка S определяли путем ELISA белка S с использованием поликлонального антитела против huPS.

Г-2. Аффинная очистка с использованием иммобилизованных лигандов

Пример 14 - Аффинная очистка FVII-аналога с использованием иммобилизованных аналогов бензамидина

К NHS-активированному носителю "NHS activated HiTrap" (GE Healthcare) (1 мл (объем колонки (CV))) присоединяли аналог бензамидина (Формула 1 или Формула 2). Колонку уравновешивали 5 CV 50 мМ HEPES (гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты), 100 мМ NaCl, 5 мМ СаСl₂, 0,01% Tween 80 рН 7,5. Колонку загружали 0,5 CV раствора, содержащего FVII-аналог и 20 мг/л белка S, при рН 7,5. После загрузки колонку промывали 6 CV уравновешивающего буфера. Элюцию вели 5 CV 50 мМ НАс, 100 мМ NaCl, 5 мМ СаСl₂, 0,01% Tween 80, рН 4,4 и 4 CV 50 мМ Gly-HCl, 100 мМ NaCl, 5 мМ СаСl₂, 0,01% Tween 80, рН 3,0. Сразу после элюции рН элюата доводили до рН 6. Скорость потока составляла 30 CV в час, и очистку выполняли при комнатной температуре. Большая часть белка S не связывалась со смолой и была обнаружена во фракциях проскока и промывки. Противоположную картину наблюдали для FVII, когда большая часть белка связывалась со смолой и была элюирована при уменьшении рН. Содержание белка S во фракции элюата, измеренное путем моноклонального ELISA, составляло приблизительно 150 нг и 180 нг при использовании колонок с иммобилизованным соединением формулы 1 или формулы 2 соответственно.

Формула 1:

Формула 2:

Пример 15. Аффинная очистка белка S с использованием иммобилизованных триазиновых лигандов (режим проскока)

Очистку выполняли на колонке (1 см (внутренний диаметр) × 6,2 см (длина) = 5 мл (объем колонки (CV))), наполненной ACL 5/5 (ProMetic) и уравновешенной 10 CV 20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 5 мМ СаСl₂, рН 8,5. Загружали 43 мл раствора, содержащего более 40000 млн^-1 белка S. Колонку промывали 2 CV 20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 5 мМ СаСl₂, рН 8,5. Элюцию выполняли с использованием 40 CV линейного градиента (20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 5 мМ СаСl₂, рН 8,5) - (20 мМ Трис, 1 М NaCl, 5 мМ СаСl₂, рН 8,5). Собирали пул, содержащий FVII, с получением элюата, в котором уровень белка S составлял менее 7000 млн^-1 белка S.

Д. Катионообменная хроматография

Пример 16 - Катионообменник Obelix CIE, Amersham; номер по каталогу 11-0010

Культуральную среду загружали на катионообменную смолу. Колонку уравновешивали 30 мМ NaAc, рН 7,0. Скорость потока составляла 48 CV/ч при комнатной температуре. После загрузки смолу промывали уравновешивающим буфером с последующим промыванием 1 М NaAc, рН 7 (5-10 объемов колонки). Снова промывали 10 объемами колонки уравновешивающего буфера. Продукт элюировали 30 мМ NaAc, 2 М NaCl, рН 6,3 или Трис-буфером с более высоким рН и большей концентрацией NaCl. Пул собирали с помощью УФ-детектора и немедленно охлаждали. Белок S был элюирован на стадиях промывки. После использования колонку очищают 1 М NaOH.

Альтернативно, в наносимый образец добавляли NaAc до 1 М, рН 7, и промывали таким же буфером. В качестве уравновешивающего буфера использовали 1 М NaAc рН 7,0. После нанесения несвязанное вещество вымывали уравновешивающим буфером. Промывку вели 10 CV 30 мМ NaAc рН 6,3, а продукт элюировали 30 мМ NaAc, 2 М NaCl, рН 6,3 или Трис буфером с более высоким рН и большей концентрацией NaCl. Пул собирали с помощью УФ-детектора. Белок S элюирован на стадиях промывки.

Данная смола также использовалась следующим образом: смолу уравновешивали 30 мМ NaAc, рН 6,0, и наносили продукт (электропроводность ниже 10 мСм/см). Несвязанные вещества вымывали уравновешивающим буфером и элюцию вели возрастающим градиентом NaCl. Скорость потока составляла 30 CV/ч при комнатной температуре. Пул собирали с помощью УФ-детектора. Белок S был элюирован до выхода продукта.

Пример 17 - SP-Sepharose HP, Amersham; номер по каталогу 17-1087

Колонку уравновешивали 50 мМ MES (2-морфолиноэтансульфокислотой), 50 мМ NaCl, 25 мМ СаСl₂, рН 5,75. Электропроводность наносимого образца доводили до значения менее 10 мСм/см. Несвязанное вещество вымывали уравновешивающим буфером и затем продукт элюировали путем увеличения концентрации NaCl. Скорость потока составляла 48 объемов колонки в час, и очистку выполняли в холодной комнате.

Белок S элюирован во фракциях проскока. После использования колонку очищали 1 М NaOH.

Пример 18 - Toyopearl SP 650 M

Удаление белка S из смеси, содержащей приблизительно 25 мг/л FVII и 25 мг/л белка S, выполняли на колонке Toyopearl SP 650 М (Tosoh Bioscience) объемом 1 мл (0,5 см (внутренний диаметр) × 5 см (высота слоя наполнителя)). Колонку уравновешивали 10 объемами колонки (CV) буферного раствора 10 мМ гистидина, рН 6, и на колонку загружали 0,5 мл смеси, содержащей FVII и белок S. Колонку промывали/элюировали 1 CV буферного раствора 10 мМ гистидина, рН 6 с последующей промывкой/элюцией градиентом концентрации 0-1 М NaCl в буферном растворе 10 мМ гистидина, рН 6. Всю стадию очистки выполняли при скорости потока 48 CV/ч при комнатной температуре. Белок S был элюирован при промывании, а FVII - в ходе градиентной элюции. Разделение белка S и FVII обнаруживали и подтверждали путем анализа с использованием стандартного нативного ДСН-ПААГ-электрофореза и окрашивания серебром и путем параллельного проведения очистки загруженного FVII стандарта. Колонку уравновешивали 3 CV 0,1 М NaOH, затем 10 CV 1,5 М NaCl + 25 мМ гистидинового буфера, рН 6.

Пример 19 - CM Sepharose FF

Удаление белка S из смеси, содержащей приблизительно 25 мг/л FVII и 25 мг/л белка S, выполняли на колонке CM Sepharose FF (GE Health Care) объемом 1 мл (0,5 см (внутренний диаметр) × 5 см (высота слоя наполнителя)). Колонку уравновешивали 10 объемами колонки (CV) буферного раствора 40 мМ гистидина, рН 6, и на колонку загружали 0,5 мл смеси, содержащей FVII и белок S. Колонку промывали/элюировали 1 CV буферного раствора 40 мМ гистидина, рН 6 с последующей промывкой/элюцией градиентом концентрации 0-0,35 М NaCl в буферном растворе 40 мМ гистидина, рН 6. Всю стадию очистки выполняли при скорости потока 48 CV/час при комнатной температуре. Белок S был элюирован при промывании, a FVII - в ходе градиентной элюции. Разделение белка S и FVII обнаруживали и подтверждали путем анализа стандартно, нативным ДСН-ПААГ-электрофорезом с окрашиванием серебром. Колонку уравновешивали 3 CV 0,1 М NaOH, затем 10 CV 1,5 М NaCl + 25 мМ гистидинового буфера, рН 6.

Пример 20 - CM Sepharose FF

Удаление белка S из смеси, содержащей приблизительно 25 мг/л FVII и 25 мг/л белка S, выполняли на колонке CM Sepharose FF (GE Health Care) объемом 1 мл (0,5 см (внутренний диаметр) × 5 см (высота слоя наполнителя)). Колонку уравновешивали 10 объемами колонки (CV) буферного раствора 10 мМ гистидина, рН 6, и на колонку загружали 0,5 мл смеси, содержащей FVII и белок S. Колонку промывали/элюировали 1 CV буферного раствора 10 мМ гистидина, рН 6 с последующей промывкой/элюцией градиентом концентрации 0-0,35 М NaCl в буферном растворе 10 мМ гистидина, рН 6. Всю стадию очистки выполняли при скорости потока 48 CV/час при комнатной температуре. Белок S был элюирован при промывании, а FVII - в течение градиентной элюции. Разделение белка S и FVII обнаруживали и подтверждали путем анализа стандартно, нативным ДСН-ПААГ-электрофорезом с окрашиванием серебром. Колонку уравновешивали 3 CV 0,1 М NaOH, затем 10 CV 1,5 М NaCl + 25 мМ гистидинового буфера, рН 6.

Пример 21 - Toyopearl SP 650 М

Удаление белка S из смеси, содержащей приблизительно 25 мг/л FVII и 25 мг/л белка S, выполняли на колонке Toyopearl SP 650 М (Tosoh Bioscience) объемом 1 мл (0,5 см (внутренний диаметр) × 5 см (высота слоя наполнителя)). Колонку уравновешивали 10 объемами колонки (CV) буферного раствора 10 мМ гистидина, рН 6, и на колонку загружали 0,5 мл смеси, содержащей FVII и белок S. Колонку промывали/элюировали 1 CV буферного раствора 10 мМ гистидина, рН 6 с последующей промывкой/элюцией градиентом концентрации 0-0,35 М NaCl в буферном растворе 10 мМ гистидина, рН 6. Всю стадию очистки выполняли при скорости потока 48 CV/час при комнатной температуре. Белок S был элюирован при промывании, a FVII - в течение градиентной элюции. Разделение белка S и FVII обнаруживали и подтверждали путем анализа стандартно, нативным ДСН-ПААГ-электрофорезом с окрашиванием серебром. Колонку уравновешивали 3 CV 0,1 М NaOH, затем 10 CV 1,5 М NaCl + 25 мМ гистидинового буфера, рН 6.

Пример 22 - Capto MMC

Хроматографическим сорбентом наполняли колонку диаметром 1,6 см и высотой слоя наполнителя 10 см. Очистку проводили при скорости потока 20 объемов колонки в час, при температуре приблизительно 5°С. Колонку уравновешивали 150 мМ NaCl, 5 мМ СаСl₂ и 20 мМ гистидином, рН 6,0. В культуральный супернатант, содержащий FVII, добавляли СаСl₂ и гистидин до концентрации 5 и 10 мМ соответственно, супернатант подводили до рН 6,0 и загружали на колонку. В конкретном случае загрузка колонки составляла приблизительно 1,3 мг FVII на мл наполнителя. После загрузки колонку промывали уравновешивающим буфером, затем 0,8 М NaCl, 10 мМ СаСl₂, 20 мМ гистидином, рН 6,6, затем уравновешивающим буфером, затем 0,5 М NaCl, 25 мМ гистидином, рН 5,8. FVII элюировали с колонки 0,5 М NaCl, 25 мМ гистидином, рН 6,8. Найдено, что белком S обогащена фракция проскока при загрузке и фракция промывания 0,8 М NaCl, 10 мМ СаСl₂, 20 мМ гистидином, рН 6,6.

Е. Хроматография с использованием гидроксиапатита

Пример 23 - Колонка с гидроксиапатитом, BioRad, номер по каталогу 157-0085, тип I, 80 мкм

Подводят рН наносимого образца и затем его наносят прямо на заранее уравновешенную смолу. Скорость потока составляет 42 объема колонки в час при 4-20°С. Промывают уравновешивающим буфером (водой) до исходного уровня и затем продукт элюируют возрастающим (до 400 мМ) градиентом концентрации К₂НРO₄/КН₂РO₄ буфера при рН 6,2. Пул собирают с помощью УФ-детектора и немедленно охлаждают.

Белок S элюирован после выхода продукта. После использования колонку очищают 1 М NaOH.

Ж. Аффинная хроматография на гепарин

Пример 24 - Toyopearl Heparin 650 M

Удаление белка S из смеси, содержащей приблизительно 25 мг/л FVII и 25 мг/л белка S, выполняли на колонке Toyopearl Heparin 650 M (Tosoh Bioscience) объемом 1 мл (0,5 см (внутренний диаметр) × 5 см (высота слоя наполнителя)). Колонку уравновешивали 10 объемами колонки (CV) буферного раствора 10 мМ гистидина, рН 6, и на колонку загружали 0,5 мл смеси, содержащей FVII и белок S. Колонку промывали/элюировали 1 CV буферного раствора 10 мМ гистидина, рН 6 с последующей промывкой/элюцией градиентом концентрации 0-0,35 M NaCl в буферном растворе 10 мМ гистидина, рН 6. Всю стадию очистки выполняли при скорости потока 48 CV/час при комнатной температуре. Белок S был элюирован раньше FVII в ходе градиентной элюции. Разделение белка S и FVII обнаруживали и подтверждали путем анализа стандартно, нативным ДСН-ПААГ-электрофорезом с окрашиванием серебром. Колонку уравновешивали 3 CV 0,1 M NaOH, затем 10 CV 1,5 M NaCl + 25 мМ гистидинового буфера, рН 6.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению высокоочищенных композиций рекомбинантных витамин К-зависимых белков, и может быть использовано для снижения примесей белка S в этих композициях. Способ предусматривает проведение стадии контактирования исходной композиции, содержащей рекомбинантный витамин К-зависимый белок, продуцируемый в условиях культивирования клеток, с твердофазным веществом, которое способно связывать этот витамин К-зависимый белок, и сбора получающейся вторичной композиции, содержащей этот витамин К-зависимый белок. После этого проводят контактирование вторичной композиции, полученной на предыдущей стадии, с твердофазным веществом, несущим аффинные лиганды, которое способно связывать белок S, в то время как рекомбинантный витамин К-зависимый белок не связывается с указанной твердой фазой и проскакивает хроматографическую колонку; и сбор получающейся композиции, содержащей рекомбинантный витамин К-зависимый белок. Изобретение позволяет уменьшить уровень белка S по меньшей мере в 2 раза. 2 н. и 28 з.п. ф-лы, 24 пр.

1. Способ уменьшения содержания белка S в композиции, содержащей представляющий интерес рекомбинантный витамин К-зависимый белок, продуцируемый в условиях культивирования клеток, включающий по меньшей мере стадии
(А) контактирования исходной композиции с твердофазным веществом, которое способно связывать этот представляющий интерес витамин К-зависимый белок, и сбора получающейся вторичной композиции, содержащей этот представляющий интерес витамин К-зависимый белок, и (Б) контактирования вторичной композиции, полученной на стадии (А), с твердофазным веществом, несущим аффинные лиганды, которое способно связывать белок S, в то время как представляющий интерес рекомбинантный витамин К-зависимый белок не связывается с указанной твердой фазой и проскакивает хроматографическую колонку; и сбора получающейся композиции, содержащей представляющий интерес рекомбинантный витамин К-зависимый белок;
в результате чего уровень белка S, выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен в указанной композиции, полученной на стадии (Б), по сравнению с указанной исходной композицией по меньшей мере в 2 раза, например по меньшей мере в 5 раз.

2. Способ по п.1, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX.

3. Способ по п.1, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора X.

4. Способ по п.1, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.

5. Способ по п.4, где представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой человеческий фактор VIIa дикого типа.

6. Способ по п.4, где полипептид фактора VII содержит аминокислотную замену, выбранную из P10Q и К32Е.

7. Способ по п.1, где указанный белок S представляет собой белок S хомяка.

8. Способ по п.1, где уровень белка S, выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 25 раз, или по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 250 раз, или по меньшей мере в 500 раз, или по меньшей мере в 750 раз, или по меньшей мере в 1000 раз, или по меньшей мере в 2000 раз, или по меньшей мере в 5000 раз.

9. Способ по п.1, где уровень контамината белка S в неочищенном супернатанте клеточной культуры составляет по меньшей мере 500 млн^-1.

10. Способ по п.1, где общее содержание белков-контаминантов в получающейся очищенной композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, составляет самое большее 100 млн^-1, например самое большее 50 млн^-1, например самое большее 10 млн^-1, например самое большее 5 млн^-1, например самое большее 2 млн^-1, например самое большее 1 млн^-1.

11. Способ по п.1, где твердофазное вещество со стадии (Б) несет моноклональные антитела против белка S.

12. Способ по п.1, где твердофазное вещество со стадии (А) несет аффинные лиганды для представляющего интерес витамин К-зависимого белка.

13. Способ по п.12, где твердофазное вещество со стадии (A) несет моноклональные антитела против представляющего интерес витамин К-зависимого белка или его аналога.

14. Способ по п.12, где твердофазное вещество представляет собой триазиновый лиганд, обладающий аффинностью к представляющему интерес витамин К-зависимому белку или его аналогу.

15. Способ по п.12, где твердофазное вещество со стадии (А) несет ингибитор указанного представляющего интерес витамин К-зависимого белка.

16. Способ по п.15, где ингибитор указанного представляющего интерес витамин К-зависимого белка представляет собой ингибитор бензамидин- или гуанидин-типа, такой как ингибиторы, содержащие мотив -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R², где
Z¹ и Z² независимо выбраны из группы, состоящей из -O-, -S-, -NR^H- и одинарной связи, где R^H выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4-алкила, арила и арилметила, и R¹ и R² независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, возможно замещенного С_1-6-алкила, возможно замещенного C_2-6-алкенила, возможно замещенного арила, возможно замещенного гетероциклила, или
Z² и R² являются такими, как определено выше, и -C=N-Z¹-R¹ образует часть гетероциклического кольца, или
Z¹ и R¹ являются такими, как определено выше, и -C-NH-Z²-R² образует часть гетероциклического кольца, или
-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R² образует гетероциклическое кольцо, где -Z¹-R¹-R²-Z²- представляет собой бирадикал.

17. Способ по пп.1-10, где твердофазное вещество со стадии (А) представляет собой вещество хроматографической матрицы.

18. Способ по п.17, где твердофазное вещество со стадии (А) представляет собой анионообменное вещество.

19. Способ по п.18, где элюцию с анионообменного вещества выполняют путем увеличения концентрации соли кальция или соли магния, такой как CaCl₂ или MgCl₂.

20. Способ по п.17, где твердофазное вещество со стадии (А) представляет собой гидроксиапатит.

21. Способ по п.17, где твердофазное вещество со стадии (А) представляет собой гидрофобное твердофазное вещество.

22. Способ по п.1, включающий стадию (1) контактирования супернатанта клеточной культуры с твердофазным веществом, несущим моноклональные антитела против представляющего интерес витамин К-зависимого белка или его аналога, (2) возможно промывания указанного твердофазного вещества и (3) элюирования представляющего интерес витамин К-зависимого белка с указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить получающуюся композицию, где уровень белка S, выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 5 раз.

23. Способ по п.22 уменьшения содержания белка S в супернатанте клеточной культуры, содержащем полипептид фактора VII, включающий стадию (1) контактирования супернатанта клеточной культуры с твердофазным веществом, несущим моноклональные антитела против полипептида фактора VII или его аналога, (2) возможно промывания указанного твердофазного вещества и (3) элюирования полипептида фактора VII с указанного твердофазного вещества, с тем чтобы получить получающуюся композицию, где уровень белка S, выраженный в виде миллионных долей относительно полипептида фактора VII, уменьшен по меньшей мере в 100 раз.

24. Композиция, обладающая активностью витамин К-зависимого белка, полученная способом по пп.1-23.

25. Композиция по п.24, где витамин К-зависимый белок был продуцирован в условиях клеточной культуры, и общее содержание белка S составляет не более 100 млн^-1 относительно содержания указанного витамин К-зависимого белка.

26. Композиция по п.24, где витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII, полученный из бессывороточной культуры клеток, не принадлежащих человеку, где общее содержание контаминантов белка S составляет не более 100 млн^-1 относительно содержания полипептида фактора VII.

27. Композиция по п.24, где витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX, полученный из бессывороточной культуры клеток, не принадлежащих человеку, где общее содержание контаминантов белка S составляет не более 100 млн^-1 относительно содержания полипептида фактора IX.

28. Композиция по любому из пп.24-27, где содержание белка S находится в диапазоне 0,01-100 млн^-1, например в диапазоне 0,01-50 млн^-1, например 0,05-25 млн^-1, или 0,05-20 млн^-1, или 0,05-15 млн^-1, или 0,05-10 млн^-1, или 0,05-5 млн^-1.

29. Композиция по пп.24 и 25, где витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX.

30. Композиция по пп.24 и 25, где витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII.