Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к плюрипотентным стволовым клеткам, которые получают из пульпы зуба и обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и остеоциты, а также к способу получения таких плюрипотентных стволовых клеток.
Предшествующий уровень техники
Известно, что стволовые клетки (плюрипотентные стволовые клетки), обладающие способностью дифференцироваться в клетки множества систем, могут быть получены из различных тканей. Мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из костного мозга, являются одними из этих стволовых клеток и обладают способностью дифференцироваться в различные клетки, такие как остеоциты, кардиомиоциты, хондроциты и адипоциты (патентная литература 1–4). Были предприняты попытки применить мезенхимальные стволовые клетки в регенеративной медицине в различных тканях, используя эту способность к дифференцировке. Например, сообщалось о попытках введения мезенхимальных стволовых клеток пациентам с инфарктом миокарда для регенерации миокарда, некротизированного из-за инфаркта миокарда, тем самым улучшая сердечные функции пациентов (Непатентная литература 1).
Известно, что мезенхимальные стволовые клетки можно получить не только из костного мозга, как описано выше, но также из различных тканей, таких как жировая ткань (Патентный документ 5), плацентарная ткань и ткань пуповины (Патентный документ 6).
Что касается того факта, что плюрипотентные стволовые клетки могут быть получены также из зубной ткани, сообщалось, что плюрипотентные стволовые клетки могут быть получены, например, из пульпы зуба (Патентные документы 7-11), зубного фолликула (Патентная литература 12), зубного мешка (Патентный документ 11 и 13), зубного сосочка (Патентный документ 14) и периодонтальной мембраны (Патентный документ 15). Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из тканей зубов, обычно обладают способностью дифференцироваться в адипоциты (Непатентная литература 2–4).
Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из тканей зубов, обычно обладают способностью дифференцироваться в адипоциты (Непатентная литература 2–4). Ткань, полученная при измельчении удаленного зуба, обрабатывается коллагеназой I типа и диспазой (зарегистрированная торговая марка), а скопления клеток удаляются путем пропускания через фильтр для получения суспензии клеток. Затем клетки пролиферируют в планшете для культивирования клеток с использованием среды DMEM, содержащей 20% FBS. Клетки, которые прилипли к внутренней поверхности планшета для культивирования клеток и пролиферировали, обрабатывают трипсином и отслаивают, а отслоившиеся клетки собирают. Собранные таким образом клетки представляют собой плюрипотентные стволовые клетки пульпы зуба. Диспаза - это нейтральная протеаза, полученная из Bacillus polymyxa.
Пульпа зуба представляет собой рыхлую волокнистую соединительную ткань, которая заполняет полость пульпы зуба и делится на пульпу коронки и пульпу корня в зависимости от ее расположения. Кроме того, сообщалось, что плюрипотентные стволовые клетки, полученные из ткани зуба, обычно обладают способностью дифференцироваться в адипоциты (Непатентная литература 2–4), тогда как стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, не дифференцируются в адипоциты (патентная литература 8). То есть существует вероятность того, что существует, по меньшей мере, два типа стволовых клеток, полученных из пульпы зуба, которые отличаются наличием или отсутствием способности дифференцироваться в адипоциты. То есть существует вероятность того, что существует, по меньшей мере, два типа стволовых клеток, полученных из пульпы зуба, которые отличаются наличием или отсутствием способности дифференцироваться в адипоциты. Кроме того, также сообщалось, что плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, обладают свойствами, отличными от свойств мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга, относительно индукции дифференцировки в остеобласты (патентная литература 11).
Ожидается, что плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, будут клинически применимы, поскольку они могут быть использованы в качестве терапевтического агента при неврологических заболеваниях (патентная литература 17).
Список процитированной патентной литературы
Патентная литература 1: Патент США № 5486359 Патентная литература 2: Патент США № 5827740 Патентная литература 3: Патент США № 6835377 Патентная литература 4: Патент США № 6387369 Патентная литература 5: Не прошедший экспертизу патент Японии Публикация № 2004-129549.
Патентная литература 6: публикация нерассмотренного японского патента № 2004-210713.
Патентная литература 7: публикация не прошедшего экспертизу японского патента № 2010-252778.
Патентная литература 8: WO2002/007679.
Патентная литература 9: публикация нерассмотренного японского патента № 2008-507962.
Патентная литература 10: WO2009/072527.
Патентная литература 11: Публикация нерассмотренного японского патента № 2004-201612.
Патентная литература 12: публикация нерассмотренного японского патента № 2009-527223.
Патентная литература 13: публикация нерассмотренного японского патента № 2005-516616.
Патентная литература 14: публикация не прошедшего экспертизу японского патента № 2006-238875.
Патентная литература 15: Публикация нерассмотренного японского патента № 2008-295420.
Патентная литература 16. Публикация нерассмотренного японского патента № 2010-268715.
Патентная литература 17: публикация нерассмотренного японского патента № 2011-219432.
Непатентная литература
Непатентный документ 1: Katritsis DG. et. al., Catheter Cardiovasc Interv. 65(3): 321-9 (2005)
Непатентная литература 2: Gronthos S. et. al., J Dent Res. 81 (8): 531-5 (2002).
Непатентная литература 3: Tirino V. et. al., Stem Cell Rev. 7 (3): 608-15 (2011).
Непатентная литература 4: Vishwanath VR et. al., J Conserv Dent. 16 (5): 423-8 (2013).
Сущность изобретения Техническая проблема
Целью настоящего изобретения является создание нового препарата плюрипотентных стволовых клеток, полученных из пульпы зуба, который можно использовать для лечения инфаркта головного мозга и т.п. и который можно вводить людям. Другой целью настоящего изобретения является обеспечение способа эффективного получения плюрипотентных стволовых клеток, полученных из пульпы зуба, так что плюрипотентные стволовые клетки могут стабильно поставляться на рынок в достаточном количестве. Кроме того, еще одной целью настоящего изобретения является получение клеток в форме, в которой можно поддерживать стабильность, подходящую для распределения или хранения.
Решение проблемы
В исследованиях для вышеописанных объектов авторы настоящего изобретения провели обширные исследования. В результате они нашли способ эффективного получения клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, из ткани пульпы зуба, полученной из удаленных зубов человека, и завершили настоящее изобретение. То есть настоящее изобретение включает следующее.
1. Способ получения клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, включающий стадию (а) гидролиза пульпы зуба протеазой для приготовления суспензии пульпы зуба; стадию (b) культивирования суспензии для пролиферации плюрипотентных стволовых клеток, содержащихся в суспензии; стадию (c) замораживания пролиферированных плюрипотентных стволовых клеток в состоянии, в котором плюрипотентные стволовые клетки суспендированы в первой криоконсервирующей жидкости; стадию (d) размораживания замороженных плюрипотентных стволовых клеток; стадию (е) культивирования размороженных плюрипотентных стволовых клеток в состоянии, в котором плюрипотентные стволовые клетки прикреплены к поверхностям частиц носителя для пролиферации плюрипотентных стволовых клеток на поверхности частиц носителя; стадию (f) приведения частиц носителя в контакт с протеазой для отделения плюрипотентных стволовых клеток, прикрепленных к поверхностям частиц носителя, от частиц носителя; и стадию (g) приготовления суспензии отделенных плюрипотентных стволовых клеток.
2. Способ получения согласно описанному выше 1, в котором тесты качества плюрипотентных стволовых клеток проводят на стадии (c) или (d).
3. Способ получения согласно описанному выше 2, в котором тесты качества выполняются на клетках, фракционированных из клеток перед суспендированием в первой криоконсервирующей жидкости, субкультивированных клетках, которые были фракционированы из клеток перед суспендированием в первой криоконсервирующей жидкости, предварительно замороженных клетках, которые были суспендированы и фракционированы в первой криоконсервирующей жидкости, клетках сразу после оттаивания, которые были фракционированы и заморожены, и/или клетках, полученных фракционированием, замораживанием, оттаиванием и культивированием.
4. Способ получения согласно описанному выше 3, в котором тесты качества выполняются для одного или нескольких из следующих тестов качества от a до j.
Тест качества a, который проверяет, что доля числа клеток, демонстрирующих по существу веретеновидную форму во всех клетках при наблюдении с помощью оптического микроскопа, больше или равна 99%, больше или равна 99,5%, больше или равна до 99,9%, или больше или равна 99,95%,
Тест качества b, который проверяет, что жизнеспособность клетки больше или равна 50%, больше или равна 60%, больше или равна 70%, больше или равна 80%, больше или равна 90%, или больше или равно 95%,
Тест качества c, который подтверждает, что клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45 в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности, или проверяет, что клетки положительны, по меньшей мере, по одному из CD73 и CD90 и отрицательны по CD34 в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности,
Тест качества d, который проверяет, что клетки отрицательны по антигену CD40, CD80, CD86 и MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности, или проверяет, что клетки отрицательны, по меньшей мере, по одному из CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности,
Тест качества е, который проверяет, что клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности, когда клетки стимулируются интерфероном-γ, или проверяет, что, по меньшей мере, любая из клеток, отрицательна по CD40, отрицательна по CD80, отрицательна по CD86 или положительна по антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, когда клетки стимулируются интерфероном-γ,
тест качества f, который проверяет экспрессию клеток простагландин E2 и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), а уровень экспрессии простагландина E2 увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α,
Тест качества g, который подтверждает, что уровень экспрессии аггрекана увеличивается при культивировании клеток в среде, содержащей вещество, которое вызывает дифференцировку в хондроциты,
Тест качества h, который подтверждает, что количество кальция, накопленного в клетках, увеличивается, когда клетки культивируются в среде, содержащей вещество, которое вызывает дифференцировку в остеоциты,
Тест качества i, который подтверждает, что клетки обладают способностью делиться не менее 10, 14 или 15 раз в планшете для культивирования клеток, и
Тест качества j, который проверяет, что среднее время удвоения клеток в планшете для культивирования клеток составляет 96 часов, 84 часа, 72 часа, 48 часов или 36 часов в течение периода тестирования качества i.
5. Способ получения согласно описанному выше 1-4, дополнительно включающий: загрузку суспензии на фильтрующую мембрану для сбора клеток, которые были пропущены на стадии (g).
6. Способ получения согласно описанному выше 5, в котором фильтрующая мембрана имеет диаметр пор от 20 мкм до 80 мкм.
7. Способ получения согласно описанному выше 1-6, в котором пульпу получают из постоянных или временных зубов человека.
8. Способ получения согласно описанному выше 1-7, где протеаза, используемая на стадии (а), включает сериновую протеазу, металлопротеиназу или их смесь.
9. Способ получения согласно описанному выше 1-7, где протеаза, используемая на стадии (а), включает металлопротеиназу.
10. Способ получения согласно описанному выше 1-7, где протеаза, используемая на стадии (а), включает матриксную металлопротеиназу, нейтральную металлопротеиназу или их смесь.
11. Способ получения согласно описанному выше 1-7, где протеаза, используемая на стадии (а), включает коллагеназу и нейтральную металлопротеиназу.
12. Способ получения согласно описанному выше 11, где коллагеназа включает коллагеназу I, коллагеназу II или их смесь.
13. Способ получения в соответствии с описанными выше 10 или 11, где нейтральная металлопротеиназа включает термолизин, диспазу или их смесь.
14. Способ получения согласно описанному выше 1-13, в котором первая жидкость для криоконсервации, используемая на стадии (с), включает бикарбонатный раствор Рингера, сывороточный альбумин человека и DMSO.
15. Способ получения согласно описанному выше 1-14, в котором частицы носителя, используемые на стадии (е), имеют по существу сферическую форму, имеющую диаметр от 80 до 300 мкм в набухшем состоянии.
16. Способ получения согласно описанному выше 15, в котором частицы носителя представляют собой пористые частицы носителя, имеющие поры диаметром от 3 до 40 мкм, которые открываются к поверхностям частиц носителя в набухшем состоянии.
17. Способ получения согласно описанному выше 1-16, в котором частицы носителя содержат желатин.
18. Способ получения согласно описанному выше 1-17, в котором протеаза, используемая на стадии (f), включает сериновую протеазу, металлопротеазу или их смесь.
19. Способ получения согласно описанному выше 1-17, в котором протеаза, используемая на стадии (f), включает трипсин.
20. Способ получения по любому из описанных выше 1-19, дополнительно включающий стадию (h) замораживания суспензии, полученной на стадии (g), в состоянии, в котором суспензия находится во второй криоконсервирующей жидкости.
21. Способ получения согласно описанному выше 20, в котором вторая жидкость для криоконсервации, используемая на стадии (h), включает раствор Рингера бикарбоната, сывороточный альбумин человека и DMSO.
22. Способ получения согласно описанному выше с 1 по 19, в котором тесты качества плюрипотентных стволовых клеток проводят на стадии (g).
23. Способ получения в соответствии с описанными выше 20 или 21, в котором тесты качества плюрипотентных стволовых клеток проводят на стадии (g) или (h).
24. Способ получения в соответствии с описанными выше 22 или 23, в котором тесты качества проводят на клетках, фракционированных из клеток перед суспендированием во второй криоконсервирующей жидкости, субкультивированных клетках, которые были фракционированы из клеток перед суспендированием во второй криоконсервирующей жидкости, предварительно-замороженных клетках, которые были суспендированы во второй криоконсервирующей жидкости и фракционированы, клетках сразу после оттаивания, которые были фракционированы и заморожены, и/или клетках, полученных фракционированием, замораживанием, оттаиванием и культивированием.
25. Способ получения в соответствии с описанными выше 22 или 24, в котором тесты качества выполняются для одного или нескольких из следующих тестов качества от a' до j'.
Тест качества a', который проверяет, что доля числа клеток, демонстрирующих по существу веретеновидную форму во всех клетках при наблюдении с помощью оптического микроскопа, больше или равна 99%, больше или равна 99,5%, больше или равна равно 99,9% или больше или равно 99,95%,
Тест качества b', который проверяет, что жизнеспособность клетки больше или равна 50%, больше или равна 60%, больше или равна 70%, больше или равна 80%, больше или равна 90%, или больше или равно 95%,
Тест качества c', который проверяет, что клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45 в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности, или проверяет, что клетки положительны, по меньшей мере, по одному из CD73 и CD90 и отрицательны по CD34 в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности,
Тест качества d', который проверяет, что клетки отрицательны по антигену CD40, CD80, CD86 и MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности, или проверяет, что клетки отрицательны, по меньшей мере, по CD40, CD80, CD86 и MHC -антиген класса II в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности,
Тест качества е', который проверяет, что клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности, когда клетки стимулируются интерфероном-γ, или проверяет, по меньшей мере, любой одна из клеток, отрицательных по CD40, отрицательных по CD80, отрицательных по CD86 или положительных по антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности, когда клетки стимулируются интерфероном-γ,
Тест качества f, который проверяет, что клетки экспрессируют простагландин E2 и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), и уровень экспрессии простагландина E2 увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α,
Тест качества g', который проверяет, что уровень экспрессии аггрекана увеличивается при культивировании клеток в среде, содержащей вещество, которое индуцирует дифференцировку в хондроциты,
Тест качества h', который проверяет, что количество кальция, накопленного в клетках, увеличивается, когда клетки культивируются в среде, содержащей вещество, которое индуцирует дифференцировку в остеоциты,
Тест качества i', который проверяет способность клеток делиться не менее 3, 4 или 5 раз в планшете для культивирования клеток, и
Тест качества j', который проверяет, что среднее время удвоения клеток в планшете для культивирования клеток составляет 96 часов, 84 часа, 72 часа, 48 часов или 36 часов в течение периода теста качества i'.
26. Способ получения согласно описанному выше 22-25, в котором процент положительных результатов CD107b в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в тестах качества на стадии (g) или (h), выше, чем соответствующий показатель положительных результатов плюрипотентные стволовые клетки, использованные в тестах качества на стадии (c) или (d).
27. Способ получения согласно любому из описанных выше 22-26, где положительный процент, по меньшей мере, одного из CD39, CD49a, CD61, CD107a, CD107b и CD143 в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в тестах качества на стадии (g) или (h) выше, чем соответствующая положительная доля плюрипотентных стволовых клеток, используемых в тестах качества на стадии (c) или (d), и положительная доля CD146 в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качестве тестов на стадии (g) или (h) ниже, чем соответствующий показатель положительных результатов плюрипотентных стволовых клеток, используемых в тестах качества на стадии (c) или (d).
28. Способ получения согласно описанному выше 22-27, в котором уровень экспрессии, по меньшей мере, одного из IL-6, HGF, IGFBP-4, IL-11, TIMP-3 и TIMP-2 в плюрипотентном стволовые клетки, используемые в тестах качества на стадии (g) или (h), выше, чем соответствующий уровень экспрессии в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в тестах качества на стадии (c) или (d).
29. Клетки, полученные способом получения согласно любому из описанных выше 1-28.
30. Клетки согласно описанному выше 29, которые являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45.
31. Клетки согласно описанному выше 30, которые отрицательны в отношении антигена CD40, CD80, CD86 и MHC-класса II.
32. Клетки согласно описанному выше 31, которые становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются интерфероном-γ.
33. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, имеющие, по меньшей мере, одну характеристику, показанную ниже в (1) - (4).
(1) клетки положительны по CD73, CD90, CD105 и CD166
и отрицательные по антигену CD34, CD40, CD45, CD80, CD86 и MHC-класса II, становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются интерфероном-γ, и экспрессируют простагландин E2 и/или фактор роста эндотелия сосудов, и уровень экспрессии простагландина E2 увеличивается, когда клетки стимулируются TNF-α,
(2) клетки положительны, по меньшей мере, по одному из числа CD73, CD90, CD105, и CD166 и отрицательны по CD34 и CD45,
3. клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD19, CD34 и CD206, и
4. клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD19, CD31, CD33, CD34, CD38, CD45, CD206, CD235a и SSEA-1.
34. Клетки согласно описанному выше 33, которые обладают способностью дифференцироваться на остеоциты и хондроциты.
35. Клетки согласно описанным выше 33 или 34, в которых средний диаметр клеток в состоянии, в котором клетки вынуждены плавать в среде, составляет от 16 до 20 мкм.
36. Клетки согласно любому из описанных выше 33-35, которые обладают способностью делиться, по меньшей мере, 3 раза в среде in vitro и в которых среднее время удвоения находится в пределах 96 часов.
37. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-35, которые имеют следующие характеристики: клетки делятся, по меньшей мере, в 10, 15, 16 или 17 раз в среде in vitro, и среднее время деления клеток находится в пределах 48 часов, и клетки обладают способностью делиться не менее 10, 14 или 15 раз в среде in vitro, а среднее время клеточных делений находится в пределах 96 часов, 84 часов, 72 часа, 48 часов или 36 часов.
38. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-35, которые имеют следующие характеристики: клетки разделились, по меньшей мере, в 16, 21, 22 или 23 раза в среде in vitro, и клетки обладают способностью делиться, по меньшей мере, 3, 4 или 5 раз в среде in vitro, и среднее время деления клеток находится в пределах 96 часов, 84 часов, 72 часов, 48 часов или 36 часов.
39. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-38, которые являются отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD19, CD26, CD106, CD117 и CD271.
40. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-39, которые являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD140b и HLA-A, -B и -C.
41. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-40, которые являются отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD56 и CD146.
42. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-41, которые являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD49e и CD95.
43. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-42, которые являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD10, CD46, CD47, CD55, CD58 и CD59.
44. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-43, которые экспрессируют, по меньшей мере, один из числа MMP-2, IGFBP-4, цистатина C, IL-6, IL-11, MCP-1, IL-8, HGF, VEGF, TIMP-1, TIMP-2 и TIMP-3.
45. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-44, которые экспрессируют, по меньшей мере, один из числа GROα, VCAM-I и IP-10.
46. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-45, которые экспрессируют IL-6 и в которых уровень его экспрессии повышен посредством стимуляции TNF-α и стимуляции интерфероном-γ.
47. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-46, которые экспрессируют IL-11 и в которых уровень его экспрессии повышен за счет стимуляции TNF-α и стимуляции интерфероном-γ.
48. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-47, которые экспрессируют IP-10 и в которых уровень его экспрессии повышен за счет стимуляции TNF-α и стимуляции интерфероном-γ.
49. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-48, которые экспрессируют МСР-1 и в которых уровень его экспрессии повышен за счет стимуляции TNF-α и стимуляции интерфероном-γ.
50. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-49, в которых экспрессия GM-CSF индуцируется стимуляцией TNF-α.
51. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-50, которые экспрессируют HGF и в которых уровень его экспрессии снижается при стимуляции TNF-α и повышается при стимуляции интерфероном-γ.
52. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-51, которые экспрессируют IL-8 и в которых уровень его экспрессии повышен за счет стимуляции TNF-α.
53. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, согласно любому из описанных выше 33-52, где пульпа зуба получена из постоянных или временных зубов человека.
54. Композиция, содержащая: полученные из пульпы зуба плюрипотентные стволовые клетки согласно любому из описанных выше 33-53, суспендированные в бикарбонатном растворе Рингера, содержащем человеческий сывороточный альбумин и диметилсульфоксид.
55. Композиция, содержащая: полученные из пульпы зуба плюрипотентные стволовые клетки согласно любому из описанных выше 33-53, суспендированные в растворе, содержащем ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, сывороточный альбумин человека и диметилсульфоксид.
56. Композиция согласно описанному выше 55, в которой ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, сывороточный альбумин человека и диметилсульфоксид содержатся соответственно в концентрациях от 91 до 113 мМ, от 2,52 до 3,08 мМ, от 0,95 до 1,16 мМ, от 0,315 до 0,385 мМ, от 15,6 до 19,2 мМ, от 1,04 до 1,28 мМ, от 46 до 56 г/л и от 9% до 11% (об./об.).
57. Композиция согласно описанному выше 54-56, дополнительно содержащая: ацетилтриптофан или его соли; и каприловая кислота или ее соли.
58. Композиция согласно любому из описанных выше 54-57, в которой плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, содержатся при плотности от 5 × 106 до 8 × 107 клеток/мл.
59. Композиция согласно описанному выше 54-58, которую инкапсулируют в контейнере в количестве от 1 до 20 мл.
60. Композиция согласно описанному выше 59, в которой емкость изготовлена из стекла или пластика.
61. Композиция согласно описанному выше 54-60, которая находится в замороженном состоянии.
62. Фармацевтическая композиция, содержащая: композицию согласно любому из описанных выше 54-61.
63. Фармацевтическая композиция согласно описанному выше 62, которая представляет собой терапевтическое средство для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания, ревматоидного артрита, болезни Крона, хронического воспалительного заболевания кишечника, инфаркта миокарда, инфаркта головного мозга (включая хронический инфаркт мозга и острый инфаркт головного мозга), хронический воспалительный демиелинизирующий полиневрит, рассеянный склероз, системная красная волчанка, цирроз печени (включая декомпенсированный цирроз печени), сепсис, остеоартрит, псориаз и отторжение трансплантата органа.
64. Фармацевтическая композиция согласно описанному выше 62 для применения при лечении заболевания, выбранного из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания, ревматоидного артрита, болезни Крона, хронического воспалительного заболевания кишечника, инфаркта миокарда, инфаркта головного мозга (включая хронический инфаркт мозга и острый инфаркт мозга), хронический воспалительный демиелинизирующий полиневрит, рассеянный склероз, системная красная волчанка, цирроз печени (включая декомпенсированный цирроз печени), сепсис, остеоартрит, псориаз и отторжение трансплантата органа.
Полезные эффекты изобретения
В соответствии с настоящим изобретением предлагается новый препарат плюрипотентных стволовых клеток, полученный из пульпы зуба, который полезен при лечении инфаркта мозга и т.п. и может вводиться людям. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением можно эффективно продуцировать такие клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками (клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками), которые можно вводить людям, и, следовательно, можно стабильно поставлять фармацевтические изделия, содержащие эти клетки, полученные из пульпы зуба, в качестве активных компонентов в соответствии с потребностями. Кроме того, поскольку клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, могут быть получены в стабильной форме, можно также избежать возможности ухудшения качества во время распределения или хранения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой график, показывающий среднее измерений диаметров клеточных частиц полученных из пульпы зуба клеток (промежуточных клеток и клеток, содержащихся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба), которые соответственно содержатся в интермедиатах и препаратах клеток, полученных из пульпы зуба, соответственно полученных в Примерах 7 и 16. Вертикальная ось указывает средний диаметр частиц (мкм). Средние диаметры частиц промежуточных клеток и клеток, содержащихся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, показаны в порядке слева направо. Планки погрешностей указывают на стандартное отклонение (n = 3).
Фиг. 2 представляет собой график, показывающий результаты испытаний способности дифференцироваться в остеоциты у клеток, полученных из пульпы зуба, полученных в примерах 7 и 16. Вертикальная ось указывает концентрацию кальция (мкг/мл). Что касается промежуточных клеток (Пример 7) и клеток в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба (Пример 16), черные столбцы указывают концентрации кальция, высвобожденного из клеток групп, индуцирующих дифференцировку остеоцитов, а белые столбцы указывают концентрации кальция, высвобожденного из клеток контрольные группы.
Фиг. 3 представляет собой график, показывающий результаты тестирования способности дифференцироваться в хондроциты у клеток, полученных из пульпы зуба, полученных в примерах 7 и 16. Вертикальная ось указывает значение Ct аггрекана (ACAN). Что касается промежуточных клеток и клеток в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, черные полосы указывают значения Ct аггрекана (ACAN) клеток индуцирующих дифференцировку хондроцитов групп, а белые столбцы указывают значения Ct аггрекана (ACAN) клеток контрольных групп.
Фиг. 4 представляет собой график, показывающий результаты измерения поверхностных антигенов клеток, полученных из пульпы зуба, полученные в примерах 7 и 16. Вертикальная ось указывает долю (%) положительных клеток. Что касается промежуточных клеток (черные столбцы) и клеток (белые столбцы) в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, доли положительных клеток по CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 и CD166 показаны в порядке слева направо.
Фиг. 5 представляет собой график, показывающий результаты измерения поверхностных антигенов клеток, полученных из пульпы зуба (промежуточные клетки), которые содержатся в интермедиатах, полученных в примере 7. Вертикальная ось указывает долю (%) положительных клеток. Доли положительных клеток по CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD46, CD47, CD49b, CD49c, CD49f, CD55, CD58, CD59, CD63, CD73, CD81, CD90, CD98, CD140b, CD147, CD151, CD164, CD166 рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R) и человеческий лейкоцитарный антиген-A, -B и -C (HLA-A, -B и -C) показаны в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а планки погрешностей указывают стандартные ошибки (n = 9).
Фиг. 6 представляет собой график, показывающий результаты измерения поверхностных антигенов клеток, содержащихся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, полученных в Примере 16. Вертикальная ось указывает долю (%) положительных клеток. Доли положительных клеток по CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD46, CD47, CD49b, CD49c, CD49e, CD49f, CD55, CD58, CD59, CD63, CD73, CD81, CD90, CD95, CD98, CD140b, CD147, CD151, CD164, CD166, EGF-R и HLA-A, -B и -C показаны в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а полосы ошибок указывают стандартные ошибки (n = 7).
Фиг. 7 представляет собой график, показывающий различия (положительный процент (%) в препаратах - положительный уровень (%) в интермедиатах) между промежуточными соединениями и препаратами, соответственно, полученными в примерах 7 и 16 для поверхностных антигенов, имеющих положительную разницу в скорости не менее 10% в клетках, полученных из пульпы зуба, содержащихся в промежуточных продуктах и препаратах. Результаты для CD39, CD49a, CD61, CD107a, CD107b, CD143 и CD146 показаны в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а полосы ошибок указывают стандартные ошибки (n = 7).
Фиг. 8 представляет собой график, показывающий результаты испытаний секреторной способности VEGF клеток, полученных из пульпы зуба, в интермедиатах и препаратах, соответственно полученных в примерах 7 и 16. Вертикальная ось указывает количество (пг/1 × 105 клеток) секретируемого фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).
Фиг. 9 представляет собой график, показывающий результаты теста секреторной способности простагландина E2 (PGE2) клеток, полученных из пульпы зуба, в интермедиатах и препаратах, соответственно полученных в Примерах 7 и 16. Вертикальная ось указывает количество (пг/1 × 105 клеток) секретируемого PGE2.
Черные столбцы показывают результаты в группах, стимулированных фактором некроза опухоли (TNF-α), а белые столбцы указывают результаты в группах, стимулированных фактором некроза опухолей.
Фиг. 10 представляет собой график, показывающий результаты испытаний секреторной способности кинуренина клеток, полученных из пульпы зуба, полученные в Примерах 7 и 16. Вертикальная ось показывает количество (нг/1 × 105 клеток) кинуренина, секретируемого промежуточными клетками и клетками в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба.
Фиг. 11A представляет собой график, показывающий результаты теста на низкую иммуногенность клеток, полученных из пульпы зуба, в интермедиатах, полученных в Примере 7. Вертикальная ось указывает долю (%) положительных клеток. Черные полосы показывают результаты в группах, не стимулированных интерфероном-γ (IFN-γ), а белые полосы указывают результаты в группах, стимулированных IFN-γ. Доли положительных клеток по антигену класса I основной гистосовместимости (MHC), антигену класса II основной гистосовместимости (MHC), CD40, CD80 и CD86 показаны в порядке слева направо.
Фиг. 11В представляет собой график, показывающий результаты теста на низкую иммуногенность клеток, полученных из пульпы зуба, в препаратах, полученных в Примере 16. Вертикальная ось указывает долю (%) положительных клеток. Черные полосы указывают результаты в группах, не стимулированных IFN-γ, а белые полосы указывают результаты в группах, стимулированных IFN-γ. Доли положительных клеток по антигену MHC-класса I, антигену MHC-класса II, CD40, CD80 и CD86 в порядке слева направо.
Фиг. 12 представляет собой график, показывающий результаты измерения концентраций различных факторов, таких как цитокин, в культуральных надосадочных жидкостях, когда клетки, полученные из пульпы зуба, содержащиеся в интермедиатах и препаратах, соответственно полученных в примерах 7 и 16, не стимулируются. Вертикальная ось показывает концентрацию (пг/1 x 105 клеток) различных факторов. Концентрации матриксной металлопротеазы-2 (ММР-2), белка-4, связывающего инсулиноподобный фактор роста (IGFBP-4) и цистатина С для промежуточных клеток (черные столбцы) и клеток (белые столбцы) в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, показаны в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а планки погрешностей указывают стандартные ошибки (n = 3).
Фиг. 13 представляет собой график, показывающий результаты измерения концентраций различных факторов, таких как цитокин, в культуральных надосадочных жидкостях, когда клетки, полученные из пульпы зуба, содержащиеся в интермедиатах и препаратах, соответственно полученных в примерах 7 и 16, не стимулируются. Вертикальная ось показывает концентрацию (пг/1 x 105 клеток) различных факторов. Концентрации интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-11 (IL-11), хемотаксического белка моноцитов-1 (MCP-1), интерлейкина-8 (IL-8), белка регулируемого роста человека альфа (GROα), гепатоцитов фактор роста (HGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), молекулы адгезии сосудистого эндотелия 1 типа (VCAM-1), тканевый ингибитор-3 металлопротеиназ (TIMP-3), тканевой ингибитор-2 металлопротеиназ (TIMP-2), и тканевой ингибитор-1 металлопротеиназ (TIMP-1) для промежуточных клеток (черные столбцы) и клетки (белые столбцы) в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, показаны в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а планки погрешностей указывают стандартные ошибки (n = 3).
Фиг. 14 представляет собой изображение, показывающее результаты измерения концентраций различных факторов, таких как цитокин, в культуральных надосадочных жидкостях, когда клетки, полученные из пульпы зуба, содержащиеся в интермедиатах, и препаратах, соответственно полученных в примерах 7 и 16, не стимулируются. Вертикальная ось показывает концентрацию (пг/1 x 105 клеток) различных факторов. Концентрации интерлейкина-23 (IL-23), интерлейкина-21 (IL-21), интерферона-α (IFN-α), TNF-α, интерлейкина-18 (IL-18), интерлейкина-33 (IL-33), интерлейкина-27 (IL-27), хемокина, регулируемого тимусом и активацией (TARC), эпителиального нейтрофил-активирующего белка-78 (ENA-78), воспалительного белка макрофагов-3a (MIP-3α), воспалительного белка макрофагов-1p (MIP-1β), эотаксина, интерферон-γ-индуцибельного белка-10 (IP-10), макрофагального воспалительного белка-1a (MIP-1a), монокина, индуцированного гамма-интерфероном (MIG), интерферон-индуцируемого альфа-хемоаттрактанта Т-клеток (I-TAC), фактора стволовых клеток (SCF), гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) для интермедиатов (черные столбцы) и препаратов (белые столбцы) отображаются в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а планки погрешностей указывают стандартные ошибки (n = 3).
Фиг. 15 представляет собой график, показывающий соотношения (концентрация в препарате/концентрация в интермедиате) факторов, концентрации которых в препарате выше, чем концентрации в интермедиате среди различных факторов, таких как цитокин в культуральных надосадочных жидкостях, когда клетки, полученные из пульпы зуба, содержащиеся в интермедиатах и препаратах, соответственно полученных в примерах 7 и 16, не стимулируются.
Соотношения концентраций IL-6, IL-23, IL-11, MCP-1, ENA-78, HGF, VEGF, MMP-2, IGFBP-4, цистатина C, TIMP-3, TIMP-2 и TIMP-1 отображаются в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а планки погрешностей указывают стандартные ошибки (n = 3).
Фиг. 16 представляет собой график, показывающий концентрации IL-6 в культуральных надосадочных жидкостях в группах без стимуляции, стимуляции TNF-α и стимуляции IFN-γ для клеток, полученных из пульпы зуба, содержащихся в интермедиатах и препаратах, соответственно полученных в Примерах 7 и 16. Вертикальная ось указывает концентрацию (пг/1 x 105 клеток). Концентрации в нестимулированных группах, группах, стимулированных TNF-α, и группах, стимулированных IFN-γ для интермедиатов (черные столбцы) и препаратов (белые столбцы) показаны в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а планки погрешностей указывают стандартные ошибки (n = 3).
Фиг. 17 представляет собой график, показывающий концентрации IL-11 в культуральных надосадочных жидкостях в группах без стимуляции, стимуляции TNF-α и стимуляции IFN-γ для клеток, полученных из пульпы зуба, содержащихся в интермедиатах и препаратах, соответственно полученных в Примеры 7 и 16. Вертикальная ось указывает концентрацию (пг/1 x 105 клеток). Результаты для нестимулированных групп, TNF-α-стимулированных групп и IFN-γ-стимулированных групп для интермедиатов (черные столбцы) и препаратов (белые столбцы) показаны в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а планки погрешностей указывают стандартные ошибки (n = 3).
Фиг. 18 представляет собой график, показывающий концентрации IP-10 в культуральных надосадочных жидкостях в группах без стимуляции, стимуляции TNF-α и стимуляции IFN-γ для клеток, полученных из пульпы зуба, содержащихся в интермедиатах и препаратах, соответственно полученных в Примерах 7 и 16. Вертикальная ось указывает концентрацию (пг/1 x 105 клеток). Результаты для нестимулированных групп, TNF-α-стимулированных групп и IFN-γ-стимулированных групп для интермедиатов (черные столбцы) и препаратов (белые столбцы) показаны в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а планки погрешностей указывают стандартные ошибки (n = 3).
Фиг. 19 представляет собой график, показывающий концентрации МСР-1 в культуральных надосадочных жидкостях в группах без стимуляции, стимуляции TNF-α и стимуляции IFN-γ для клеток, полученных из пульпы зуба, содержащихся в интермедиатах и препаратах, соответственно полученных в Примеры 7 и 16. Вертикальная ось указывает концентрацию (пг/1 x 105 клеток). Результаты для нестимулированных групп, TNF-α-стимулированных групп и IFN-γ-стимулированных групп для интермедиатов (черные столбцы) и препаратов (белые столбцы) показаны в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а планки погрешностей указывают стандартные ошибки (n = 3).
Фиг. 20 представляет собой график, показывающий концентрации GM-CSF в культуральных надосадочных жидкостях в группах без стимуляции, стимуляции TNF-α и стимуляции IFN-γ для клеток, полученных из пульпы зуба, содержащихся в интермедиатах и препаратах, соответственно полученных в Примеры 7 и 16. Вертикальная ось указывает концентрацию (пг/1 x 105 клеток). Результаты в нестимулированных группах, TNF-α-стимулированных группах и IFN-γ-стимулированных группах для интермедиатов (черные столбцы) и препаратов (белые столбцы) показаны в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а планки погрешностей указывают стандартные ошибки (n = 3).
Фиг. 21 представляет собой график, показывающий концентрации HGF в культуральных надосадочных жидкостях в группах без стимуляции, стимуляции TNF-α и стимуляции IFN-γ для клеток, полученных из пульпы зуба, содержащихся в интермедиатах и препаратах, соответственно полученных в примерах 7. и 16. Вертикальная ось указывает концентрацию (пг/1 x 105 клеток). Результаты в нестимулированных группах, TNF-α-стимулированных группах и IFN-γ-стимулированных группах для интермедиатов (черные столбцы) и препаратов (белые столбцы) показаны в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а планки погрешностей указывают стандартные ошибки (n = 3).
Фиг. 22 представляет собой график, показывающий концентрации IL-8 в культуральных надосадочных жидкостях в группах без стимуляции, стимуляции TNF-α и стимуляции IFN-γ для клеток, полученных из пульпы зуба, содержащихся в интермедиатах и препаратах, соответственно полученных в Примеры 7 и 16. Вертикальная ось указывает концентрацию (пг/1 x 105 клеток). Результаты в нестимулированных группах, TNF-α-стимулированных группах и IFN-γ-стимулированных группах для интермедиатов (черные столбцы) и препаратов (белые столбцы) показаны в порядке слева направо. Значения представляют собой средние значения, а планки погрешностей указывают стандартные ошибки (n = 3).
Описание воплощений
Плюрипотентная стволовая клетка - это клетка, обладающая способностью к саморепликации и способностью дифференцироваться в две или более клеток. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы человека, которые могут быть получены с помощью настоящего изобретения, предпочтительно обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и остеоциты, но настоящее изобретение конкретно этим не ограничивается.
Тот факт, что плюрипотентная стволовая клетка, которая может быть получена с помощью настоящего изобретения, имеет способность дифференцироваться в хондроциты, может быть подтверждена, например, путем количественного определения уровня экспрессии гена аггрекана при культивировании клетки в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку клетки в хондроцит. Аггрекан является основной молекулой, составляющей внеклеточный матрикс хряща, и уровень его экспрессии увеличивается, когда индуцируется дифференцировка клетки в хондроциты. В этом способе измерения TGF-b3 можно использовать в качестве вещества (индуктора дифференцировки хондроцитов), которое, например, индуцирует дифференцировку в хондроциты клетки. Способ измерения, описанный в Примере 20, является подходящим примером способом измерения способности дифференцироваться в хондроциты.
Тот факт, что плюрипотентная стволовая клетка, которую можно получить с помощью настоящего изобретения, имеет способность дифференцироваться в остеоциты, может быть подтвержден, например, путем количественного определения количества кальция, накопленного в клетке, когда клетка культивируется в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку клетки в остеоцит. Когда индуцируется дифференцировка в остеоциты, кальций накапливается в клетке. В этом способе измерения дексаметазон, Р-глицерофосфат, гликозаминогликан, аскорбиновая кислота, остеогенный фактор 2 (BMP-2) и их соли могут использоваться по отдельности или в комбинации двух или более из них в качестве вещества (индуктора дифференцировки остеоцитов), которое вызывает дифференцировку, например, в остеоциты.
Например, можно подходящим образом использовать комбинацию дексаметазона, аскорбата и Р-глицерофосфата в качестве агента, индуцирующего дифференцировку остеоцитов. Способ измерения, описанный в примере 19, является подходящим примером способа измерения способности дифференцироваться в остеоциты.
«Клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками» или «клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками» в настоящем изобретении получены из пульпы зуба и агрегата клеток, в которых пропорция (количественная доля) плюрипотентных стволовых клеток выше, чем в клетках, непосредственно собранных из пульпы зуба, и включает плюрипотентные стволовые клетки, окончательно селективно выделенные из пульпы зуба путем культивирования или т.п. Клетки, непосредственно собранные из пульпы зуба, представляют собой клетки, в которых плюрипотентные стволовые клетки смешаны с другими клетками. Когда эти клетки культивируются, доля плюрипотентных стволовых клеток в завершении культивирования выше по сравнению с таковой в начале культивирования, поскольку плюрипотентные стволовые клетки обладают более высокой способностью к пролиферации, чем другие клетки. Поскольку доля плюрипотентных стволовых клеток дополнительно увеличивается за счет повторного культивирования, могут быть получены клетки, содержащие почти только плюрипотентные стволовые клетки. То есть «клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками» включают клетки, в которых доля плюрипотентных стволовых клеток во всех клетках выше, чем в клетках сразу после их сбора из пульпы зуба, из-за пролиферации плюрипотентных стволовых клеток в процесс культивирования и т.п. Клетки, полученные из пульпы зуба человека, в частности, называют «клетками, полученными из пульпы зуба человека, обогащенными плюрипотентными стволовыми клетками».
В настоящем изобретении плюрипотентные стволовые клетки, непосредственно выделенные из пульпы зуба, и плюрипотентные стволовые клетки, содержащиеся в клетках, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, путем культивирования, в совокупности называются «плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба», а иногда их просто называют «стволовыми клетками, полученными из пульпы зуба» или «стволовыми клетками пульпы зуба». Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба человека, в частности, называются «плюрипотентными стволовыми клетками, полученными из пульпы зуба человека», или иногда просто называются «стволовыми клетками, полученными из пульпы зуба человека» или «стволовыми клетками пульпы зуба человека». «Клетки, содержащиеся в интермедиатах (промежуточные клетки)» и «клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба», которые представляют собой одно воплощение, представленное в настоящем описании, по существу содержат только плюрипотентные стволовые клетки, и оба являются плюрипотентными стволовыми клетками, полученными из пульпы зуба.
В настоящем изобретении в случае, когда тестируемая популяция клеток является положительной по определенным антигенам в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов, это означает, что предпочтительно, по меньшей мере, 30%, более предпочтительно, по меньшей мере, 40%, еще больше предпочтительно, по меньшей мере, 50%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90% и особенно предпочтительно, по меньшей мере, 95% наблюдаемых клеток положительный на антигены, когда популяция клеток наблюдается в целом. Паттерны экспрессии поверхностных антигенов можно исследовать, например, с помощью способа, описанного в Примере 21 или 22, но настоящее изобретение этим не ограничивается.
В настоящем изобретении в случае, когда тестируемая популяция клеток является отрицательной по определенным антигенам в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов, это означает, что предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10%, еще более предпочтительно менее 5%, еще более предпочтительно менее 2% и особенно предпочтительно менее 1% наблюдаемых клеток являются положительными по антигенам, когда популяция клеток наблюдается в целом. Паттерны экспрессии поверхностных антигенов можно исследовать, например, с помощью способа, описанного в Примере 21 или 22, но настоящее изобретение этим не ограничивается.
Когда обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками клетки пульпы зуба по настоящему изобретению культивируют в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в хондроциты, наблюдается повышение уровня экспрессии аггрекана в целом. Кроме того, когда клетки настоящего изобретения, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками культивируют в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в остеоциты, в целом наблюдается увеличение количества кальция, накопленного в клетках. То есть клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и остеоциты при наблюдении в целом.
В одном воплощении, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению наблюдаются в целом (популяция), клетки являются положительными, по меньшей мере, в отношении одного из CD73, CD90, CD105 и CD166 в паттерны экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Точно так же клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению отрицательны, по меньшей мере, по одному из CD34 и CD45. Например, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению наблюдаются в целом, клетки являются, например, положительными по CD73 и CD90 и отрицательными по CD34 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Кроме того, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45 в паттернах экспрессии маркеры поверхностных антигенов. Эти паттерны экспрессии являются общими для мезенхимальных стволовых клеток.
Кроме того, в одном воплощении, когда клетки настоящего изобретения, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD40, CD80, CD86 и MHC- антиген класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Например, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками по настоящему изобретению наблюдаются в целом, клетки отрицательны по антигену CD40, CD80, CD86 и MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Известно, что когда клетки, положительные по этим маркерам поверхностных антигенов, трансплантируются аллогенным индивидуумам, клетки имеют тенденцию распознаваться как антиген, который необходимо исключить из живого организма. В случае, когда клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному из этих маркеров поверхностных антигенов, это означает, что обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками полученные из пульпы зуба настоящего изобретения обладают свойством низкой иммуногенности до такой степени и вряд ли будут исключаться из живого организма при трансплантации аллогенным индивидуумам. Кроме того, клетки могут оставаться отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и быть положительными по антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов, когда клетки стимулируются IFN-γ. Например, клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются IFN-γ.
В одном воплощении, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению наблюдаются в целом, эти клетки являются, например, положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34, CD40, CD45, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. В это время, например, клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и могут стать положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются IFN-γ.
В одном воплощении, касательно характеристики (a-1), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками (плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба), по настоящему изобретению наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD29, CD46, CD47, CD59, CD73, CD81, CD90, CD147 и HLA-A, -B и -C в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
Кроме того, в одном воплощении, касательно характеристики (а-2), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD9, CD44, CD49b, CD49c, CD55, CD98 и EGF-R в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 65%, более предпочтительно, по меньшей мере, 75% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
Кроме того, в одном воплощении, касательно характеристики (a-3), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD49f, CD140b и CD166 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 75% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
Кроме того, касательно характеристики (а-4), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD10, CD13, CD58, CD63, CD105, CD151 и CD164 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 65%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 70% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении изобретения клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению предпочтительно имеют два или более, более предпочтительно три или более, а еще более предпочтительно все характеристики, показанные в описанных выше (a-1), (а-2), (а-3) и (а-4). Например, клетки, имеющие характеристики, показанные в описанных выше (а-1) и (а-2), являются подходящим воплощением настоящего изобретения.
В одном воплощении, касательно характеристики (а-5), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению наблюдаются в целом, эти клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD120b, CD132, CD158a, CD161, CD184, CD195, CD206, CD210, CD212, CD226, CD244, CD267, CD278, CD279, CD282, CD294, стадийно-специфического эмбрионального антигена-1 (SSEA-1), TRA-1-60, стадийно-специфического эмбрионального антигена-3 (SSEA-3), кожного антигена, связанного с лимфоцитами (CLA), и интегрина β7 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно не более 10%, более предпочтительно не более 5% и еще более предпочтительно не более 2% и еще более предпочтительно не более 1% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, касательно характеристики (а-6), когда наблюдаются в целом клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD8b, CD11b, CD15s, CD16, CD19, CD24, CD31, CD32, CD62E, CD62P, CD66f, CD86, CD88, CD94, CD100, CD103, CD114, CD117, CD118, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD126, CD127, CD128b, CD135, CD137, лиганда CD137, CD150, CD163, CD172b, CD177, CD178, CD180, CD197, CD220, CD229, CD231, CD255, CD268, CD305, CD314, CD321, CDw327, CDw328, CD329, CD335, CD336, лейкотриеновый рецептор B4 (BLTR-1), CLIP, CMRF-44, CMRF, CMRF-56, рецептора N-формилметиониллейцилфенилаланина (fMLP-R), инвариантного NKT и γδ Т-клеточного рецептора (γδ TCR) в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно не более 10%, более предпочтительно не более 5% и еще более предпочтительно не более 2% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, касательно характеристики (а-7), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению наблюдаются в целом, эти клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD1a, CD1b, CD1d, CD2, CD3, CD5, CD6, CD7, CD8a, CD11c, CD15, CD18, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27, CD28, CD33, CD34, CD35, CD37, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42b, CD45, CD45RB, CD45RO, CD48, CD50, CD53, CD62L, CD64, CD66 (a, c, d, e), CD69, CD70, CD72, CD80, CD84, CD85, CD87, CD89, CDw93 , CD97, CD106, CD134, CD138, CD144, CD154, CD158b, CD162, CD183, CD205, CD235a, CD271, CD309, CD326, CD337, αβ Т-клеточного рецептора (αβ TCR) и антигена MHC класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно только, по большей мере, 10% и более предпочтительно только, по большей мере, 5% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении изобретения клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению предпочтительно имеют два или более, более предпочтительно три или более, а еще более предпочтительно все характеристики, показанные в описанном выше (a-1), (a-2), (a-3) и (a-4), (a-5), (a-6) и (a-7). Например, клетки, имеющие характеристики, показанные в описанных выше (а-1) и (а-5), являются подходящим воплощением настоящего изобретения.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки настоящего изобретения, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками наблюдаются в целом, эти клетки экспрессируют, например, простагландин E2 (PGE2) и/или эндотелиальный фактор роста (VEGF), и уровень экспрессии простагландина E2 (PGE2) увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α. Поскольку VEGF представляет собой вещество, обладающее ангиогенным действием, клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, могут способствовать образованию кровеносных сосудов в организме с использованием VEGF путем введения этих клеток людям. Следовательно, клетки можно использовать в качестве терапевтического агента при заболеваниях, при которых необходимо проявить ангиогенный эффект. Кроме того, поскольку PGE2 обладает сильным противовоспалительным действием, клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, воздействуют на воспалительный участок в организме через PGE2 и могут подавлять деструкцию ткани, сопровождаемую воспалением, путем введения клеток человеку. Следовательно, клетки можно использовать как ингибитор разрушения тканей, сопровождающегося воспалением. Однако эффекты клеток пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками не ограничиваются использованием VEGF или PGE2.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, культивируют в присутствии IFN-γ, количество секретируемого кинуренина увеличивается. Кинуренин может подавлять пролиферацию Т-клеток и дифференцировать моноциты в противовоспалительные макрофаги M2. Соответственно, клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, могут оказывать противовоспалительное действие с использованием кинуренина при введении людям.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, для одного или всех из числа CD19, CD34 и CD206 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Кроме того, в одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD19, CD31, CD33, CD34, CD38, CD45, CD206, CD235a и SSEA-1 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, наблюдаются в целом, эти клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, например, по всем из числа CD19, CD26, CD106, CD117 и CD271 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, например, всем CD140b и HLA-A, - B и -C в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, например, всем из числа CD10, CD46, CD47, CD55, CD58 и CD59 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, наблюдаются в целом, клетки являются, например, положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD73, CD90, CD105 и CD166. и отрицательный, по меньшей мере, для одного из CD34 и CD45 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, наблюдаются в целом, клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34, CD40, CD45, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. При этом, например, клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются IFN-γ. Клетки экспрессируют простагландин E2 и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), а количество секретируемого простагландина E2 увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α. Кроме того, количество секретируемого кинуренина увеличивается за счет стимуляции клеток IFN-γ.
Когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками по настоящему изобретению культивируют, клетки секретируют различные гуморальные факторы.
(a-8) В одном воплощении, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, культивируют, эти клетки экспрессируют, по меньшей мере, один, предпочтительно все из числа MMP-2, IGFBP-4 и цистатина C.
(a-9) В одном воплощении, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, культивируются, эти клетки экспрессируют, по меньшей мере, один, предпочтительно все из числа IL-6, IL-11, MCP-1, IL-8, GROα, HGF, VEGF, VCAM-I, TIMP-3, TIMP-2 и TIMP-1.
Кроме того, касательно характеристики (а-10), когда культивируют клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, клетки экспрессируют, по меньшей мере, один, предпочтительно все из числа IL-23, TNF-α, IL-18, IL-33, IL-27, TARC, ENA-78, MIP-3α, MIP-1β, IP-10, SCF и ICAM-1.
Кроме того, касательно характеристики (a-11), в одном воплощении, когда культивируют клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, эти клетки не экспрессируют или почти не экспрессируют, по меньшей мере, один, предпочтительно все из числа IL- 21, эотаксина, MIP-1a, MIG, I-TAC и GM-CSF.
Кроме того, касательно характеристики (a-12), в одном воплощении, в случае, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, культивируют в присутствии TNF-α или IFN-γ, уровень экспрессии IL-6 выше, чем в случае культивирования клеток в отсутствие такового.
Кроме того, касательно характеристики (a-13), в одном воплощении, в случае, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, культивируют в присутствии TNF-α или IFN-γ, уровень экспрессии IL-11 выше, чем в случае культивирования клеток в отсутствие такового.
Кроме того, касательно характеристики (a-14), в одном воплощении, в случае, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, культивируют в присутствии TNF-α или IFN-γ, уровень экспрессии IP-10 выше, чем в случае культивирования клеток в отсутствие такового.
Кроме того, касательно характеристики (a-15), в одном воплощении, в случае, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, культивируют в присутствии TNF-α или IFN-γ, уровень экспрессии МСР-1 выше, чем в случае культивирования клеток в отсутствие такового.
Кроме того, касательно характеристики (a-16), в одном воплощении экспрессия GM-CSF индуцируется, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, культивируются в присутствии TNF-α, но экспрессия GM-CSF не индуцируется, когда клетки культивируются в присутствии IFN-γ.
Кроме того, касательно характеристики (a-17), в одном воплощении уровень экспрессии HGF снижается, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, культивируются в присутствии TNF-α по сравнению со случаем, где клетки культивируют в его отсутствие, тогда как уровень экспрессии HGF увеличивается, когда клетки культивируют в присутствии IFN-γ, по сравнению со случаем, когда клетки культивируют в его отсутствие.
Кроме того, касательно характеристики (a-18), в одном воплощении, в случае, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, культивируют в присутствии TNF-α, уровень экспрессии IL- 8 больше, чем в случае, когда клетки культивируют в его отсутствие.
В одном воплощении изобретения клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению предпочтительно имеют две или более, более предпочтительно три или более, а еще более предпочтительно четыре или более, а еще более предпочтительно все характеристики показаны в описанных выше (а-8) - (а-18). Например, клетки, имеющие характеристики, показанные в описанных выше (a-8) и (a-14), или клетки, имеющие характеристики, показанные в описанных выше (a-8), (a-13) и (а-14) представляют собой подходящее воплощение настоящего изобретения.
Клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению можно в основном отнести к плюрипотентным стволовым клеткам, полученным из пульпы зуба. Во многих случаях плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, в плоской культуре наблюдаются под оптическим микроскопом как прикрепленные клетки в форме веретена в планшете для культивирования клеток. Однако они не всегда наблюдаются как веретенообразные прикрепленные клетки в зависимости от условий культивирования.
«Пульпа зуба» в настоящем изобретении относится к рыхлой волокнистой соединительной ткани, которая заполняет полость пульпы зубов и состоит из: соединительной ткани, содержащей кровеносные сосуды, нервы и лимфатические сосуды; и слой одонтобласта, обладающий способностью выполнять осаждение и восстановление внутри дентина в боковой краевой части. Кроме того, пульпу зуба можно разделить на пульпу коронки и пульпу корня в зависимости от ее расположения. Зубная пульпа в настоящем изобретении относится к пульпе, включающей, по меньшей мере, одно из пульпы коронки и пульпы корня. Кроме того, виды животных, от которых получена пульпа зуба, используемая в настоящем изобретении, ничем особо не ограничиваются, но предпочтительно это млекопитающие, более предпочтительно это приматы, а еще более предпочтительно это люди.
Зубы для получения пульпы зуба могут быть постоянными зубами или молочными зубами или могут быть любыми из резцов, клыков, премолярных зубов и коренных зубов. Зубы предпочтительно представляют собой здоровые зубы, на которые не влияет кариес и т.п. Например, в настоящем изобретении можно подходящим образом использовать удаленные здоровые зубы, которые были удалены с помощью медицинской процедуры. В частности, особенно предпочтительно могут использоваться третьи коренные зубы, потому что количество зубной пульпы, которая может быть получена от каждого зуба, велико, и зубы легко доступны как удаленные здоровые зубы по таким причинам, как коррекция зубов или тому подобное. В данном документе возраст людей, у которых получаются зубы, особо не ограничивается. Однако предпочтительны зубы, полученные от людей в возрасте от 10 до 50 лет, а зубы, полученные от людей в возрасте от 15 до 45 лет, более предпочтительны. Кроме того, пол людей, из которых получают зубы, ничем особо не ограничен.
Для получения пульпы зуба предпочтительно использовать зубы в пределах 72 часов после удаления зуба, более предпочтительно использовать зубы в пределах 24 часов после удаления зуба и еще более предпочтительно использовать зубы в пределах 12 часов после удаления зуба. Удаленные зубы промывают бикарбонатным раствором Рингера или подобным, а затем стерилизуют стерилизующим средством. Стерилизатор, используемый в настоящее время, ничем особо не ограничен, но предпочтительным является тот, который проявляет антибактериальный эффект как в отношении грамположительных бактерий, так и грамотрицательных бактерий. Например, используется 1% раствор глюконата хлоргексидина.
Пульпа зуба может быть получена из удаленного зуба путем обнажения пульпы путем механического измельчения удаленного зуба. Пульпа зуба, извлеченная из удаленного зуба, предпочтительно измельчается с помощью такого инструмента, как ножницы, а затем обрабатывается протеазой.
Путем гидролиза протеазой индивидуальные клетки, составляющие пульпу зуба, высвобождаются из пульпы, полученной из удаленного зуба. Используемая в настоящее время протеаза предпочтительно включает сериновую протеазу, металлопротеазу или их смесь. Однако настоящее изобретение не ограничивается указанным, и может использоваться любая протеаза, которая может высвобождать индивидуальные клетки, составляющие пульпу зуба, то есть, которая может разлагать белковые молекулы клеточной адгезии.
Примеры металлопротеиназ, подходящих для применения в настоящее время, включают матриксную металлопротеиназу, нейтральную металлопротеиназу или их смесь. Коллагеназа, желатиназа или их смесь могут подходящим образом использоваться в качестве матричной металлопротеиназы. Кроме того, коллагеназа I, коллагеназа II или их смесь предпочтительны в качестве коллагеназы. Термолизин, диспазу или их смесь можно подходящим образом использовать в качестве нейтральной металлопротеиназы.
Примеры предпочтительной комбинации протеаз включают смесь коллагеназы I, коллагеназы II и термолизина. В случае, когда эту смесь используют в качестве протеазы, активность протеазы в реакционном растворе предпочтительно доводят до 0,17-1,33 ед./мл. Либераза (зарегистрированная торговая марка) (Roche), содержащая коллагеназу I, коллагеназу II и термолизин, может быть подходящим образом использована в качестве протеазы.
В случае, когда используется смешанный раствор коллагеназы типа II и Диспазы, соответствующие концентрации коллагеназы типа II и Диспазы предпочтительно составляют от 1 до 2 мг/мл и от 3000 до 7000 единиц/мл и более предпочтительно примерно 1,5 мг/мл и около 5000 единиц/мл.
Подходящая температура реакции при гидролизе пульпы зуба, полученной из удаленного зуба, с использованием протеазы составляет от 35°C до 37,5°C, а подходящее время реакции составляет от 30 минут до 3 часов. Например, пульпа зуба обрабатывается протеазой в течение 2 часов при 37°C. Однако температуру реакции и время реакции необходимо соответствующим образом регулировать в зависимости, например, от типа и концентрации протеазы.
Поскольку индивидуальные клетки, составляющие пульпу зуба, гидролизованную протеазой, высвобождаются из пульпы зуба, пульпа зуба может быть разобрана механическими средствами, такими как пипетирование. В это время протеазу предпочтительно инактивировать перед разборкой пульпы зуба механическими средствами. Инактивацию можно проводить путем добавления компонентов, которые инактивируют протеазы, к реакционному раствору, и в качестве таких компонентов можно использовать хелатирующий агент, такой как EDTA, среду для культивирования клеток, содержащую FBS и т.п. Путем разборки пульпы зуба можно получить суспензию, в которой клетки и т.п., составляющие пульпу зуба, присутствуют в растворе в плавающем состоянии. В этой суспензии содержатся плюрипотентные стволовые клетки, высвобождаемые из пульпы зуба. Чтобы удалить протеазу вместе с надосадочной жидкостью, предпочтительно центрифугировать эту суспензию один раз для осаждения нерастворимых веществ, таких как клетки. Осажденные клетки и т.п. снова суспендируют после удаления надосадочной жидкости. Среду для культивирования клеток, содержащую FBS, можно использовать, например, в качестве раствора для ресуспендирования. Полученная таким образом суспензия пульпы зуба включает не только клетки, высвобожденные из пульпы зуба, но также кусочки ткани пульпы зуба.
Суспензию пульпы зуба, полученную путем суспендирования разобранной пульпы зуба в среде для культивирования клеток, добавляют в планшет для культивирования клеток и культивируют в нем. Среда для культивирования клеток, используемая для этого, предпочтительно представляет собой среду Игла, модифицированную Дульбекко, к которой добавляется фетальная бычья сыворотка. Концентрация (об./об.%) фетальной бычьей сыворотки, добавляемой в среду, предпочтительно составляет от 8% до 25% и более предпочтительно от 10% до 25%, и составляет, например, 20%. Пример подробной композиции среды Игла, модифицированной Дульбекко (до добавления фетальной телячьей сыворотки), представлен в Таблице 1. Соответственно, к среде можно добавить от 3 до 5 мМ, например, 4 мМ L-аланил-L-глутамина. Кроме того, при желании в среду можно добавить антибиотик, такой как стрептомицин. В случае, когда в среду добавляют стрептомицин, его концентрация в среде устанавливается от 10 мг/л до 250 мг/л, например, 100 мг/л. Кроме того, каждый компонент может быть заменен его эквивалентом, например, его солью.
В случае культивирования суспензии пульпы зуба, полученной из одного удаленного зуба, например, третьего коренного зуба взрослого человека, в планшете для культивирования клеток, площадь культивирования в планшете предпочтительно составляет от 0,3 до 4 см2 и более предпочтительно от 0,6 до 2 см2 и составляет, например, 1 см2. Количество среды, добавляемой в планшет для культивирования клеток, предпочтительно составляет от 250 мкл до 1 мл на 1 см2 площади культивирования, например, 500 мкл. Например, суспензия пульпы зуба, полученная из третьего коренного зуба взрослого человека и суспендированная в среде объемом 500 мкл, добавляется в планшет для культивирования клеток, имеющий площадь культивирования 1 см2, для культивирования клеток.
Таблица 1. Состав среды Игла, модифицированной Дульбекко
Температура, при которой суспензия пульпы зуба культивируется в планшете для культивирования клеток, предпочтительно составляет от 35°C до 37,5°C, например, 37°C.
Культивирование суспензии пульпы зуба проводят, например, до тех пор, пока клетки не начнут пролиферировать с образованием колонии видимого размера в планшете. Колония в это время образует по существу круглую форму, если смотреть сверху, и ее диаметр составляет от около 1 до 3 мм. Однако настоящее изобретение этим особо не ограничивается. Например, колония может быть неупорядоченной. Среду заменяют свежей средой во время культивирования суспензии пульпы зуба, чтобы компоненты оставались в определенных пределах. Среда заменяется, например, каждые 1-6 дней, 2-4 дня, 1 день, 2 дня, 3 дня или 4 дня. Все количество или часть среды может быть заменена свежей средой. В случае замены части среды свежей средой, например, от 1/4 до 4/5, 1/4, 1/3, 1/2 или 4/5 количества старой среды удаляют, а затем добавляют свежую среду в равном количестве. Плавающие клетки, кусочки ткани и т.п., которые содержались в суспензии пульпы зуба, также могут быть удалены в процессе этой замены среды.
Клетки, которые сформировали колонию в планшете для культивирования клеток в результате культивирования суспензии пульпы зуба, можно обработать протеазой, чтобы их можно было отделить от планшета и собрать. Используемая в настоящее время протеаза ничем особо не ограничивается при условии, что она может разлагать белковые молекулы адгезии клеток, но предпочтительно представляет собой сериновую протеазу, а более предпочтительно трипсин. В случае использования трипсина его концентрация составляет предпочтительно от 0,1% до 0,5% (масс./об.) и более предпочтительно 0,25% (масс./об.).
Клетки, собранные из описанного выше планшета, суспендируют в среде для культивирования клеток и затем добавляют в планшет для культивирования клеток, чтобы начать культивирование в планшете. Это называется исходной культурой клеток. Среда, используемая в это время, предпочтительно представляет собой среду Игла, модифицированную Дульбекко, к которой добавляется фетальная бычья сыворотка. Концентрация (об./об.%) фетальной бычьей сыворотки, добавляемой в среду, предпочтительно составляет от 8% до 25% и более предпочтительно от 8% до 20%, и составляет, например, 10%. Пример подробной композиции среды Игла, модифицированной Дульбекко (до добавления фетальной телячьей сыворотки), представлен в Таблице 1. Соответственно, к среде можно добавить от 3 до 5 мМ, например, 4 мМ L-аланил-L-глутамина. Кроме того, при желании в среду можно добавить антибиотик, такой как стрептомицин. Однако обычно в среду не добавляют антибиотик. В случае, когда в среду добавляют стрептомицин, к ней добавляют стрептомицин так, чтобы его концентрация составляла от 10 мг/л до 250 мг/л, например, 100 мг/л. Кроме того, каждый компонент может быть заменен его эквивалентом, например, его солью.
При запуске описанной выше исходной клеточной культуры клетки добавляются так, чтобы плотность живых клеток в планшете для культивирования клеток составляла предпочтительно от 2000 до 30 000 клеток/см2 и более предпочтительно от 3000 до 20000 клеток/см2, и составляла, например, 3000 клеток/см2, 5000 клеток/см2, 10000 клеток/см2 или 20 000 клеток/см2. Среду заменяют во время культивирования клеток, чтобы компоненты оставались в определенных пределах. В это время среда заменяется, например, каждые 1-6 дней, 2-4 дня, 1 день, 2 дня, 3 дня или 4 дня. Все количество или часть среды может быть заменена свежей средой. В случае замены части среды свежей средой, например, от 1/4 до 4/5, 1/4, 1/3, 1/2 или 4/5 количества старой среды удаляют, а затем добавляют свежую среду в равном количестве. Плавающие клетки и т.п., содержащиеся в исходных клетках, удаляются в процессе этой замены среды, и в результате отбираются клетки, прилипшие к планшету для культивирования клеток.
Первоначальное культивирование клеток проводят до тех пор, пока клетки в планшете для культивирования клеток предпочтительно не станут почти конфлуентными. Например, культивирование проводят до тех пор, пока, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% поверхности планшета для культивирования клеток, на которой могут быть прикреплены клетки, не будет приходиться на клетки. Клетки, которые культивировались до тех пор, пока клетки не стали почти конфлуентными в планшете для культивирования клеток, можно обработать протеазой, чтобы их можно было отделить от планшета и собрать. Используемая в настоящее время протеаза ничем особо не ограничивается при условии, что она может разлагать белковые молекулы адгезии клеток, но предпочтительно представляет собой сериновую протеазу, а более предпочтительно трипсин. В случае использования трипсина его концентрация составляет предпочтительно от 0,1% до 0,5% (масс./об.) и более предпочтительно 0,25% (масс./об.).
После того, как клетки, собранные из описанного выше планшета, снова суспендировали в среде для культивирования клеток, клетки добавляли в планшет для культивирования клеток и затем культивировали в планшете. Среда, используемая в это время, предпочтительно представляет собой среду Игла, модифицированную Дульбекко, к которой добавляется фетальная бычья сыворотка. Концентрация (об./об.%) фетальной бычьей сыворотки, добавляемой в среду, предпочтительно составляет от 8% до 25% и более предпочтительно от 8% до 20%, и составляет, например, 10%. Пример подробной композиции среды Игла, модифицированной Дульбекко (до добавления фетальной телячьей сыворотки), представлен в Таблице 1. Соответственно, к среде может быть добавлено от 3 до 5 мМ, например, 4 мМ L-аланил-L-глутамина. Кроме того, при желании в среду можно добавить антибиотик, такой как стрептомицин. Однако обычно в среду не добавляют антибиотик. В случае, когда в среду добавляют стрептомицин, к ней добавляют стрептомицин так, чтобы концентрация стрептомицина в среде составляла от 10 мг/л до 250 мг/л, например, 100 мг/л. Кроме того, каждый компонент может быть заменен его эквивалентом, например, его солью. Культивирование клеток проводится до тех пор, пока клетки в планшете для культивирования клеток не станут почти конфлуентными. Например, культивирование проводят до тех пор, пока, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% поверхности планшета для культивирования клеток, на которой могут быть прикреплены клетки, не будет приходиться на клетки.
Повторяя сбор клеток из планшета для культивирования клеток и культивирование в планшете для культивирования клеток, можно увеличить количество клеток, полученных из пульпы зуба. Кроме того, плавающие клетки удаляются путем замены среды во время культивирования, и клетки, прилипшие к планшету для культивирования клеток, предпочтительно собираются (в результате отбираются). Поскольку плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, обладают способностью прикрепляться к планшету для культивирования клеток, плюрипотентные стволовые клетки обогащаются повторением этого процесса. То есть клетки, которые прошли стадию культивирования суспензии пульпы зуба в планшете для культивирования клеток и стадию сбора клеток с планшета после культивирования, представляют собой клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками. Повторяя сбор клеток из планшета для культивирования клеток и культивирование клеток на нем, плюрипотентные стволовые клетки дополнительно обогащаются.
Сбор клеток с планшета для культивирования клеток и культивирование клеток на нем предпочтительно повторяют от 3 до 20 раз, более предпочтительно повторяют от 3 до 8 раз, а еще более предпочтительно от 4 до 8 раз, включая исходную культуру клеток, и повторяются, например, 4, 5, 6, 7 или 8 раз. Большинство клеток, которые могут быть получены путем пролиферации в планшете для культивирования клеток, представляют собой плюрипотентные клетки, происходящие из пульпы зуба, демонстрирующие, по существу, веретеновидную форму при наблюдении с помощью оптического микроскопа по завершении начального культивирования клеток, но также включают другие клетки. Путем повторения сбора клеток из планшета для культивирования клеток и культивирования клеток на нем 3 раза плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, обогащаются до тех пор, пока эти клетки в основном не будут приходиться на долю плюрипотентных клеток, полученных из пульпы зуба. Когда сбор клеток с планшета для культивирования клеток и культивирование клеток на нем повторяются 5 или более раз, плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, дополнительно обогащаются, а клетки, отличные от плюрипотентных клеток, полученных из пульпы зуба, демонстрирующих, по существу, веретенообразную форму при наблюдении с помощью оптического микроскопа, наблюдаются редко. То есть, при повторе сбора клеток из планшета для культивирования клеток и культивирования клеток на нем 5 или более раз, по существу выделяются плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба.
Доля плюрипотентных стволовых клеток, полученных из пульпы зуба, во всех клетках, содержащихся в клетках, полученных таким образом, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, производными пульпы зуба, предпочтительно больше или равна 99%, более предпочтительно больше или равна 99,5%, еще более предпочтительно больше или равна 99,9% и еще более предпочтительно больше или равна 99,95%. Доля плюрипотентных стволовых клеток, полученных из пульпы зуба, может быть получена, например, путем деления количества клеток, демонстрирующих, по существу, веретеновидную форму при наблюдении с помощью оптического микроскопа, на количество всех клеток.
Полученные таким образом клетки пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, могут быть криоконсервированы в состоянии суспендирования в криоконсервирующей жидкости. Для криоконсервации среднее время удвоения клеток в планшете для культивирования клеток предпочтительно составляет в пределах 96 часов, более предпочтительно в пределах 84 часов, еще более предпочтительно в пределах 72 часов, еще более предпочтительно в пределах 48 часов и особенно предпочтительно, например, в пределах 36 часов или 24 часов. Для среднего времени удвоения может быть установлен стандарт, и клетки, имеющие среднее время удвоения в течение определенного времени, могут быть криоконсервированы и использованы после этого. Такой стандарт может быть соответствующим образом установлен, например, в пределах 84 часов, 72 часов или 48 часов. Клетки, которые не соответствуют этим стандартным значениям, могут быть отброшены без криоконсервации, чтобы выборочно сохранить только клетки, способные подвергаться делению клеток определенное количество раз или более. Можно сказать, что чем меньше среднее время удвоения клеток, тем выше их способность к делению.
Композиция жидкости для криоконсервации, используемой в настоящее время, особо ничем не ограничен при условии, что клетки млекопитающих, в частности клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками человека, можно замораживать и размораживать без их гибели. Жидкость для криоконсервации включает цитопротекторный агент. Цитопротекторные агенты выполняют, например, функцию подавления образования кристаллов льда внутри клеток и разрушения клеток при замораживании клеток. Подходящие примеры цитопротекторных агентов включают диметилсульфоксид (DMSO), этиленгликоль, пропиленгликоль, серицин и глицерин. Два или более из них можно комбинировать и использовать в качестве цитопротекторного агента. В случае использования диметилсульфоксида в качестве цитопротекторного агента его концентрация предпочтительно составляет от 5% до 15% (об./об.), и более предпочтительно от 9% до 11% (об./об.), и составляет, например, 10% (об./об.). Жидкость для криоконсервации может включать буферный агент. Буферный агент, который может регулировать pH водного раствора от 6 до 8, например, от 6,8 до 7,8, является предпочтительным. Примеры таких буферных агентов включают агенты, содержащие ионы карбоната, ионы цитрата и ионы натрия. Жидкость для криоконсервации может дополнительно включать человеческий сывороточный альбумин. В случае использования человеческого сывороточного альбумина его концентрация предпочтительно составляет от 40 до 100 г/л и более предпочтительно от 46 до 56 г/л, и может быть, например, составлять 51 г/л. Раствор, полученный путем добавления раствора человеческого сывороточного альбумина и диметилсульфоксида к бикарбонатному раствору Рингера, описанному ниже, является подходящим примером жидкости для криоконсервации. И жидкость для криоконсервации промежуточных клеток, и жидкость для криоконсервации клеток препарата, которые будут описаны ниже, являются жидкостями для криоконсервации. В случае получения стадии замораживания промежуточных клеток в производственном процессе, первая для удобства называется первой жидкостью для криоконсервации (жидкость для криоконсервации промежуточных клеток), а вторая - второй жидкостью для криоконсервации (жидкость для криоконсервации клеток препарата).
Криоконсервированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, могут быть использованы в качестве клеточного препарата, полученных из пульпы зуба, который будет описан ниже, или промежуточных клеток (которые сохраняются для дополнительной пролиферации позднее). Случай криоконсервации клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, в качестве промежуточных клеток, будет подробно описан ниже.
В случае криоконсервации клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, в качестве промежуточных клеток (в дальнейшем именуемого «случай, когда клетки замораживают как промежуточные клетки»), сбор клеток из планшета для культивирования клеток, и культивирование клеток на нем, повторяют предпочтительно от 3 до 8 раз и более предпочтительно от 4 до 8 раз, например, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз или 8 раз, включая исходную культуру клеток.
Кроме того, в случае замораживания клеток в качестве промежуточных клеток, клетки, собранные из колонии, образовавшейся в планшете для культивирования клеток, посредством культивирования суспензии пульпы зуба, культивируют в планшете для культивирования клеток до тех пор, пока клетки не замораживают, и предпочтительно вызвать, по меньшей мере, 10 делений и более предпочтительно вызвать, по меньшей мере, 15 делений. Например, клетки, которые претерпели деления 13-20 раз, 13-23 раз или 14-20 раз, подвергаются криоконсервации. Теоретически количество клеток, подвергшихся 15 делениям, увеличивается в 3 x 104 и более раз.
Кроме того, в случае замораживания клеток в качестве промежуточных клеток, клетки обычно размножаются до тех пор, пока количество клеток, полученных из одного удаленного зуба (например, третьего коренного зуба), предпочтительно не станет 3 × 105 или более, более предпочтительно 1 × 106 или более, а еще более предпочтительно 1 × 109 или более.
Кроме того, для криоконсервации клеток в качестве промежуточных клеток среднее время удвоения клеток в планшете для культивирования клеток предпочтительно составляет в пределах 96 часов, более предпочтительно в пределах 84 часов, еще более предпочтительно в пределах 72 часов, еще более предпочтительно в пределах 48 часов. часов, и особенно предпочтительно, например, в пределах 24 часов или 36 часов. Для среднего времени удвоения может быть установлен стандарт, и клетки, имеющие среднее время удвоения в течение определенного времени, могут быть криоконсервированы и использованы после этого. Такой стандарт может быть соответствующим образом установлен, например, в пределах 84 часов, 72 часов или 48 часов. Клетки, которые не соответствуют этим стандартным значениям, могут быть отброшены без криоконсервации, чтобы выборочно сохранить только клетки, способные подвергаться делению клеток определенное количество раз или более. Можно сказать, что чем меньше среднее время удвоения у клеток, тем выше их способность к делению.
В случае замораживания клеток в качестве промежуточных клеток, клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые были сняты и собраны с планшета для культивирования клеток посредством обработки протеазой, промываются промывочным раствором перед криоконсервацией. Промывочный раствор, используемый в настоящее время, предназначен для достаточного удаления среды и протеазы, и его композиция ничем особо не ограничивается. В качестве промывочного раствора можно использовать физиологический раствор, физиологический раствор с фосфатным буфером, ацетатный раствор Рингера, бикорбанатный раствор Рингера и т.п., но предпочтительно использовать раствор, полученный путем добавления человеческого сывороточного альбумина к бикарбонатному раствору Рингера. Можно использовать имеющиеся в продаже ацетатные растворы Рингера и бикарбонатные растворы Рингера. Например, PLASMA-LYTE (зарегистрированная торговая марка) A (Baxter) и Physio (зарегистрированная торговая марка) 140 (Otsuka Holdings Co., Ltd.) могут использоваться в качестве ацетатных растворов Рингера, а BICARBON (зарегистрированная торговая марка) для инъекций (AJINOMOTO CO., INC.) можно использовать как бикарбонатный раствор Рингера. Подходящие примеры компонентной композиции и концентрации электролита бикарбонатного раствора Рингера показаны соответственно в таблицах 2 и 3.
Таблица 2. Компонентная композиция бикарбонатного раствора Рингера
Таблица 3. Концентрация электролитов в бикарбонатном растворе Рингера
Кроме того, подходящий пример компонентной композиции промывочного раствора, полученного путем добавления человеческого сывороточного альбумина к бикарбонатному раствору Рингера, показан в таблице 4. Кроме того, в таблице 5 показан подходящий пример концентрации электролитов, содержащихся в промывочном растворе, полученном добавлением человеческого сывороточного альбумина к бикарбонатному раствору Рингера. Ацетилтриптофан натрия и каприлат натрия могут быть исключены из компонентов промывочного раствора, показанных в Таблицах 4 и 5.
Таблица 4. Компонентная композиция промывочного раствора
(Примечание) В таблице единицей концентрации сывороточного альбумина человека является г/л.
Таблица 5. Концентрация электролитов, содержащихся в промывочном растворе (без альбумина)
В случае замораживания клеток в качестве промежуточных клеток, клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, после промывки промывочным раствором собираются один раз таким способом, как центрифугирование. Собранные клетки подвергаются криоконсервации в состоянии суспензии (промежуточная суспензия клеток). Однако промежуточная суспензия клеток может быть приготовлена путем изменения состава раствора, в котором клетки суспендированы, без сбора клеток с использованием ультрафильтрационной мембраны или чего-либо подобного, и может быть криоконсервирована. Композиция части раствора (криоконсервирующая жидкость для промежуточных клеток) промежуточной клеточной суспензии особо не ограничивается при условии, что клетки млекопитающих, в частности клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками человека, можно замораживать и размораживать без гибели. Жидкость для криоконсервации промежуточных клеток содержит цитопротекторный агент. Цитопротекторные агенты выполняют, например, функцию подавления образования кристаллов льда внутри клеток и разрушения клеток при замораживании клеток. Подходящие примеры цитопротекторных агентов включают диметилсульфоксид (DMSO), этиленгликоль, пропиленгликоль, серицин и глицерин. Два или более из них можно комбинировать и использовать в качестве цитопротекторного агента. В случае использования диметилсульфоксида в качестве цитопротекторного агента его концентрация предпочтительно составляет от 5% до 15% (об./об.), и более предпочтительно от 9% до 11% (об./об.), и составляет, например, 10% (об./об.). Жидкость для криоконсервации может включать буферный агент. Буферный агент, который может регулировать pH водного раствора от 6 до 8, например, от 6,8 до 7,8, является предпочтительным. Примеры таких буферных агентов включают агенты, содержащие ионы карбоната, ионы бикарбоната, ионы цитрата и ионы натрия. Жидкость для криоконсервации промежуточных клеток может дополнительно содержать сывороточный альбумин человека. В случае использования человеческого сывороточного альбумина его концентрация предпочтительно составляет от 40 до 100 г/л и более предпочтительно от 46 до 56 г/л, и может быть, например, составлять 51 г/л.
Продукт, полученный путем добавления раствора человеческого сывороточного альбумина и диметилсульфоксида к бикарбонатному раствору Рингера, является подходящим примером жидкости для криоконсервации промежуточных клеток. Жидкость для криоконсервации промежуточных клеток содержит от 59 до 80,4 мМ хлорида натрия, от 2,3 до 3,08 мМ хлорида калия, от 0,85 до 1,16 мМ дигидрата хлорида кальция, от 0,28 до 0,385 мМ гексагидрата хлорида магния, от 14 до 19,2 мМ гидрокарбоната натрия, от 0,94 до 1,28 мМ дигидрата цитрата натрия, от 46 до 56 г/л сывороточного альбумина человека, от 3,73 до 4,55 мМ ацетилтриптофана натрия, от 3,74 до 4,58 мМ каприлата натрия и от 9% до 11% (об./об.) DMSO. Подходящий пример состава жидкости для криоконсервации промежуточных клеток показан в Таблице 6. То есть состав криоконсервирующей жидкости для промежуточных клеток состоит по существу от 65,8 до 80,4 мМ хлорида натрия, от 2,52 до 3,08 мМ хлорида калия, от 0,95 до 1,16 мМ дигидрата хлорида кальция, от 0,315 до 0,385 мМ гексагидрата хлорида магния, от 15,7 до 19,2 мМ гидрокарбоната натрия, от 1,04 до 1,28 мМ дигидрата цитрата натрия, от 46 до 56 г/л человеческого сывороточного альбумина, от 3,73 до 4,55 мМ ацетилтриптофана натрия, от 3,74 до 4,58 мМ каприлата натрия и от 9% до 11% (об./об.) DMSO. Среди них можно исключить ацетилтриптофан натрия и каприлат натрия. Отношение осмотического давления жидкости для криоконсервации промежуточных клеток к физиологическому раствору предпочтительно составляет от 0,9 до 1,1.
Кроме того, раствор, содержащий ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, сывороточный альбумин человека и диметилсульфоксид, может подходящим образом использоваться в качестве жидкости для криоконсервации промежуточных клеток. Например, раствор, содержащий ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, сывороточный альбумин человека и диметилсульфоксид, соответственно, в концентрациях от 91 до 113 мМ, от 2,52 до 3,08 мМ, от 0,95 до 1,16 мМ, от 0,315 до 0,385 мМ, от 15,6 до 19,2 мМ, от 1,04 до 1,28 мМ, от 46 до 56 г/л и от 9% до 11% (об./об.), является подходящим примером этого. Кроме того, например, раствор, содержащий ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, сывороточный альбумин человека и диметилсульфоксид, соответственно, в концентрациях от 100 до 102 мМ, от 2,71 до 2,77 мМ, 1,01 до 1,03 мМ, от 0,335 до 0,345 мМ, от 16,9 до 17,2 мМ, от 1,13 до 1,15 мМ, от 52,2 до 54,3 г/л и от 10,3 до 10,9% (об./об.), является еще одним подходящим примером этого. Кроме того, например, раствор, содержащий ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, человеческий сывороточный альбумин и диметилсульфоксид, соответственно, в концентрациях 102 мМ, 2,80 мМ, 1,05 мМ, 0,35 мМ, 17,4 мМ, 1,16 мМ, 51 г/л и 10% (об./об.), является еще одним подходящим примером этого. Кроме того, например, раствор, содержащий ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, сывороточный альбумин человека и диметилсульфоксид, соответственно, в концентрациях 101 мМ, 2,77 мМ, 1,03 мМ, 0,34 мМ, 17,2 мМ, 1,15 мМ, 52 г/л и 10% (об./об.) является еще одним подходящим примером этого. В случае, когда жидкость для криоконсервации промежуточных клеток дополнительно включает ацетилтриптофан или его соль, его концентрация предпочтительно составляет от 3,73 до 4,55 мМ или от 4,24 до 4,41 мМ, и составляет, например, 4,14 мМ или 4,24 мМ. В случае, когда жидкость для криоконсервации промежуточных клеток дополнительно включает каприловую кислоту или ее соль, ее концентрация предпочтительно составляет от 3,74 до 4,58 мМ или от 4,25 до 4,43 мМ, и составляет, например, 4,16 мМ или 4,25 мМ.
Таблица 6. Компонентная композиция криоконсервирующей жидкости для промежуточных клеток
(Примечание) Единица концентрации человеческого сывороточного альбумина - г/л, единица концентрации DMSO -% (об./об.).
В случае замораживания клеток в качестве промежуточных клеток плотность клеток в суспензии, в которой клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, суспендированы в криоконсервирующей жидкости для промежуточных клеток, особо ничем не ограничена, но предпочтительно составляет 2 от x 106 до 8 x 107 клеток/мл, более предпочтительно от 4 x 106 до 3 x 107 клеток/мл, и еще более предпочтительно от 8 x 106 до 2 x 107 клеток/мл, и составляет, например, 1,1 x 5 107 клеток/мл. Клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, суспендированные в криоконсервирующей жидкости для промежуточных клеток, помещаются в контейнер для криоконсервации клеток, а затем подвергаются криоконсервации.
При этом количество клеточной суспензии, которое необходимо распределить в одном контейнере для криоконсервации клеток необходимо соответствующим образом отрегулировать в зависимости от применения и т.п., и предпочтительно составляет от 1 до 20 мл. Кроме того, количество клеток, которые должны быть помещены в один контейнер для криоконсервации клеток, предпочтительно составляет от 5 x 106 до 9,2 x 108.
Контейнер, используемый в качестве контейнера для криоконсервации клеток, ничем особо не ограничен при условии, что материал демонстрирует долговечность при низких температурах и контейнер не повреждается, даже если его содержимое замораживается и оттаивается. Имеющиеся в продаже контейнеры также можно использовать в качестве контейнеров для криоконсервации. Например, криопробирки из стекла и пластика (например, из полиолефиновой смолы) могут быть подходящим образом использованы в качестве контейнеров для криоконсервации клеток. В данном случае флакон, материал которого представляет собой, в частности, боросиликатное стекло, может быть подходящим образом использован в качестве контейнера из стекла. Кроме того, в данном документе полиолефиновая смола включает полиэтилен, полиэтилен высокой плотности, полиэтилен низкой плотности, полипропилен, сополимер, состоящий из этилена и пропилена, и термопластичный эластомер. Замораживание клеток предпочтительно выполняется путем распределения клеточной суспензии в контейнер для криоконсервации клеток с последующим постепенным понижением температуры. Например, способ понижения температуры со скоростью от 1°C в минуту до -6°C и последующего быстрого замораживания клеток может быть использован как способ замораживания клеток. Клетки хранятся в замороженном состоянии. Температура, при которой клетки подвергаются криоконсервации, предпочтительно ниже или равна -130°C, более предпочтительно ниже или равна -170°C и еще более предпочтительно ниже или равна -180°C. Например, клетки могут быть сохранены в состоянии, в котором контейнер для криоконсервации клеток погружен в жидкий азот (точка кипения: -196°C).
Такие клетки, криоконсервированные в качестве промежуточных клеток, размораживают при использовании для использования на следующей стадии получения клеточного препарата, полученных из пульпы зуба.
Обеспечение стадии временного сохранения пролиферированных клеток в качестве промежуточных клеток в процессе получения клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, является чрезвычайно важным с точки зрения управления процессом клеток, полученных из пульпы пульпы, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками. Например, в случае, когда желаемое количество удаленных зубов не может быть получено за один раз, если культивирование клеток, полученных из пульпы зуба, начинается в любой момент времени с использованием полученных удаленных зубов в качестве сырья для производства конечных продуктов, размеры партий конечных продуктов имеют небольшие размеры, и управление партиями становится сложным. Однако, если промежуточные клетки производятся и сохраняются, как только промежуточные клетки накапливаются до определенного количества, следующий производственный процесс может быть запущен с этими промежуточными клетками как одной партией. Таким образом, можно увеличить размер партии готовой продукции, и управление партиями станет проще.
Кроме того, обеспечивая стадию сохранения клеток в качестве промежуточных клеток, можно выполнять тесты качества на свойства и т.п. клеток на промежуточной стадии производственного процесса. Соответственно, только когда клетки, полученные в качестве промежуточных клеток, соответствуют желаемым стандартам качества, клетки можно использовать для следующего производственного процесса. То есть клетки, которые не соответствуют желаемым стандартам качества во время, до или после завершения процесса производства промежуточных клеток, могут быть исключены. Соответственно, клетки, не соответствующие желаемым стандартам качества, не переносятся на последующие стадии. Следовательно, можно увеличить вероятность производства конечной продукции, отвечающей желаемым стандартам качества. То есть можно увеличить урожай на момент производства и снизить производственные затраты.
Криоконсервация клеток в процессе производства обычно связана с риском изменения свойств клеток до и после замораживания клеток. Кроме того, способность клеток к пролиферации иногда ухудшается после криоконсервации. Напротив, в клетках, полученных в качестве промежуточных клеток по настоящему изобретению, не распознается ни изменение свойств клеток до и после замораживания, ни ухудшение способности к пролиферации после криоконсервации.
Клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, предпочтительно имеют высокую долю живых клеток, содержащихся в клетках. Доля (жизнеспособность клеток) живых клеток перед криоконсервацией предпочтительно больше или равна 50%, более предпочтительно больше или равна 60%, и еще более предпочтительно больше или равна 70%, и предпочтительно, например, больше или равно 80%, больше или равно 90% или больше или равно 95%. Также возможно сохранить только клетки, имеющие определенное или большее значение жизнеспособности клеток перед криоконсервацией в качестве промежуточных клеток в соответствии с надлежащим образом установленными стандартами.
Клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, предпочтительно претерпевают, по меньшей мере, 10 клеточных делений в среде in vitro. Например, клетки претерпевают как минимум 15, 16 или 17 клеточных делений. Среднее время деления клеток в течение периода деления клеток предпочтительно составляет 48 часов.
В настоящем изобретении вызывание деления клеток в среде in vitro означает, что, например, деление клеток происходит в состоянии, когда клетки добавляются в контейнер для культивирования, такой как колба для культивирования клеток, вместе со средой для культивирования клеток. Температура культивирования в это время составляет предпочтительно от 34°C до 38°C и более предпочтительно от 36°C до 38°C, и составляет, например, 37°C. Кроме того, клетки предпочтительно культивируют во влажной среде в присутствии 5% CO2. Среда для культивирования клеток, используемая в настоящее время, ничем особо не ограничен, при условии, что она может использоваться для культивирования клеток млекопитающих, и представляет собой, например, модифицированную по Дульбекко среду Игла (DMEM), содержащую фетальную бычью сыворотку (FBS). Концентрация FBS, содержащегося в среде, предпочтительно составляет от 2% до 20%, более предпочтительно от 5% до 20%, а еще более предпочтительно от 8% до 15% и составляет, например, 10%. Кроме того, концентрация глюкозы в DMEM составляет от 5 до 20 мМ, например, 5 мМ. Примеры подходящих условий культивирования включают температуру культивирования 37°C, влажную среду в присутствии 5% CO2 и DMEM, содержащую около 5 мМ глюкозы и 10% FBS в качестве среды. Способ культивирования клеток, полученных из пульпы зуба, описанный в Примере 5 (то есть в планшете для культивирования клеток, среда DMEM, которая содержит 5,56 мМ глюкозы и к которой добавлено 10% FBS, в присутствии 5% CO2 и 37°C) является примером подходящего способа, вызывающего деление клеток в среде in vitro.
Субкультивирование клеток в случае, когда клетки делятся в среде in vitro, выполняется таким образом, чтобы клетки отделялись от контейнера для культивирования, а затем засевались в новый контейнер для культивирования так, чтобы от 1/20 до 1/3 нижней части культурального контейнера была покрыта клетками. В случае, когда, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80% или, по меньшей мере, 90% нижней части контейнера для культивирования покрыто клетками из-за деления клеток, пересевание повторяют.
В одном воплощении, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, культивируют в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в хондроциты, в целом наблюдается повышение уровня экспрессии аггрекана. Кроме того, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, культивируют в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в остеоциты, в целом наблюдается увеличение количества накапливаемого в клетках кальция. То есть клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и остеоциты при наблюдении в целом.
В одном воплощении, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD34 и CD45 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Например, когда клетки наблюдаются в целом, клетки являются положительными по CD73 и CD90 и отрицательными по CD34 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Кроме того, например, когда клетки наблюдаются в целом, клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, эти клетки, например, являются отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD40, CD80, CD86, и антигена MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Например, когда клетки наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными по антигену CD40, CD80, CD86 и MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Известно, что когда клетки, положительные по этим маркерам поверхностных антигенов, трансплантируются аллогенным индивидуумам, клетки имеют тенденцию распознаваться как антиген, который необходимо исключить из живого организма. В случае, когда клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному из этих маркеров поверхностных антигенов, это означает, что клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, обладают свойством низкой иммуногенности до такой степени и и вряд ли будут исключаться из живого организма при трансплантации аллогенным индивидуумам. Кроме того, клетки могут оставаться отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и быть положительными по антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов, когда клетки стимулируются IFN-γ. Например, клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и являются положительными по антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов, когда клетки стимулируются IFN-γ.
В одном воплощении, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, эти клетки являются, например, положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34, CD40, CD45, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Кроме того, клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются IFN-γ.
В одном воплощении, касательно характеристики (b-1), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD47, CD81, CD90, CD147 и HLA-A, -B и -C в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
Кроме того, в одном воплощении, касательно характеристики (b-2), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны сохраняться в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD29, CD46, CD55, CD59, CD73 и CD140b в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
Кроме того, в одном воплощении, касательно характеристики (b-3), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны сохраняться в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD9, CD44, CD49b, CD49c, CD98 и EGF-R в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 65%, более предпочтительно, по меньшей мере, 75% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
Кроме того, в одном воплощении, касательно характеристики (b-4), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны сохраняться в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD49f и CD166 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 75% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
Кроме того, в одном воплощении, касательно характеристики (b-5), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны сохраняться в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD10, CD13, CD58, CD63, CD105, CD151 и CD164 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 65%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 70% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, предпочтительно имеют две или более, более предпочтительно три или более, а еще более предпочтительно все характеристики, показанные в описанных выше (b-1), (b-2), (b-3), (b-4) и (b-5). Например, клетки, имеющие характеристики, показанные в описанных выше (b-1) и (b-2), являются подходящим воплощением настоящего изобретения.
В одном воплощении, касательно характеристики (b-6), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, эти клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD120b, CD132, CD158a, CD161, CD184, CD195, CD206, CD210, CD212, CD226, CD244, CD267, CD278, CD279, CD282, CD294, NKB1, SSEA-1, TRA-1-60, TRA-1- 81, Vp23, SSEA-3, CLA и интегрина β7 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно не более 10%, более предпочтительно не более 5% и еще более предпочтительно не более 2% и еще более предпочтительно не более 1% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, касательно характеристики (b-7), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD8b, CD11b, CD15, CD16, CD19, CD24, CD31, CD32, CD62E, CD62P, CD66f, CD86, CD88, CD94, CD100, CD103, CD104, CD114, CD117, CD118, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD126, CD127, CD128b, CD135, CD137, лиганд CD137, CD150, CD163, CD172b, CD177, CD178, CD180, CD197, CD220, CD229, CD231, CD255, CD268, CD305, CD314, CD321, CDw3327, CDw3327, CD7, CD336, BLTR-1, CLIP, CMRF-44, CMRF-56, fMLP-R, Vβ8, инвариантного NKT и γδ TCR в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно не более 10%, более предпочтительно не более 5% и еще более предпочтительно не более 2% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, касательно характеристики (b-8), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны сохраняться в качестве промежуточных клеток, наблюдаемых в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа: CD1a, CD1b, CD1d, CD2, CD3, CD5, CD6, CD7, CD8a, CD11c, CD15, CD18, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27, CD28, CD33, CD34, CD35, CD37, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42b, CD45, CD45RB, CD45RO, CD48, CD50, CD53, CD62L, CD64, CD66 (a, c, d, e), CD69, CD70, CD72, CD74, CD80, CD84, CD85, CD87, CD89, CDw93, CD97, CD106, CD134, CD138, CD141, CD144, CD154, CD158b, CD162, CD183, CD205, CD235a, CD271, CD309, CD326, CD337, αβ TCR и антигена MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеры поверхностного антигена.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно только, по большей мере, 10% и более предпочтительно только, по большей мере, 5% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, предпочтительно имеют две или более, более предпочтительно три или более, а еще более предпочтительно все характеристики, показанные в вышеописанных (b-1), (b-2), (b-3), (b-4), (b-5), (b-6), (b-7) и (b-8). Например, клетки, имеющие характеристики, показанные в описанных выше (b-1) и (b-6), являются подходящим воплощением настоящего изобретения.
В одном воплощении, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, эти клетки экспрессируют, например, простагландин E2 (PGE2) и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), а уровень экспрессии простагландина E2 (PGE2) увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, культивируют в присутствии IFN-γ, количество секретируемого кинуренина увеличивается.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD19, CD34 и CD206 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Кроме того, в другом воплощении клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD19, CD31, CD33, CD34, CD38, CD45, CD206, CD235a и SSEA-1 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, эти клетки являются, например, положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD34 и CD45 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34, CD40, CD45, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. При этом, например, клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются IFN-γ. Кроме того, клетки экспрессируют простагландин E2 (PGE2) и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), а количество секретируемого простагландина E2 (PGE2) увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α.
В одном воплощении, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, уровень экспрессии аггрекана увеличивается в случае, когда клетки культивируются в среде, содержащей вещество, которое, как известно, вызывает дифференцировку в хондроциты. Кроме того, в случае, когда клетки культивируются в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в остеоциты, количество накопленного в клетках кальция увеличивается. То есть клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и остеоциты при наблюдении в целом.
Способ, в котором только клетки, демонстрирующие определенные паттерны экспрессии, сохраняются в качестве промежуточных клеток в соответствии с надлежащим образом установленными стандартами на основе описанных выше паттернов экспрессии маркеров поверхностных антигенов, показанных клетками, полученными из пульпы зуба, обогащенными плюрипотентными стволовыми клетками настоящее изобретение и/или другие паттерны экспрессии генов также можно использовать для управления производственным процессом.
Клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, в основном могут приходиться на плюрипотентные стволовые клетки (плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба), полученные из пульпы зуба. Под оптическим микроскопом они наблюдаются как прикрепленные клетки по существу веретенообразной формы в плоской культуре, и доля по существу веретеновидных клеток во всех клетках предпочтительно больше или равна 99%, более предпочтительно больше или равна 99,5%, еще более предпочтительно больше или равно 99,9% и еще более предпочтительно больше или равно 99,95%. Доля плюрипотентных стволовых клеток, полученных из пульпы зуба, может быть получена путем деления количества клеток, демонстрирующих по существу веретеновидную форму при наблюдении с помощью оптического микроскопа, на количество всех клеток. Для управления производственным процессом также может использоваться способ, в котором только группы клеток, имеющие определенное значение или более доли по существу веретеновидных клеток, сохраняются в качестве промежуточных клеток в соответствии с надлежащим образом установленными стандартами на основе вышеизложенного.
В одном воплощении, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, подлежащие сохранению в качестве промежуточных клеток, наблюдают в целом, клетки предпочтительно обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и способностью дифференцироваться в остеоциты. То есть в случае, когда промежуточные клетки культивируют в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в хондроциты, уровень экспрессии аггрекана увеличивается. Кроме того, когда промежуточные клетки наблюдаются в целом, в случае, когда клетки культивируются в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в остеоциты, количество кальция, накопленного в клетках, увеличивается. Тот факт, что промежуточные клетки обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и способностью дифференцироваться в остеоциты, может быть исследован соответственно с помощью способов, описанных в примерах 20 и 19. Только группы клеток, у которых обнаружена способность дифференцироваться в хондроциты и способность дифференцироваться в остеоциты с помощью этих способов, можно рассматривать как промежуточные клетки, подлежащие сохранению. Однако способы исследования способности к дифференциации не ограничиваются способами, описанными в примерах 20 и 19. Только группы клеток, у которых обнаружена способность дифференцироваться в хондроциты и способность дифференцироваться в остеоциты другими подходящими способами, также можно рассматривать как промежуточные клетки, подлежащие сохранению.
В одном воплощении, клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, могут быть такими же или иметь практически те же свойства, что и промежуточные клетки, используемые на дальнейшей стадии культивирования, который будет подробно описан ниже.
Свойства клеток, криоконсервированных в качестве промежуточных клеток, предпочтительно сохраняются до и после оттаивания. То есть, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые были криоконсервированы в качестве промежуточных клеток, оттаивают, жизнеспособность, характер экспрессии маркеров поверхностных антигенов, морфология клеток и способность клеток к дифференцировке предпочтительно по существу такие же, как и у клеток перед оттаиванием. Только клетки со свойствами, сохраненными до и после оттаивания, могут использоваться для последующей стадии культивирования в качестве промежуточных клеток, проверяя свойства промежуточных клеток после оттаивания или при культивировании после оттаивания.
Жизнеспособность промежуточных клеток, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, после размораживания предпочтительно больше или равна 50%, более предпочтительно больше или равна 60% и еще более предпочтительно больше или равна 70%. %, и предпочтительно составляет, например, больше или равно 80%, больше или равно 90% или больше или равно 95%. Можно использовать только промежуточные клетки, имеющие определенное значение или большую жизнеспособность после размораживания для последующей стадии культивирования в соответствии с надлежащим образом установленными стандартами. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет по существу от 80% до 98% или от 85% до 95%.
Когда криоконсервированные в качестве промежуточных клеток клетки культивируют после размораживания, клетки предпочтительно обладают способностью претерпевать, по меньшей мере, 10 клеточных делений и более предпочтительно обладают способностью претерпевать, по меньшей мере, 15 клеточных делений и обладают, например, способностью пройти, по меньшей мере, 14 клеточных делений. Кроме того, когда клетки, замороженные в качестве промежуточных клеток, культивируют после размораживания, среднее время удвоения клеток в планшете для культивирования клеток предпочтительно составляет в пределах 96 часов, более предпочтительно в пределах 84 часов, еще более предпочтительно 72 часа, еще более предпочтительно 48 часов. и еще более предпочтительно в течение 36 часов. Например, могут быть установлены стандарты для способности деления клеток и среднего времени удвоения, и только клетки, которые обладают способностью осуществлять клеточное деление определенное количество раз или более и из которых среднее время удвоения находится в пределах определенного времени, могут быть использованы для последующего применения. Такие стандарты могут быть установлены соответствующим образом. Например, клетки, обладающие способностью претерпевать, по меньшей мере, 10 клеточных делений и имеющие среднее время удвоения в течение 96 часов, клетки, обладающие способностью претерпевать, по меньшей мере, 14 клеточных делений и имеющие среднее время удвоения в течение 72 часов, и клетки, обладающие способностью претерпевать не менее 15 клеточных делений и имеющие среднее время удвоения в течение 72 часов. Только промежуточные клетки, обладающие способностью претерпевать клеточные деления определенное количество раз или более, можно использовать для последующей стадии культивирования, не используя клетки, не соответствующие этим стандартам. Условия культивирования на этой стадии могут быть такими же или эквивалентными тем, которые описаны выше для клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками.
Клетки, подлежащие криоконсервации в качестве промежуточных клеток, предпочтительно претерпели, по меньшей мере, 10 клеточных делений в среде in vitro. Например, клетки претерпевают как минимум 15, 16 или 17 клеточных делений. Среднее время деления клеток в течение периода деления клеток предпочтительно составляет 48 часов.
Когда промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, культивируют в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в хондроциты, наблюдается повышение уровня экспрессии аггрекана в целом. Кроме того, когда клетки настоящего изобретения, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками культивируют в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в остеоциты, в целом наблюдается увеличение количества кальция, накопленного в клетках. Клетки обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и остеоциты при наблюдении в целом.
В одном воплощении, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD34 и CD45 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов после оттаивания клеток или при культивировании клеток после оттаивания. Например, клетки положительны по CD73 и CD90 и отрицательны по CD34. Кроме того, например, клетки положительны по CD73 и CD90 и отрицательны по CD34. Клетки положительны по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательны по CD34 и CD45.
Кроме того, в одном воплощении, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, для одного из антигенов CD40, CD80, CD86 и MHC-класса II в паттерны экспрессии маркеров поверхностных антигенов сразу после размораживания клеток или при культивировании клеток после размораживания. Например, клетки, отрицательные по CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II. Известно, что когда клетки, положительные по этим маркерам поверхностных антигенов, трансплантируются аллогенным индивидуумам, клетки имеют тенденцию распознаваться как антиген, который необходимо исключить из живого организма. В случае, когда клетки отрицательны по этим маркерам поверхностного антигена, это означает, что промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, являются гипоиммуногенными до такой степени и имеют тенденцию к более сложному исключению из живого организма при трансплантации аллогенным индивидуумам. Кроме того, клетки могут оставаться отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и быть положительными по антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов, когда клетки стимулируются IFN-γ. Например, клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и являются положительными по антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов, когда клетки стимулируются IFN-γ.
В одном воплощении, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом сразу после оттаивания или при культивировании после оттаивания, то эти клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34, CD40, CD45, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Кроме того, клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются IFN-γ.
В одном воплощении, касательно характеристики (c-1), когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD47, CD81, CD90, CD147 и HLA-A, -B и -C в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, касательно характеристики (c-2), когда промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD29, CD46, CD55, CD59, CD73 и CD140b в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, касательно характеристики (c-3), когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD9, CD44, CD49b, CD49c, CD98 и EGF-R в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 65%, более предпочтительно, по меньшей мере, 75% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, касательно характеристики (c-4), когда промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD49f и CD166 в паттерны экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 75% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
Кроме того, в одном воплощении, касательно характеристики (c-5), когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, которые должны быть сохранены в качестве промежуточных клеток, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD10, CD13, CD58, CD63, CD105, CD151 и CD164 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 65%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 70% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, предпочтительно имеют две или более, более предпочтительно три или более, а еще более предпочтительно все характеристики, показанные в описанных выше (c-1), (c-2), (c-3), (a-4) и (c-5). Например, клетки, имеющие характеристики, показанные в описанных выше (c-1) и (c-2), являются подходящим воплощением настоящего изобретения.
В одном воплощении, касательно характеристики (c-6), когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD120b, CD132, CD158a, CD161, CD184, CD195, CD206, CD210, CD212, CD226, CD244, CD267, CD278, CD279, CD282, CD294, NKB1, SSEA-1, TRA-1-60, TRA-1-81, Vp23, SSEA- 3, CLA и интегрина β7 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно не более 10%, более предпочтительно не более 5%, еще более предпочтительно не более 2% и еще более предпочтительно не более 1% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, касательно характеристики (c-7), когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD8b, CD11b, CD15, CD16, CD19, CD24, CD31, CD32, CD62E, CD62P, CD66f, CD86, CD88, CD94, CD100, CD103, CD104, CD114, CD117, CD118, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD126, CD127, CD128b, CD135, CD137, лиганда CD137, CD150, CD163, CD172b, CD177, CD178, CD180, CD197, CD220, CD229, CD231, CD255, CD268, CD305, CD314, CD321, CDw327, CDw328, CD329, CD335, CD335, CD1336 CLIP, CMRF-44, CMRF-56, fMLP-R, Vβ8, инвариантного NKT и γδ TCR в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно самое большее 10%, более предпочтительно самое большее 5% и еще более предпочтительно самое большее 2% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, касательно характеристики (c-8), когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки отрицательны, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD1a, CD1b, CD1d, CD2, CD3, CD5, CD6, CD7, CD8a, CD11c, CD15, CD18, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27, CD28, CD33, CD34, CD35, CD37, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42b, CD45, CD45RB, CD45RO, CD48, CD50, CD53, CD62L, CD64, CD66 (a, c, d, e), CD69, CD70, CD72, CD74, CD80, CD84, CD85, CD87, CD89, CDw93, CD97, CD106, CD134, CD138, CD141, CD144, CD154, CD158b, CD162, CD183, CD205, CD235a, CD271, CD309, CD326, CD337, αβ TCR и антигена MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно самое большее 10% и более предпочтительно самое большее 5% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, предпочтительно имеют две или более, более предпочтительно три или более, а еще более предпочтительно все характеристики, показанные в описанном выше (c-1), (c-2), (c-3), (a-4), (c-5), (c-6), (c-7) и (c-8). Например, клетки, имеющие характеристики, показанные в описанных выше (c-1) и (c-6), являются подходящим воплощением настоящего изобретения.
Кроме того, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки экспрессируют, например, простагландин E2 (PGE2) и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), и уровень экспрессии простагландина E2 (PGE2) повышается за счет стимуляции клеток TNF-α.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, культивируют в присутствии IFN-γ, количество секретируемого кинуренина увеличивается.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD19, CD34 и CD206 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Кроме того, в одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD19, CD31, CD33, CD34, CD38, CD45, CD206, CD235a и SSEA-1 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, например, всем из числа CD19, CD26, CD106, CD117 и CD271 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, например, по всем CD140b и HLA-A, -B и - C в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, например, по всем из числа CD46, CD47, CD55, CD58 и CD59 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются, например, положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD73, CD90, CD105 и CD166. и отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD34 и CD45 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
Кроме того, в одном воплощении, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом, клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34, CD40, CD45, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. В это время клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются IFN-γ. Кроме того, клетки экспрессируют простагландин E2 (PGE2) и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), а количество секретируемого простагландина E2 (PGE2) увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α. Кроме того, количество секретируемого кинуренина увеличивается за счет стимуляции клеток IFN-γ.
Когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируются, клетки секретируют различные гуморальные факторы.
В одном воплощении, касательно характеристики (c-9), когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируются, клетки экспрессируют, по меньшей мере, один, предпочтительно все из числа MMP-2, IGFBP-4 и цистатина C.
В одном воплощении, касательно характеристики (c-10), когда культивируются промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, клетки экспрессируют, по меньшей мере, один, предпочтительно все из числа IL-6, IL-11, MCP -1, IL-8, GROα, HGF, VEGF, VCAM-1, TIMP-3, TIMP-2 и TIMP-1.
Кроме того, касательно характеристики (c-11), в одном воплощении, когда культивируются промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, клетки экспрессируют, по меньшей мере, один, предпочтительно все из числа IL-23, TNF- α, IL-18, IL-33, IL-27, TARC, ENA-78, MIP-3α, MIP-1β, IP-10, SCF и ICAM-1.
Кроме того, касательно характеристики (c-12), в одном воплощении, когда культивируются промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейших стадий культивирования, клетки не экспрессируют или почти не экспрессируют, по меньшей мере, один, предпочтительно все из числа IL- 21, IFN-a, эотаксина, MIP-1a, MIG, I-TAC и GM-CSF.
Кроме того, касательно характеристики (c-13), в одном воплощении, в случае, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, культивируют в присутствии TNF-α или IFN-γ, уровень экспрессии IL-6 выше, чем в случае культивирования клеток в отсутствие такового.
Кроме того, касательно характеристики (c-14), в одном воплощении, в случае, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, культивируют в присутствии TNF-α или IFN-γ, уровень экспрессии IL-11 выше, чем в случае культивирования клеток в отсутствие такового.
Кроме того, касательно характеристики (c-15), в одном воплощении, в случае, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, культивируют в присутствии TNF-α или IFN-γ, уровень экспрессии IP-10 выше, чем в случае культивирования клеток в отсутствие такового.
Кроме того, касательно характеристики (c-16), в одном воплощении, в случае, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, культивируют в присутствии TNF-α или IFN-γ, уровень экспрессии МСР-1 выше, чем в случае культивирования клеток в отсутствие такового.
Кроме того, касательно характеристики (c-17), в одном воплощении экспрессия GM-CSF индуцируется, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, культивируются в присутствии TNF-α, но экспрессия GM-CSF не индуцируется, когда клетки культивируются в присутствии IFN-γ.
Кроме того, касательно характеристики (c-18), в одном воплощении уровень экспрессии HGF снижается, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, культивируют в присутствии TNF-α по сравнению со случаем, когда клетки культивируют в его отсутствие, при этом уровень экспрессии HGF увеличивается, когда клетки культивируют в присутствии IFN-γ, по сравнению со случаем, когда клетки культивируют в его отсутствие.
Кроме того, касательно характеристики (c-19), в одном воплощении, в случае, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, культивируют в присутствии TNF-α, уровень экспрессии IL- 8 больше, чем в случае, когда клетки культивируют в его отсутствие.
В одном воплощении промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, предпочтительно имеют две или более, более предпочтительно три или более, еще более предпочтительно четыре или более, и еще более предпочтительно все характеристики, показанные в приведенных выше: описаны с (c-9) до (c-19). Например, клетки, имеющие характеристики, показанные в описанных выше (c-9) и (a-15), и клетки, имеющие характеристики, показанные в описанных выше (c-9), (c-14) и (c-15) представляют собой подходящее воплощение настоящего изобретения.
Кроме того, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для следующей стадии культивирования, наблюдаются в целом сразу после оттаивания или при культивировании после оттаивания, клетки обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и способностью дифференцироваться в остеоциты. То есть уровень экспрессии аггрекана увеличивается в случае, когда клетки культивируются в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в хондроциты, а количество кальция, накопленного в клетках, увеличивается в случае, когда клетки культивируются в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в остеоциты. Тот факт, что промежуточные клетки обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и способностью дифференцироваться в остеоциты, может быть исследован соответственно с помощью способов, описанных в примерах 20 и 19. Только группы клеток, у которых показана способность дифференцироваться в хондроциты и способность дифференцироваться в остеоциты с помощью этих методов, можно рассматривать как промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования. Однако способы исследования этих способностей к дифференциации не ограничиваются способами, описанными в примерах. Только группы клеток, обладающие способностью дифференцироваться в хондроциты и способностью дифференцироваться в остеоциты другими подходящими способами, также могут использоваться в качестве промежуточных клеток на последующей стадии культивирования.
Способ, в котором только клетки, демонстрирующие специфические паттерны экспрессии, рассматриваются как промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования в соответствии с надлежащим образом установленными стандартами, основанными на описанных выше паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов, презентированных клетками, полученными из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению и/или других паттернах экспрессии генов, также может быть использован для управления производственным процессом.
Кроме того, когда промежуточные клетки, которые должны использоваться на дальнейшей стадии культивирования, наблюдаются в целом сразу после оттаивания или при культивировании после оттаивания, эти клетки в основном относятся к плюрипотентным стволовым клеткам, полученным из пульпы зуба. Под оптическим микроскопом они наблюдаются как прикрепленные клетки по существу веретенообразной формы в плоской культуре, и доля по существу веретеновидных клеток во всех клетках предпочтительно больше или равна 99%, более предпочтительно больше или равна 99,5%, еще более предпочтительно больше или равно 99,9% и еще более предпочтительно больше или равно 99,95%. Только группы клеток, имеющие определенное значение или большую долю по существу веретеновидных клеток, могут быть использованы в качестве промежуточных клеток на последующей стадии культивирования в соответствии с надлежащим образом установленными стандартами, основанными на вышеизложенном.
Кроме того, когда промежуточные клетки, которые будут использоваться для дальнейшей стадии культивирования, культивируют после размораживания, клетки предпочтительно обладают способностью претерпевать, по меньшей мере, 10 клеточных делений и более предпочтительно обладают способностью претерпевать, по меньшей мере, 15 клеточных делений, и иметь, например, способность претерпевать, по меньшей мере, 14 клеточных делений. Кроме того, среднее время удвоения промежуточных клеток, которые должны использоваться на дальнейшей стадии культивирования, когда они размораживаются и культивируются в планшете для культивирования клеток, предпочтительно составляет в пределах 96 часов, более предпочтительно в пределах 84 часов, еще более предпочтительно в пределах 72 часов, все еще более предпочтительно в течение 48 часов и еще более предпочтительно в течение 36 часов. В этот момент могут быть использованы условия культивирования клеток, которые являются такими же или эквивалентными условиям для вышеописанных клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, например, условия (то есть в планшете для культивирования клеток, в среде DMEM, которая содержит 5,56 мМ глюкозы и к которой добавлена 10% FBS, в присутствии 5% CO2 и 37°C), описанные в Примере 5. Только группы клеток, обладающие способностью претерпевать клеточные деления определенное количество раз или более, могут использоваться в качестве промежуточных клеток на последующей стадии культивирования в соответствии с надлежащим образом установленными стандартами, основанными на вышеизложенном. Кроме того, только группы клеток, имеющие среднее время удвоения в течение определенного времени, можно использовать в качестве промежуточных клеток на последующей стадии культивирования в соответствии с надлежащим образом установленными стандартами. Такими стандартами являются, например, клетки, способные претерпевать, по меньшей мере, 10 клеточных делений, которые имеют среднее время удвоения в течение 96 часов, клетки, обладающие способностью претерпевать не менее 14 клеточных делений, которые имеют среднее время удвоения в течение 72 часов, и клетки, имеющие способность претерпевать как минимум 15 клеточных делений, которые имеют среднее время удвоения в течение 72 часов.
То есть промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, сохраняют свойства стволовых клеток, которые обладают высокой способностью к делению, и могут быть дифференцированы на два или более типов клеток. Промежуточные клетки, которые будут использоваться на дальнейшей стадии культивирования, также могут называться клетками, имеющими высокую колониеобразующую способность. В данном случае колониеобразующая способность относится к способности делящихся клеток формировать колонии на чашке, когда клетки высевают в чашку и культивируют.
Когда промежуточные клетки оттаивают, средний диаметр клеток в состоянии, в котором клетки заставляют плавать в растворе, например, в среде, предпочтительно меньше или равен 20 мкм или меньше или равен до 18 мкм и составляет, например, от 10 до 20 мкм, от 10 до 18 мкм, от 12 до 20 мкм, от 14 до 20 мкм и от 16 до 20 мкм.
Пункты тестов качества, проводимые во время, до или после завершения процесса производства промежуточных клеток, представлены ниже в качестве примеров тестов качества от a до k. Тесты качества проводятся по одному или нескольким пунктам. Все эти пункты можно выполнить. Клетки, которые будут использоваться для тестов качества в этот момент, представляют собой либо клетки (1), в качестве промежуточных клеток, полученные путем фракционирования некоторых клеток перед их суспендированием в криоконсервирующей жидкости, либо клетки (2), в качестве промежуточных клеток, полученные путем фракционирования некоторых клеток перед суспендирование в криоконсервирующей жидкости и дальнейшего субкультивирования этих фракционированных клеток, клетки (3), в качестве промежуточных клеток, перед замораживанием, которые были суспендированы в криоконсервирующей жидкости для замораживания, клетки (4) в качестве промежуточных клеток, сразу после размораживания замороженных клеток, или клетки (5) в качестве промежуточных клеток, полученные размораживанием замороженных клеток и последующим культивированием размороженных клеток. Если не указано иное, схожие тесты качества могут быть выполнены на двух или более из этих клеток (1) - (5).
(Тест качества а) Проверка того, что доля числа клеток, показывающих по существу веретеновидную форму во всех клетках при наблюдении под оптическим микроскопом, больше или равна 99%, больше или равна 99,5%, больше или равна равно 99,9% или больше или равно 99,95,
(Тест качества b) Проверка того, что жизнеспособность клетки больше или равна 50%, больше или равна 60%, больше или равна 70%, больше или равна 80%, больше или равна 90%, или больше или равно 95%,
(Тест качества c) Проверка того, что клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45 в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности, или проверка того, что клетки положительны, по меньшей мере, по одному из CD73 и CD90 и отрицательный по CD34 в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности (Тест качества d) Подтверждение того, что клетки отрицательны по CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности, или проверка того, что клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности,
(Тест качества e) Проверка того, что клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности, когда клетки стимулируются IFN-γ, или проверка, по меньшей мере, одного из числа того, что клетки отрицательны по CD40, отрицательны по CD80, отрицательны по CD86 и положительны по антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров антигена клеточной поверхности, когда клетки стимулируются IFN-γ (Тест качества f) Проверка того, что клетки экспрессируют простагландин E2 (PGE2) и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), а уровень экспрессии простагландина E2 (PGE2) увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α,
(Тест качества g) Проверка того, что уровень экспрессии аггрекана увеличивается при культивировании клеток в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в хондроциты,
(Тест качества h) Проверка того, что количество кальция, накопленного в клетках, увеличивается, когда клетки культивируются в среде, содержащей вещество, которое, как известно, вызывает дифференцировку в остеоциты,
(Тест качества i) Проверка того, что клетки обладают способностью претерпевать не менее 10, 14 или 15 клеточных делений в планшете для культивирования клеток,
(Тест качества j) Проверка того, что среднее время удвоения клеток в планшете для культивирования клеток составляет 96 часов, 84 часа, 72 часа, 48 часов или 36 часов в течение периода теста качества i.
(Проверка качества k) Проверка того, что средний диаметр клеток в состоянии, когда клетки плавают в среде, меньше или равен 20 мкм, меньше или равен 18 мкм, от 10 до 20 мкм, от 10 до 20 мкм, от 10 до 18 мкм, от 12 до 20 мкм, от 14 до 20 мкм или от 16 до 20 мкм.
Вышеописанные тесты качества могут проводиться по 10 пунктам (Тест качества a) - (Тест качества j). Кроме того, из этих 10 пунктов можно выбрать произвольные 9 пунктов для проведения тестов качества. В случае, когда для проведения тестов качества выбрано 9 пунктов, можно выбрать, например, тесты качества a, b, c, d, e, f, g, i и j, без ограничения указанным. Кроме того, из этих 10 пунктов можно выбрать произвольные 8 пунктов для проведения тестов качества. В случае, когда выбрано 8 тестов для проведения тестов качества, например, могут быть выбраны тесты качества a, b, c, d, e, f, i и j, без ограничения указанным. Кроме того, из этих 10 пунктов можно выбрать произвольные 7 пунктов для проведения тестов качества. В случае, когда выбрано 7 элементов для проведения тестов качества, например, могут быть выбраны тесты качества a, b, c, d, e, i и j, без ограничения указанным. Кроме того, из этих 10 пунктов можно выбрать произвольные 6 пунктов для проведения тестов качества. В случае, если для проведения тестов качества выбрано 6 пунктов, например, могут быть выбраны тесты качества a, b, c, d, i и j, без ограничения указанным. Кроме того, из этих 10 пунктов можно выбрать произвольные 5 пунктов для проведения тестов качества. В случае, когда для проведения тестов качества выбрано 5 пунктов, например, могут быть выбраны тесты качества a, b, c, i и j, без ограничения указанным. Кроме того, из этих 10 пунктов можно выбрать произвольные 4 пункта для проведения тестов качества. В случае, когда для проведения тестов качества выбрано 4 пункта, например, могут быть выбраны тесты качества a, b, c и j, без ограничения указанным. Кроме того, из этих 10 элементов можно выбрать произвольные 3 элемента для проведения тестов качества. В случае, когда для проведения тестов качества выбраны 3 пункта, например, могут быть выбраны тесты качества a, b и c, без ограничения указанным. Кроме того, из этих 10 элементов можно выбрать произвольные 2 элемента для проведения тестов качества. В случае, если для проведения тестов качества выбраны 2 объекта, например, тесты качества a и b,
тесты качества a и c, тесты качества a и d, тесты качества a и e, тесты качества a и f, тесты качества a и g, тесты качества a и h, тесты качества a и i, тесты качества a и j, тесты качества b и c, тесты качества b и d, тесты качества b и e, тесты качества b и f, тесты качества b и g, тесты качества b и h, тесты качества b и i, тесты качества b и j, тесты качества c и d, тесты качества c и e, тесты качества c и f, тесты качества c и g, тесты качества c и h, тесты качества c и i, тесты качества c и j, тесты качества d и e, тесты качества d и f, тесты качества d и g, тесты качества d и h, тесты качества d и i, тесты качества d и j, тесты качества e и f, тесты качества e и g, тесты качества e и h, тесты качества e и i, тесты качества e и j, тесты качества f и i, тесты качества f и j или тесты качества i и j, без ограничения указанным.
Продуцирующая культура
Следующей стадией культивирования промежуточных клеток является стадия культивирования, ведущая к продуцированию клеток пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, которые являются конечными продуктами, и эта стадия, в частности, называется продуцирующей культурой.
Среда, используемая для продуцирующей культуры, предпочтительно представляет собой среду Игла, модифицированную Дульбекко, к которой добавляется фетальная бычья сыворотка. Концентрация (об./об.%) фетальной бычьей сыворотки, добавляемой в среду, предпочтительно составляет от 8% до 25% и более предпочтительно от 8% до 20%, и составляет, например, 10%. Пример подробной композиции среды Игла, модифицированной Дульбекко (до добавления фетальной телячьей сыворотки), представлен в Таблице 1. При желании к среде можно добавить от 3 до 5 мМ, например, 4 мМ L-аланил-L-глутамина. Кроме того, в производственную культуру обычно не добавляют антибиотик. Однако в среду можно добавить антибиотик, такой как стрептомицин. В случае, когда в среду добавляют стрептомицин, к ней добавляют стрептомицин так, чтобы концентрация стрептомицина в среде составляла от 10 мг/л до 250 мг/л, например, 100 мг/л. Кроме того, каждый компонент может быть заменен его эквивалентом, например, его солью.
Продуктивное культивирование клеток может быть выполнено в планшете для культивирования клеток или может быть выполнено на микроносителях в устройстве для культивирования клеток, например, в биореакторе. Кроме того, клетки можно культивировать и пролиферировать в планшете для культивирования клеток для дальнейшего проведения продуцирования культуры на микроносителях в устройстве для культивирования клеток, например, в биореакторе. Кроме того, в случае культивирования клеток на микроносителях вместо биореактора можно использовать встряхиваемую колбу. В случае культивирования клеток в планшете для культивирования клеток в продуцирующей культуре условия являются такими же или аналогичными условиям культивирования вышеописанных клеток, полученных путем культивирования суспензии пульпы зуба. То есть культивирование промежуточных клеток после размораживания в планшете для культивирования клеток и сбор клеток из него повторяют для увеличения количества клеток. Можно подходящим образом использовать биореакторы, коммерчески доступные от GE Healthcare, Merck KGaA, Sartorius AG и т.п. В дальнейшем будет подробно описан способ культивирования клеток с использованием биореактора в качестве устройства для культивирования клеток.
В случае культивирования клеток на микроносителях с использованием биореактора в продуцирующей культуре, микроносители, к которым прикреплены клетки, помещают в биореактор, и клетки культивируют при перемешивании микроносителей в среде. Микроносители - это частицы (маленькие частицы) материала, к которому клетки могут прикрепляться, и используются для культивирования клеток на их поверхностях (включая поверхности внутри пор в случае пористых микроносителей). В этом смысле микроносители можно также называть частицами носителя или небольшими частицами носителя. Диаметры (диаметры частиц) микроносителей во время культивирования клеток (то есть во время гидратации) предпочтительно составляют от 50 до 400 мкм и составляют, например, от 80 до 300 мкм, от 80 до 250 мкм, от 100 до 200 мкм, от 130 до 180 мкм. Микроносители могут быть пористыми, имеющими поры, направленные внутрь от поверхности частицы. Диаметры (диаметры пор) пористых микроносителей во время культивирования клеток предпочтительно составляют от 3 до 40 мкм и составляют, например, от 5 до 25 мкм, от 10 до 20 мкм, от 5 до 15 мкм.
Диаметры (диаметры пор) пористых микроносителей во время культивирования клеток предпочтительно составляют от 3 до 40 мкм и составляют, например, от 5 до 25 мкм, от 10 до 20 мкм, от 5 до 15 мкм. Примеры микроносителей включают микроносители, полученные формованием полимерного соединения в форму частиц, керамические частицы и стеклянные частицы. Примеры такого полимерного соединения включают виниловую смолу, уретановую смолу, эпоксидную смолу, полистирол, полиметилметакрилатный полиэфир, полиамиды, полиимид, силиконовую смолу, фенольную смолу, меламиновую смолу, мочевинную смолу, анилиновую смолу, иономерную смолу, поликарбонат, коллаген, декстран, желатин, целлюлоза, альгинат и их смеси. Поверхности микроносителей можно дополнительно модифицировать молекулами клеточной адгезии и т.п. Примеры таких молекул клеточной адгезии включают желатин, кератин, эластин, гепарансульфат, декстран, декстрансульфат, хондроитинсульфат, гиалуронат натрия, н-изопропилакриламид, коллаген от I до XIX, фибронектин, витронектин, ламинин-1 до -12, нидоген, тенасцин, тромбоспондин, остеопонтин, фибриноген, поли-D-лизин, поли-L-лизин, хитин, хитозан, сефарозу, ламинин, энтактин I или фрагменты или пептиды, содержащие домены клеточной адгезии этих молекул клеточной адгезии, и их смеси. Кроме того, удельная плотность микроносителей в среде предпочтительно близка к 1 или от 0,9 до 1,2, и составляет, например, от 0,9 до 1,1 или около 1,0.
Подходящим образом можно использовать микроносители, которые изготовлены из желатиновой матрицы и имеют диаметр частиц во время культивирования клеток от 130 до 180 мкм и диаметр пор от 10 до 20 мкм (или от 5 до 15 мкм).
Адгезия клеток к микроносителям в продуцирующей культуре осуществляется путем смешивания клеток с микроносителями при их перемешивании в растворе. Этая стадия называется стадией адгезии клеток к микроносителям. На стадии адгезии клетки, контактирующие с микроносителями во время перемешивания, последовательно прикрепляются к поверхностям микроносителей. Раствор, используемый на этой стадии, предпочтительно представляет собой среду для культивирования клеток, но настоящее изобретение конкретно этим не ограничивается. Перемешивание клеток и микроносителей на стадии адгезии можно выполнять с перерывами. В этом случае клетки и микроносители, например, перемешивают в течение от 1 минуты до 20 минут, а затем оставляют на время от 10 минут до 2 часов.
В случае выполнения стадии адгезии с использованием среды для культивирования клеток в качестве раствора, стадия может быть выполнена в биореакторе. В случае выполнения стадии адгезии в биореакторе среду для культивирования клеток, клетки и микроносители помещают и перемешивают в биореакторе, чтобы клетки прилипали к микроносителям. После адгезии клеток культивирование клеток можно продолжить в биореакторе.
Перемешивание клеток и микроносителей в биореакторе на стадии адгезии можно осуществлять с перерывами. В этом случае клетки и микроносители, например, перемешивают в течение от 1 минуты до 20 минут, а затем оставляют на время от 10 минут до 2 часов.
В общем, биореактор относится к биохимическому реактору, такому как устройство для реакции с иммобилизованным ферментом, и биологическому или микробиологическому реактору, такому как резервуар для ферментации или устройство биологической очистки сточных вод. Биореактор, используемый в примерах, которые будут описаны ниже в настоящем изобретении, подходит для создания клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, для прилипания к микроносителям и культивирования клеток при перемешивании в среде. Биореактор имеет культуральный резервуар для культивирования клеток, мешалку для перемешивания среды, вход для газовой фазы, вход для жидкой фазы, сливной порт и сенсорный блок. Бак для культивирования представляет собой бак, имеющий по существу цилиндрическую полость. В этом состоянии можно культивировать клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, к которым прикреплены микроносители в культуральном резервуаре. В полости культурального резервуара предусмотрена мешалка для среды в культуральном резервуаре. Мешалка представляет собой, например, крыльчатку, а среда перемешивается путем вращения крыльчатки. Перемешивание среды с помощью крыльчатки регулируют так, чтобы большая часть микроносителя, к которому прикреплены клетки, плавала в среде, не осаждаясь на нижней поверхности полости культурального резервуара. Скорость вращения крыльчатки необходимо соответствующим образом выбирать в зависимости от формы культурального резервуара, формы крыльчатки, типов микроносителей и т.п., и составляет, например, от 30 до 100 об/мин, от 50 до 80 об/мин., или около 70 об/мин. Вход газовой фазы предназначен для подачи газовой фазы, такой как воздух, кислород и углекислый газ, в культуральный резервуар. Вход для газовой фазы может иметь выход под жидким уровнем среды. В этом случае газовая фаза отправляется в среду в виде пузырьков. Вход жидкой фазы предназначен для загрузки различных растворов, таких как среда или раствор глюкозы, в культуральный резервуар. Дренажный порт предназначен для слива среды в культуральный резервуар. Среда выходит из этого дренажного порта во время замены среды. Дренажный порт также используется для извлечения микроносителей, к которым клетки прикреплены вместе со средой. Этот дренажный порт можно использовать при отборе проб микроносителей во время культивирования или при сборе микроносителей после завершения культивирования. Блок датчиков включает датчики, которые измеряют температуру, pH и концентрацию растворенного кислорода в среде в культуральном резервуаре. Сенсорный блок может дополнительно включать датчики, которые измеряют концентрации глюкозы и молочной кислоты. Датчики для измерения температуры, pH и концентрации растворенного кислорода в растворе, а также концентрации глюкозы и молочной кислоты можно соответствующим образом выбрать из хорошо известных для установки.
Бак для культивирования биореактора фиксируется или устанавливается в биореакторе с возможностью съема. Благодаря съемной установке культурального бака мыть культуральный бак становится легко. Баки для культур обычно изготавливаются из металла или твердой смолы, после применения моются и используются повторно. Вместо такого культурального резервуара в биореактор можно установить гибкий мешок для культивирования из смолы, а в мешок поместить среду и клетки для проведения культивирования. Мешок для культивирования поддерживается в биореакторе, поэтому с ним можно обращаться так же, как с обычным культуральным баком. Поскольку пакет для культивирования является одноразовым, после применения не требуется промывка, что позволяет повысить эффективность работы во время культивирования.
В случае, когда концентрация глюкозы в среде в продуцирующей культуре падает ниже определенного значения, в среду добавляют глюкозу. Например, в случае, когда концентрация глюкозы ниже или равна 0,1 мМ, в среду добавляют глюкозу, так что конечная концентрация глюкозы становится от 5 до 7 мМ. Кроме того, в случае, если концентрация молочных кислот превышает определенное значение в продуцирующей культуре, заменяется вся или часть среды. В случае, когда концентрация молочных кислот, например, выше или равна 20 мМ, заменяется вся среда или заменяется часть среды, так что концентрация молочных кислот становится, например, ниже или равно 5 мМ или меньше или равно 2 мМ.
Кислород, воздух и CO2 подают в среду через впускное отверстие для газовой фазы во время культивирования в биореакторе. Количество подаваемого кислорода регулируется так, чтобы концентрация растворенного кислорода в среде составляла от 50% до 100% от концентрации насыщения, например, так, чтобы концентрация растворенного кислорода поддерживалась на уровне 50% или 100% от этого. Кроме того, что касается скорости потока CO2, CO2 подается таким образом, чтобы поддерживать pH среды, например, на уровне от 7,0 до 7,8, чтобы клетки могли соответствующим образом расти. Концентрация растворенного кислорода и pH отслеживаются с течением времени. Следовательно, когда контролируемые числовые значения отклоняются от установленных значений, концентрацию растворенного кислорода и pH можно поддерживать постоянными, уменьшая количество подаваемых соответственно кислорода и CO2. Кроме того, по мере пролиферации клеток в биореактор можно подавать дополнительные микроносители.
Культивирование в биореакторе проводят до тех пор, пока поверхности микроносителей не будут занимать клетки в определенной пропорции. Доля в этот момент может быть соответствующим образом приниматься, например, за 20%, 40%, 85%, 95% или 98%. Кроме того, культивирование в биореакторе проводят до тех пор, пока поверхности микроносителей не будут занимать клетки, пока плотность клеток на их поверхностях не станет определенной величиной. Плотность клеток в этот момент может быть соответствующим образом приниматься, например, за 3000 клеток/см2, 5000 клеток/см2, 10000 клеток/см2, 20000 клеток/см2 или 22000 клеток/см2.
Клетки, которые должны быть заморожены как клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, после завершения выращивания продуцирующей культуры предпочтительно подвергаются, по меньшей мере, 15 делениям и более предпочтительно подвергаются, по меньшей мере, 20 делениям после сбора в виде клеток, образующих колонию, в планшете для клеточных культур посредством культивирования суспензии пульпы зуба. Например, клетки, которые претерпели деления 15-30 раз, 15-23 раз, 15-20 раз, 20-30 раз, 20-28 раз или 23-26 раз, подвергаются криоконсервации.
Клетки, которые должны быть заморожены как клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, после завершения выращивания продуцирующей культуры через промежуточные клетки, предпочтительно подвергаются, по меньшей мере, 10 делениям и более предпочтительно подвергаются, по меньшей мере, 15 делениям после сбора в виде клеток, формирующих колонии в планшете для культивирования клеток посредством культивирования суспензии пульпы зуба до тех пор, пока клетки не будут рассматриваться как промежуточные клетки. Например, клетки, которые претерпели деления 13-20 раз, 13-23 раз или 14-20 раз, криоконсервируются как промежуточные клетки. Затем в продуцирующей культуре, которая начинается с размораживания промежуточных клеток, клетки предпочтительно претерпевают, по меньшей мере, 5 делений до тех пор, пока не будет получен клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, с начала продуцирующей культуры, и, предпочтительно, претерпевают, например, не менее 8 или не менее 10 делений. В частности, при проведении культивирования с использованием микроносителей в продуцирующей культуре клетки предпочтительно претерпевают от 2 до 5 делений и предпочтительно претерпевают, например, от 2 до 3 делений.
В случае, когда клетки культивируют в планшете для культивирования клеток, среднее время удвоения клеток, когда клетки культивируются и претерпевают деления, пока из промежуточных клеток не будет получен клеточный препарат из пульпы зуба, предпочтительно находится в пределах 96 часов, более предпочтительно в пределах 84 часов, еще более предпочтительно в пределах 72 часов, еще более предпочтительно в пределах 48 часов и еще более предпочтительно в пределах 36 часов. В случае, когда клетки культивируют с использованием микроносителей, среднее время удвоения клеток, когда клетки культивируются и претерпевают деления до тех пор, пока клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, не будет получен из промежуточных клеток, предпочтительно составляет в пределах 8 дней, более предпочтительно в пределах 6 дней, еще более предпочтительно в пределах 5 дней и еще более предпочтительно в пределах 4 дней, и составляет, например, от 2 до 8 дней, от 2 до 7 дней, от 2 до 6 дней, от 2,5 до 6 дней или от 2,5 до 5,5 дней.
Стандарт может быть установлен для среднего времени удвоения клеток в течение всего периода продуктивного культивирования или во время культивирования с использованием микроносителей, и только клетки, имеющие среднее время удвоения в пределах стандарта, могут быть криоконсервированы для применения для последующего использования. Такие стандарты могут быть надлежащим образом установлены, например, в пределах 84 часов, в пределах 72 часов, в пределах 48 часов или в пределах 36 часов в случае культивирования в планшете для культивирования клеток, и в пределах 8 дней, в пределах 6 дней, в течение 5 дней, в течение 4 дней, в течение 3 дней и т.п. в случае культивирования с использованием микроносителей. Клетки, которые не соответствуют этим стандартным значениям, могут быть выброшены без криоконсервации, чтобы выборочно сохранить только клетки, обладающие способностью претерпевать клеточные деления определенное количество раз или более в качестве клеточного препарата, полученного из пульпы зуба.
В продуцирующей культуре клетки пролиферируют до тех пор, пока количество плюрипотентных стволовых клеток, которые могут быть получены из одного удаленного зуба (например, третьего коренного зуба), пока не будет получен клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, не станет предпочтительно равно 1 × 106 или более, более предпочтительно 1 × 107 или более, еще более предпочтительно 3 × 107 или более, еще более предпочтительно 1 × 108 или более, а еще более предпочтительно 1 × 109 или более, и становится, например, от 1 × 107 до 1 х 1010. Теоретически количество клеток, подвергшихся 20 делениям, 25 делениям и 30 делениям, увеличивается в 1 x 106 раз или более, в 3 x 107 раз и более и в 1 x 109 раз или более.
Получение препарата
Микроносители после завершения выращивания культуры собирают и промывают в состоянии, при котором клетки прикреплены к ним. Раствор, который можно использовать в качестве промывочной жидкости для промывки микроносителей, в настоящее время ничем особо не ограничен, если он не повреждает клетки и не ингибирует ферментативную активность сериновой протеазы и металлопротеазы, особенно трипсина. Однако, например, может быть использован физиологический раствор, PBS, среда DMEM с низким содержанием глюкозы (не содержащая сыворотки) и промывочный раствор, имеющий состав, показанный в таблице 4, и, например, может использоваться среда DMEM с низким содержанием глюкозы (не содержащая сыворотки).
Промытые микроносители обрабатывают протеазой. Протеаза, которую можно использовать в этот момент, ничем особо не ограничена, при условии, что она может разлагать молекулы белковой адгезии клеток, но предпочтительны сериновая протеаза, металлопротеаза или их смесь. Трипсин представляет собой одну из подходящих сериновых протеаз, а желатиназа представляет собой одну из подходящих металлопротеаз. Клетки высвобождаются из микроносителей путем обработки протеазой. Кроме того, в случае, когда материалы микроносителей представляют собой белки, такие как желатин, сами микроносители разлагаются при обработке протеазой. В этот момент, в случае, когда микроносители являются пористыми, клетки, которые приклеились к поверхностям внутри пор, также высвобождаются из микроносителей. В случае микроносителей, сделанных из пористой желатиновой матрицы, желатин разлагается посредством обработки протеазой и суспензией, содержащей высвободившиеся клетки и продукты разложения желатина. В этом случае в качестве протеазы особенно подходят трипсин, желатиназа или их смесь.
В случае, когда материалы микроносителей представляют собой белки, такие как желатин, получается суспензия, содержащая клетки, высвобождаемые из микроносителей из-за протеазы, и продукты разложения (продукты разложения желатина в случае, когда материалы представляют собой желатин) белков, которые являются материалами микроносителей. Для приготовления препарата выделенных клеток, полученных из пульпы зуба, предпочтительно удалить протеазу и примеси, такие как продукты разложения материалов микроносителя, из этой суспензии посредством операции промывания клеток. В дальнейшем будет подробно описана операция промывки клеток в случае, когда материалами микроносителей является желатин.
Суспензию, полученную в результате обработки протеазой, можно промыть путем повторного сбора путем центрифугирования и суспендирования с использованием промывочного раствора. Протеазу и измельченные продукты разложения желатина можно удалить центрифугированием. Однако продукты разложения желатина также включают остатки определенного размера, которые осаждаются вместе с клетками при центрифугировании. Удаление таких крупных остатков желатина можно проводить с помощью мембранной фильтрации. С этой точки зрения, в случае проведения мембранной фильтрации диаметр пор фильтрующей мембраны предпочтительно составляет от 20 до 80 мкм. Например, может быть использована фильтрующая мембрана с диаметром пор 25 мкм, 26 мкм, 27 мкм, 28 мкм, 30 мкм, 50 мкм, 70 мкм или 80 мкм. Фильтрация с помощью фильтрующей мембраны может быть эффективно выполнена путем предотвращения засорения фильтрующих мембран путем фильтрации с помощью фильтрующей мембраны, имеющей большой диаметр пор, а затем фильтрации с помощью фильтрующей мембраны, имеющей малый диаметр пор. Например, фильтрация может быть сначала выполнена с помощью фильтрующей мембраны с диаметром пор от 60 до 100 мкм, а затем выполнена с помощью фильтрующей мембраны с диаметром пор от 25 до 50 мкм, или может быть сначала выполнена с помощью фильтрующей мембраны, имеющей диаметр пор от 60 до 75 мкм, а затем выполнена с помощью фильтрующей мембраны, имеющей диаметр пор от 25 до 30 мкм. Фильтрация с помощью фильтрующей мембраны также может осуществляться путем фильтрации только с помощью фильтрующей мембраны с небольшим диаметром пор. Диаметр пор фильтрующей мембраны, используемой в этом случае, составляет предпочтительно от 25 до 50 мкм и более предпочтительно от 25 до 30 мкм. Например, используется фильтрующая мембрана с диаметром пор 25 мкм, 26 мкм, 27 мкм, 28 мкм или 30 мкм. В этот момент крупные остатки желатина не проходят через фильтрующую мембрану, и в фильтрате собираются клетки. Однако раствор, в котором суспендированы клетки, можно заменить жидкостью для криоконсервации (жидкость для криоконсервации для приготовления клеток), которая будет описана ниже, с использованием ультрафильтрационной мембраны или тому подобного без сбора клеток для приготовления клеточной суспензии предварительно замороженного препарата.
Промывочный раствор, используемый в вышеописанной операции промывки, предназначен для достаточного удаления среды и протеазы. В случае, когда микроносители представляют собой белки, такие как желатин, промывочный раствор также используется для удаления продуктов его разложения. Состав такого промывочного раствора ничем особо не ограничен. В качестве промывочного раствора можно использовать физиологический раствор, физиологический раствор с фосфатным буфером, ацетатный раствор Рингера, бикорбанатный раствор Рингера и т.п., но предпочтительно использовать раствор, полученный путем добавления человеческого сывороточного альбумина к бикарбонатному раствору Рингера. Можно использовать имеющиеся в продаже ацетатные растворы Рингера и бикарбонатные растворы Рингера. Например, PLASMA-LYTE A (Baxter) и Physio 140 (Otsuka Holdings Co., Ltd.) можно использовать в качестве ацетатных растворов Рингера, а BICARBON Injection (AJINOMOTO CO., INC.) Можно использовать в качестве бикарбонатного раствора Рингера. Подходящие примеры компонентной композиции и концентрации электролита бикарбонатного раствора Рингера показаны соответственно в таблицах 2 и 3.
Подходящий пример компонентной композиции промывочного раствора показан в Таблице 4. Кроме того, в таблице 5 показан подходящий пример концентрации электролита, содержащегося в промывочном растворе. Ацетилтриптофан натрия и каприлат натрия также могут быть исключены из компонентов промывочного раствора, представленного в таблицах 4 и 5.
В случае выполнения центрифугирования и мембранной фильтрации для удаления примесей после обработки протеазой, сначала может быть выполнено центрифугирование, с последующей мембранной фильтрацией, или может быть проведена мембранная фильтрация, с последующим центрифугированием. Однако предпочтительно сначала проводить мембранную фильтрацию, а затем центрифугирование.
Собранные клетки после промывки промывочным раствором суспендируют в жидкости для криоконсервации (жидкость для криоконсервации для приготовления клеток). Клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный путем инкапсулирования и замораживания этой суспензии (суспензии клеток для предварительного замораживания) в контейнере для криоконсервации клеток, является оптимальной формой для сохранения или транспортировки среди клеточных препаратов, полученных из пульпы зуба. Композиция части раствора (криоконсервационная жидкость для приготовления клеток) суспензии клеток для предварительного замораживания ничем особо не ограничена при условии, что клетки млекопитающих, в частности клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками человека, могут быть заморожены и разморожены без гибели. Жидкость для криоконсервации клеток для приготовления клеток содержит цитопротекторный агент. Цитопротекторные агенты выполняют, например, функцию подавления образования кристаллов льда внутри клеток и разрушения клеток при замораживании клеток. Подходящие примеры цитопротекторных агентов включают диметилсульфоксид (DMSO), этиленгликоль, пропиленгликоль, серицин и глицерин. Два или более из них можно комбинировать и использовать в качестве цитопротекторного агента. В случае использования диметилсульфоксида в качестве цитопротекторного агента его концентрация предпочтительно составляет от 5% до 15% (об./об.), и более предпочтительно от 9% до 11% (об./об.), и составляет, например, 10% (об./об.). Жидкость для криоконсервации может включать буферный агент. Буферный агент, который может регулировать pH водного раствора от 6 до 8, например, от 6,8 до 7,8, является предпочтительным. Примеры таких буферных агентов включают агенты, содержащие ионы карбоната, ионы бикарбоната, ионы цитрата и ионы натрия. Жидкость для криоконсервации для приготовления клеток может дополнительно содержать человеческий сывороточный альбумин. В случае использования человеческого сывороточного альбумина его концентрация предпочтительно составляет от 40 до 100 г/л и более предпочтительно от 46 до 56 г/л, и может быть, например, составлять 51 г/л.
Продукт, полученный путем добавления раствора человеческого сывороточного альбумина и диметилсульфоксида к раствору бикарбоната Рингера, является подходящим примером жидкости для криоконсервации для приготовления клеток. Жидкость для криоконсервации для приготовления клеток содержит от 59 до 80,4 мМ хлорида натрия, от 2,3 до 3,08 мМ хлорида калия, от 0,85 до 1,16 мМ дигидрата хлорида кальция, от 0,28 до 0,385 мМ гексагидрата хлорида магния, от 14 до 19,2 мМ гидрокарбоната натрия, от 0,94 до 1,28 мМ натрия. дигидрат цитрата, от 46 до 56 г/л сывороточного альбумина человека, от 3,73 до 4,55 мМ ацетилтриптофана натрия, от 3,74 до 4,58 мМ каприлата натрия и от 9% до 11% (об./об.) DMSO. Жидкость для криоконсервации промежуточных клеток, показанная в таблице 6, также может быть подходящим образом использована в качестве жидкости для криоконсервации для приготовления клеток.
Таким образом, можно подходящим образом использовать жидкость для криоконсервации для приготовления клеток, которую можно по существу использовать в качестве жидкости для криоконсервации промежуточных клеток. Например, ее композиция представляет собой: от 65,8 до 80,4 мМ хлорида натрия, от 2,52 до 3,08 мМ хлорида калия, от 0,95 до 1,16 мМ дигидрата хлорида кальция, от 0,315 до 0,385 мМ гексагидрата хлорида магния, от 15,7 до 19,2 мМ гидрокарбоната натрия, от 1,04 до 1,28 мМ дигидрата цитрата натрия, от 46 до 56 г/л сывороточного альбумина человека, от 3,73 до 4,55 мМ ацетилтриптофана натрия, от 3,74 до 4,58 мМ каприлата натрия и от 9 до 11% (об./об.) DMSO. В дополнение к композиции, показанной в Таблице 6, другая композиция представляет собой, например, от 70,8 до 71,3 мМ хлорида натрия, от 2,71 до 2,73 мМ хлорида калия, от 1,01 до 1,02 мМ дигидрата хлорида кальция, от 0,335 до 0,345 мМ гексагидрата хлорида магния, от 16,9 до 17,0 мМ гидрокарбоната натрия, от 1,12 до 1,14 мМ дигидрата цитрата натрия, от 53,6 до 54,3 г/л сывороточного альбумина человека, от 4,36 до 4,41 мМ ацетилтриптофана натрия, от 4,37 до 4,43 мМ каприлата натрия и от 10,6 до 10,9% (об./об.) DMSO. Среди них можно исключить ацетилтриптофан натрия и каприлат натрия. Отношение осмотического давления криоконсервирующей жидкости для приготовления клеток к физиологическому раствору предпочтительно составляет от 0,9 до 1,1.
Кроме того, раствор, содержащий ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, человеческий сывороточный альбумин и диметилсульфоксид, можно подходящим образом использовать в качестве жидкости для криоконсервации промежуточных клеток. Например, раствор, содержащий ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, сывороточный альбумин человека и диметилсульфоксид, соответственно, в концентрациях от 91 до 113 мМ, от 2,52 до 3,08 мМ, от 0,95 до 1,16 мМ, от 0,315 до 0,385 мМ, от 15,6 до 19,2 мМ, от 1,04 до 1,28 мМ, от 46 до 56 г/л и от 9% до 11% (об./об.), является подходящим примером этого. Кроме того, например, раствор, содержащий ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, сывороточный альбумин человека и диметилсульфоксид, соответственно, в концентрациях от 100 до 102 мМ, от 2,71 до 2,77 мМ, 1,01 до 1,03 мМ, от 0,335 до 0,345 мМ, от 16,9 до 17,2 мМ, от 1,13 до 1,15 мМ, от 52,2 до 54,3 г/л и от 10,3 до 10,9% (об./об.), является еще одним подходящим примером этого. Кроме того, например, раствор, содержащий ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, человеческий сывороточный альбумин и диметилсульфоксид, соответственно, в концентрациях 102 мМ, 2,80 мМ, 1,05 мМ, 0,35 мМ, 17,4 мМ, 1,16 мМ, 51 г/л и 10% (об./об.), является еще одним подходящим примером этого. Кроме того, например, раствор, содержащий ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, сывороточный альбумин человека и диметилсульфоксид, соответственно, в концентрациях 101 мМ, 2,77 мМ, 1,03 мМ, 0,34 мМ, 17,2 мМ, 1,15 мМ, 52 г/л и 10% (об./об.) является еще одним подходящим примером этого. Кроме того, например, раствор, содержащий ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, сывороточный альбумин человека и диметилсульфоксид соответственно в концентрациях 100 мМ, 2,71 мМ, 1,01 мМ, 0,34 мМ, 16,9 мМ, 1,13 мМ, 53,6 г/л и 10,7% (об./об.) является еще одним подходящим примером этого.
В случае, когда жидкость для криоконсервации для приготовления клеток дополнительно содержит ацетилтриптофан или его соль, его концентрация предпочтительно составляет от 3,73 до 4,55 мМ и более предпочтительно от 4,24 до 4,41 мМ, и составляет, например, 4,14 мМ, 4,24 мМ или 4,36 мМ. В случае, когда криоконсервирующая жидкость для приготовления клеток дополнительно содержит каприловую кислоту или ее соль, ее концентрация предпочтительно составляет от 3,74 до 4,58 мМ и более предпочтительно от 4,25 до 4,43 мМ, и составляет, например, 4,16 мМ, 4,25 мМ или 4,37 мМ.
Плотность клеток в суспензии, в которой клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, суспендированы в криоконсервирующей жидкости для приготовления клеток, ничем особо не ограничена, но предпочтительно составляет от 5 × 106 до 8 × 107 клеток/мл более предпочтительно от 1,5 × 107 до 3 × 107 клеток/мл и еще более предпочтительно от 2,1 × 107 до 3,0 × 107 клеток/мл, и составляет, например, 2,5 × 107 клеток/мл. Суспендированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, помещают в контейнер для криоконсервации клеток, а затем подвергают криоконсервации.
Композиция клеточной суспензии, в которой клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, суспендированы в криоконсервирующей жидкости для приготовления клеток, варьирует в зависимости от плотности суспендируемых клеток, но в основном включает 59-61 мМ хлорида натрия, от 2,3 до 2,6 мМ хлорида калия, от 0,85 до 0,98 мМ дигидрата хлорида кальция, от 0,28 до 0,32 мМ гексагидрата хлорида магния, от 14 до 16 мМ гидрокарбоната натрия, от 0,94 до 1,08 мМ дигидрата цитрата натрия, от 49 до 50 г/л сывороточного альбумина человека, От 4,0 до 4,1 мМ ацетилтриптофана натрия, от 4,0 до 4,1 мМ каприлата натрия и от 9% до 11% (об./об.) DMSO.
Количество клеточной суспензии, которое нужно распределить в один контейнер для криоконсервации клеток, необходимо соответствующим образом отрегулировать и предпочтительно составляет от 1 до 20 мл. Кроме того, количество клеток, которые должны быть помещены в один контейнер для криоконсервации клеток, предпочтительно составляет от 5 x 106 до 9,2 x 108.
Подходящие контейнеры для криоконсервации клеток, суспендированных в криоконсервирующей жидкости для приготовления клеток, а также процедуры и условия для замораживания и сохранения клеток такие же, как уже описанные для криоконсервации промежуточных клеток.
Криоконсервированные таким образом клетки можно использовать в качестве фармацевтических препаратов (клеточных препаратов, полученных из пульпы зуба), содержащих в качестве активных компонентов клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками. В этом случае клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками транспортируются в замороженном состоянии и оттаивают при использовании для введения пациенту.
Жизнеспособность клеток, содержащихся в клеточных препаратах из пульпы зуба, полученных с помощью продуцирующей культуры, сразу после оттаивания предпочтительно больше или равна 50%, более предпочтительно больше или равна 60%, а еще более предпочтительно больше. чем или равным 70%, и предпочтительно, например, больше или равно 80%, больше или равно 90% или больше или равно 95%. В качестве клеточных препаратов, полученных из пульпы зуба, которые являются фармацевтическими препаратами, в соответствии с надлежащим образом установленными стандартами можно использовать только клетки, имеющие определенное значение или более высокое значение жизнеспособности.
Когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируют в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в хондроциты, наблюдается повышение уровня экспрессии аггрекана в целом. Кроме того, когда клетки культивируются в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в остеоциты, в целом наблюдается увеличение количества кальция, накопленного в клетках. То есть клетки обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и остеоциты при наблюдении в целом.
В одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD73, CD90, CD105 и CD166 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Точно так же клетки отрицательны, по меньшей мере, по одному из CD34 и CD45. Например, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными по CD73 и CD90 и отрицательными по CD34 или, например, положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов сразу после размораживания клеток или при культивировании клеток после размораживания.
Кроме того, в одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD40, CD80, CD86 и антигена MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Например, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными по CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов сразу после того как клетки размораживают или когда клетки культивируют после размораживания. Известно, что когда клетки, положительные по этим маркерам поверхностных антигенов, трансплантируются аллогенным индивидуумам, клетки имеют тенденцию распознаваться как антиген, который необходимо исключить из живого организма. В случае, когда клетки отрицательны, по меньшей мере, по одному из этих маркеров поверхностных антигенов, это означает, что клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, являются гипоиммуногенными до такой степени и имеют тенденцию и вряд ли будут исключаться из живого организма при трансплантации аллогенным индивидуумам. Кроме того, клетки могут оставаться отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и быть положительными по антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов, когда клетки стимулируются IFN-γ. Клетки остаются, например, отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда, например, клетки стимулируются IFN-γ.
Кроме того, в одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются, например, положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34, CD40, CD45, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов сразу после размораживания клеток или при культивировании клеток после размораживания. Клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются IFN-γ.
В одном воплощении, касательно характеристики (d-1), когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD29, CD44, CD59 и CD164 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
Кроме того, в одном воплощении, касательно характеристики (d-2), когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD9, CD13, CD46, CD47, CD58, CD63, CD73, CD81, CD90, CD98, CD147, HLA-A, -B и -C и EGF-R в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
Кроме того, в одном воплощении, касательно характеристики (d-3), когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD49b, CD49c, CD49e, CD55, CD95, CD151 и CD166 в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 65%, более предпочтительно, по меньшей мере, 75% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
Кроме того, в одном воплощении, касательно характеристики (d-4), когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD10, CD49f, CD105 и CD140b в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В данном документе, когда наблюдаются индивидуальные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 75% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, предпочтительно имеют две или более, более предпочтительно три или более, а еще более предпочтительно все характеристики, представленные в описанных выше (d-1), (d-2), (d-3) и (d-4). Например, клетки, имеющие характеристики, представленные в описанных выше (d-1) и (d-2), являются подходящим воплощением настоящего изобретения.
В одном воплощении, касательно характеристики (d-5), когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD1a, CD1d, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8a, CD8b, CD11b, CD11c, CD15, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD28, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD37, CD38, CD41a, CD86, CD87, CD88, CD89, CDw93, CD94, CD100, CD102, CD103, CD114, CD117, CD118, CD120b, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD126, CD127, CD128b, CD132, CD134, CD135, CD137, лиганда CD137, CD138, CD144, CD150, CD153, CD154, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD172b, CD177, CD178, CD180, CD184, CD195, CD205, CD19 CD210, CD212, CD220, CD226, CD229, CD231, CD235a, CD244, CD255, CD267, CD268, CD278, CD279, CD282, CD294, CD305, CD309, CD314, CD321, CDw327, CDw328, CD329, CD335, CD335, CD335, BLTR-1, CLIP, CMRF-44, CMRF-56, fMLP-R, SSEA-1, TRA-1-60, CLA, интегрина β7 и инвариантного NKT в паттернах экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
Здесь, когда наблюдаются отдельные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно по большей мере 10%, более предпочтительно по большей мере 5% и еще более предпочтительно по большей мере 2% и еще более предпочтительно по большей мере 1% наблюдаемых клеток положительны по этим антигенам.
В одном воплощении, касательно характеристики (d-6), когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD1b, CD6, CD27, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD45, CD45RB, CD48, CD50, CD53, CD57, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD66b, CD66f, CD69, CD70, CD72, CD75, CD84, CD85, CD97, CD99R, CD183, CD193, SSEA-3 и γδ TCR в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
Здесь, когда наблюдаются отдельные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно только, по большей мере, 10%, более предпочтительно только, по большей мере, 5% и еще более предпочтительно только, по большей мере, 2% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, касательно характеристики (d-7), когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD4v4, CD14, CD36, CD45RA, CD45RO, CD66 (a, c, d, e), CD79b, CD83, CD106, CD152, CD209, CD271, CD275, CD326, MIC A/B и αβ TCR в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
Здесь, когда наблюдаются отдельные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно по большей мере 10% и более предпочтительно по большей мере 5% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении, касательно характеристики (d-8), когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, предпочтительно по всем из числа CD26, CD40, CD56, CD80, CD146 и антигена MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
Здесь, когда наблюдаются отдельные клетки, включенные во все клетки, предпочтительно только, по большей мере, 20% и более предпочтительно только, по большей мере, 10% наблюдаемых клеток являются положительными по этим антигенам.
В одном воплощении клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, предпочтительно имеют две или более, более предпочтительно три или более, а еще более предпочтительно все характеристики, представленные в вышеописанных (d-1), (d-2), (d-3), (d-4), (d-5), (d-6), (d-7) и (d-8). Например, клетки, имеющие характеристики, представленные в вышеописанных (d-1) и (d-5), являются подходящим воплощением настоящего изобретения.
Кроме того, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки экспрессируют простагландин E2 (PGE2) и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) сразу после размораживания или во время культивирования после размораживания, а уровень экспрессии простагландина E2 (PGE2) увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α.
Кроме того, в одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируют в присутствии IFN-γ, количество секретируемого кинуренина увеличивается.
В одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD19, CD34 и CD206 в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Кроме того, в одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD19, CD31, CD33, CD34, CD38, CD45, CD206, CD235a и SSEA-1 в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, являются отрицательными, по меньшей мере, по одному, например, по всем из числа CD19, CD26, CD34, CD56, CD106, CD117, CD146 и CD271.
В одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, например, по всем из числа CD140b и HLA-A, -B и - C в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, например, по всем из числа CD10, CD49e и CD95 в профилях экспрессии маркеры поверхностных антигенов.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, например, по всем из числа CD46, CD47, CD55, CD58. и CD59 в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются, например, положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD73, CD90, CD105 и CD166, и отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD34 и CD45 в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
Кроме того, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом сразу после размораживания или при культивировании после размораживания, клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34, CD40, CD45, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Кроме того, клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются IFN-γ. Кроме того, клетки экспрессируют простагландин E2 (PGE2) и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), а количество секретируемого простагландина E2 (PGE2) увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α.
Когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируются, клетки секретируют различные гуморальные факторы.
В одном воплощении, касательно характеристики (d-9), когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируются, то клетки экспрессируют, по меньшей мере, один, предпочтительно все из числа ММР-2, IGFBP-4 и цистатина С.
Кроме того, касательно характеристики (d-10), в одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируются, то клетки экспрессируют, по меньшей мере, один, предпочтительно все из числа IL-6, IL- 11, MCP-1, IL-8, GROα, HGF, VEGF, VCAM-1, TIMP-3, TIMP-2 и TIMP-1.
Кроме того, касательно характеристики (d-11), в одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируются, то клетки экспрессируют, по меньшей мере, один, предпочтительно все из числа IL-23, IFN- а, TNF-α, IL-18, IL-27, TARC, ENA-78, MIP-3α, MIP-1β, IP-10, SCF и ICAM-1.
Кроме того, касательно характеристики (d-12), в одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируются, то клетки не экспрессируют или почти не экспрессируют, по меньшей мере, один, предпочтительно все из числа IL- 21, эотаксина, MIP-1a, MIG, I-TAC, IP-10 и GM-CSF.
Кроме того, касательно характеристики (d-13), в одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируются, то по меньшей мере, один из уровней экспрессии IL-6, IL-23, IL-11, MCP-1, ENA-78, HGF, VEGF, MMP-2, IGFBP-4, цистатина C, TIMP-3, TIMP-2 и TIMP-1 увеличивается по сравнению с уровнем экспрессии в промежуточных клетках. Например, уровень экспрессии IL-6, IL-11, HGF, TIMP-3 и TIMP-1 увеличивается по сравнению с уровнем экспрессии в промежуточных клетках.
Кроме того, касательно характеристики (d-14), в одном воплощении, в случае, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируют в присутствии TNF-α или IFN-γ, то уровень экспрессии IL-6 выше, чем в случае культивирования клеток в отсутствие таковых.
Кроме того, касательно характеристики (d-15), в одном воплощении, в случае, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируются в присутствии TNF-α или IFN-γ, то уровень экспрессии IL-11 выше, чем в случае культивирования клеток в отсутствие таковых.
Кроме того, касательно характеристики (d-16), в одном воплощении в случае, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируют в присутствии TNF-α или IFN-γ, то уровень экспрессии IP-10 выше, чем в случае культивирования клеток в отсутствие таковых.
Кроме того, касательно характеристики (d-17), в одном воплощении, в случае, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируют в присутствии TNF-α или IFN-γ, то уровень экспрессии МСР-1 выше, чем в случае культивирования клеток в отсутствие таковых.
Кроме того, касательно характеристики (d-18), в одном воплощении экспрессия GM-CSF индуцируется, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируются в присутствии TNF-α, но экспрессия GM-CSF не индуцируется, когда клетки культивируются в присутствии IFN-γ.
Кроме того, касательно характеристики (d-19), в одном воплощении уровень экспрессии HGF снижается, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируют в присутствии TNF-α по сравнению со случаем, когда клетки культивируют в его отсутствие, тогда как уровень экспрессии HGF увеличивается, когда клетки культивируют в присутствии IFN-γ, по сравнению со случаем, когда клетки культивируют в его отсутствие.
Кроме того, касательно характеристики (d-20), в одном воплощении, в случае, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируют в присутствии TNF-α, уровень экспрессии IL- 8 выше, чем в случае, когда клетки культивируют в их отсутствие.
В одном воплощении изобретения клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, по настоящему изобретению предпочтительно имеют две или более, более предпочтительно три или более, еще более предпочтительно четыре или более, а еще более предпочтительно все характеристики, представленные в описанных выше (d-9) - (d-20). Например, клетки, имеющие характеристики, представленные в описанных выше (d-9) и (d-16), и клетки, имеющие характеристики, представленные в описанных выше (d-9), (d-15) и (d-16), представляют собой подходящее воплощение настоящего изобретения.
Кроме того, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом сразу после размораживания или при культивировании после размораживания, уровень экспрессии аггрекана увеличивается в том случае, когда клетки культивируются в среде, содержащей вещество, которое, как известно, вызывает дифференцировку в хондроциты. Кроме того, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, культивируют в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в остеоциты, и наблюдаются в целом, количество кальция, накопленного в клетках, увеличивается. То есть клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и остеоциты. Тот факт, что клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, обладают способностью дифференцироваться в хондроциты и способностью дифференцироваться в остеоциты, может быть исследован соответственно с помощью способов, описанных в Примерах 20 и 19. Только группы клеток, у которых подтверждена способность дифференцироваться в хондроциты и способность дифференцироваться в остеоциты с помощью этих способов, могут поставляться в медицинские учреждения в качестве продуктов.
Согласно соответствующим образом установленным стандартам, только клетки, демонстрирующие заранее определенные профили экспрессии маркеров поверхностных антигенов и/или профили экспрессии генов, могут быть сохранены в виде клеточных препаратов, полученных из пульпы зуба.
Кроме того, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом сразу после размораживания или при культивировании после размораживания, эти клетки в основном относятся к плюрипотентным стволовым клеткам, полученным из пульпы зуба. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, в прикрепленной культуре наблюдаются под оптическим микроскопом как прикрепленные клетки по существу в форме веретена. Доля по существу веретеновидных клеток во всех клетках прикрепленной культуры при наблюдении под оптическим микроскопом предпочтительно больше или равна 99%, более предпочтительно больше или равна 99,5%, еще более предпочтительно больше или равна 99,9%. и еще более предпочтительно больше или равно 99,95%. Только клеточные препараты, полученные из пульпы зуба, имеющие определенную ценность или большую долю по существу веретенообразных клеток, могут поставляться в медицинские учреждения в качестве изделия в соответствии с надлежащим образом установленными стандартами.
Кроме того, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, культивируют после размораживания, клетки обладают способностью претерпевать, по меньшей мере, 3 деления клеток, предпочтительно обладают способностью претерпевать, по меньшей мере, 4 деления клеток, более предпочтительно обладают способностью претерпевать, по меньшей мере, 5 клеточных делений, а еще более предпочтительно способность претерпевать, по меньшей мере, 10 делений клеток. Кроме того, среднее время удвоения клеточных препаратов, полученных из пульпы зуба, при их размораживании и культивировании в планшете для культивирования клеток предпочтительно составляет в диапазоне 96 часов, более предпочтительно в диапазоне 84 часов, еще более предпочтительно в диапазоне 72 часов, еще более предпочтительно в диапазоне 48 часов, а еще более предпочтительно в диапазоне 36 часов. В этот момент, используют условия культивирования клеток, которые являются такими же или эквивалентными условиям для вышеописанных клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, описанных, например, в Примере 5. Только клеточные препараты, полученные из пульпы зуба, обладающие способностью претерпевать клеточные деления определенное количество раз или более, могут поставляться в медицинские учреждения в качестве изделия в соответствии с надлежащим образом установленными стандартами. Кроме того, только клеточные препараты, полученные из пульпы зуба, имеющие среднее время удвоения в течение определенного времени, также могут поставляться в медицинские учреждения в качестве изделия в соответствии с надлежащим образом установленными стандартами. Такими стандартами являются, например, клетки, обладающие способностью претерпевать, по меньшей мере, 3 деления клеток и среднее время удвоения в течение 72 часов, клетки, обладающие способностью претерпевать, по меньшей мере, 4 делений клеток и среднее время удвоения в течение 72 часов, и клетки, имеющие способность претерпевать как минимум 5 делений клеток и среднее время удвоения в течение 72 часов.
То есть клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, сохраняют свойства стволовых клеток, которые обладают высокой способностью к делению и могут дифференцироваться в два или более типов клеток. Промежуточные клетки, которые будут использоваться на следующей стадии культивирования, также могут называться клетками, имеющими высокую колониеобразующую способность.
Клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, предпочтительно претерпели, по меньшей мере, 16 клеточных делений в среде in vitro. Например, клетки претерпели как минимум 21, 22 или 23 клеточных деления.
Когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, размораживают, средний диаметр клеток в состоянии, в котором клетки находятся в суспензионной культуре в растворе, например, в среде, меньше или равен 20 мкм или меньше или равно 18 мкм, и составляет, например, от 10 до 20 мкм, от 10 до 18 мкм, от 12 до 20 мкм, от 14 до 20 мкм и от 16 до 20 мкм.
Примеры качественных тестов клеток, содержащихся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, представлены ниже как качественные тесты a' - k'. Качественные тесты проводятся по одному или более пунктам. Все эти пункты могут быть выполнены. Клетки, которые будут использоваться для качественных тестов в настоящее время, представляют собой либо клетки (1) в качестве клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, полученных путем фракционирования некоторых клеток перед их суспендированием в жидкости для криоконсервации, клетки (2) в качестве клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, полученные путем фракционирования некоторых клеток перед их суспендированием в жидкости для криоконсервации и последующим субкультивированием этих фракционированных клеток, клетки (3), в качестве клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, перед замораживанием, которые были суспендированы в жидкости для криоконсервации для замораживания, клетки (4) в качестве клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, сразу после размораживания замороженных клеток, или клетки (5), в качестве клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, полученные путем размораживания замороженных клеток и дальнейшего культивирования размороженных клеток. Если не указано иное, один и тот же качественный тест может быть выполнен на двух или более из этих клеток (1) - (5).
(Качественный тест а’) Проверка того, что доля числа клеток, показывающих по существу веретеновидную форму во всех клетках при наблюдении под оптическим микроскопом, больше или равна 99%, больше или равна 99,5%, больше, чем или равно 99,9%, или больше или равно 99,95.
(Качественный тест b’) Проверка того, что жизнеспособность клетки больше или равна 50%, больше или равна 60%, больше или равна 70%, больше или равна 80%, больше или равна 90% или больше или равна 95%.
(Качественный тест c’) Проверка того, что клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45 в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, или проверка того, что клетки положительны, по меньшей мере, по одному из CD73 и CD90 и отрицательны по CD34 в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности.
(Качественный тест d’) Проверка того, что клетки отрицательны по CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, или проверка того, что клетки отрицательны, по меньшей мере, по CD40, CD80, CD86 и по антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности.
(Качественный тест е’) Проверка того, что клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, когда клетки стимулируются IFN-γ, или проверка меньшей мере, одного из того, что клетки являются отрицательными по CD40, отрицательными по CD80, отрицательными по CD86 и отрицательными по антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, когда клетки стимулируются IFN-γ.
(Качественный тест f) Проверка того, что клетки экспрессируют простагландин E2 (PGE2) и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), а уровень экспрессии простагландина E2 (PGE2) повышается путем стимуляции клеток TNF-α.
(Качественный тест g’) Проверка того, что уровень экспрессии аггрекана увеличивается при культивировании клеток в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в хондроциты.
(Качественный тест h’) Проверка того, что количество кальция, накопленного в клетках, увеличивается при культивировании клеток в среде, содержащей вещество, которое, как известно, индуцирует дифференцировку в остеоциты.
(Качественный тест i’) Проверка того, что клетки обладают способностью претерпевать, по меньшей мере, 3, 4 или 5 делений клеток в планшете для культивирования клеток.
(Качественный тест j) Проверка того, что среднее время удвоения клеток в планшете для культивирования клеток составляет 96 часов, 84 часа, 72 часа, 48 часов или 36 часов в течение качественного теста i.
(Качественный тест k’) Проверка того, что средний диаметр клеток в состоянии, когда клетки находятся в суспензионной культуре, меньше или равен 20 мкм, меньше или равен 18 мкм, от 10 до 20 мкм, от 10 до 18 мкм, от 12 до 20 мкм, от 14 до 20 мкм или от 16 до 20 мкм.
Вышеописанные качественные тесты могут быть выполнены по произвольным 10 пунктам (Качественный тест a’) - (Качественный тест j'). Кроме того, из этих 10 пунктов можно выбрать произвольные 9 пунктов для проведения качественных тестов. В случае, если для проведения качественных тестов выбрано 9 пунктов, например, могут быть выбраны качественные тесты a’, b', c’, d', e’, f, g', i 'и j', без каких-либо ограничений. Кроме того, из этих 10 элементов можно выбрать произвольные 8 элементов для проведения качественных тестов. В случае, когда для проведения качественных тестов выбрано 8 пунктов, можно выбрать, например, качественные тесты a’, b', c’, d', e’, f, i' и j’, без каких-либо ограничений. Кроме того, из этих 10 пунктов можно выбрать произвольные 7 пунктов для проведения качественных тестов. В случае, когда для проведения качественных тестов выбрано 7 элементов, например, качественные тесты a’, b', c’, d', e’, i' и j 'могут быть выбраны, без каких-либо ограничений. Кроме того, из этих 10 пунктов можно выбрать произвольные 6 пунктов для проведения качественных тестов. В случае, когда для проведения качественных тестов выбрано 6 элементов, можно выбрать, например, качественные тесты a’, b', c’, d', i 'и j', без каких-либо ограничений. Кроме того, из этих 10 пунктов можно выбрать произвольные 5 пунктов для проведения качественных тестов. В случае, если для проведения качественных тестов выбрано 5 элементов, например, могут быть выбраны качественные тесты a’, b', c’, i' и j’, без каких-либо ограничений. Кроме того, из этих 10 пунктов можно выбрать произвольные 4 пункта для проведения качественных тестов. В случае, когда для проведения качественных тестов выбрано 4 пункта, например, могут быть выбраны качественные тесты a’, b', c 'и j', без каких-либо ограничений. Кроме того, из этих 10 элементов можно выбрать произвольные 3 пункта для проведения качественных тестов. В случае, когда выбрано 3 пункта для проведения качественных тестов, например, могут быть выбраны качественные тесты a, b и c, без каких-либо ограничений. Кроме того, из этих 10 пунктов можно выбрать произвольные 2 пункта для проведения качественных тестов. В случае, если для проведения качественных тестов выбраны 2 пункта, например, могут быть выбраны, но без ограничений, качественные тесты a 'и b', качественные тесты a 'и c', качественные тесты a 'и d', качественные тесты a 'и e', качественные тесты a 'и f', качественные тесты a 'и g', качественные тесты a 'и h', качественные тесты a 'и i', качественные тесты a 'и j', качественные тесты b 'и c', качественные тесты b 'и d', качественные тесты b 'и e', качественные тесты b 'и f', качественные тесты b 'и g', качественные тесты b 'и h', качественные тесты b и i, качественные тесты b и j, качественные тесты c и d, качественные тесты c и e, качественные тесты c 'и f, качественные тесты c' и g’, качественные тесты c' и h’, качественные тесты c' и i’, качественные тесты c' и j ' , качественные тесты d 'и e', качественные тесты d 'и f, качественные тесты d' и g’, качественные тесты d' и h’, качественные тесты d' и i’, качественные тесты d' и j’, качественные тесты e 'и f, качественные тесты e' и g’, качественные тесты e' и h’, качественные тесты e' и i’, качественные тесты e' и j’, качественные тесты f и i', качественные тесты f и j ' , или качественные тесты i' и j'.
В способе получения клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками по настоящему изобретению, плюрипотентные стволовые клетки, содержащиеся в пульпе зуба, культивируют, пролиферируют и криоконсервируют в качестве промежуточных клеток, а затем размораживают, дополнительно культивируют и пролиферируют с образованием клеточного препарата, полученного из пульпы зуба. Процесс до получения клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, из промежуточных клеток, включает стадию культивирования плюрипотентных стволовых клеток в состоянии, в котором плюрипотентные стволовые клетки прикреплены к поверхности частиц. Благодаря включению такой стадии в одном воплощении клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, обладают свойствами, отличными от промежуточных клеток.
Например, что касается коэффициентов положительности поверхностных антигенов, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки имеют высокие коэффициенты положительности по любому одному или всем из числа CD39, CD49a, CD61, CD107a, CD107b и CD143 в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов по сравнению с промежуточными клетками. Например, клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, имеют высокий коэффициент положительности по CD107b по сравнению с промежуточными клетками. Коэффициент положительности этих поверхностных антигенов клеток, содержащихся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, предпочтительно, по меньшей мере, на 10% выше и более предпочтительно, по меньшей мере, на 20% выше, чем у промежуточных клеток. Кроме того, клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, имеют низкий коэффициент положительности по CD146 по сравнению с промежуточными клетками. Коэффициент положительности клеток по CD146 у клеток, содержащихся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, по меньшей мере, на 20% меньше или, по меньшей мере, на 50% меньше, чем у промежуточных клеток.
Кроме того, например, что касается уровней экспрессии гуморальных факторов, клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, имеют высокие уровни экспрессии любого одного или всех из числа IL-6, IL-23, IL-11, MCP-1, ENA-78, HGF, VEGF, MMP-2, IGFBP-4, цистатина C, TIMP-3, TIMP-2 и TIMP-1 по сравнению с промежуточными клетками. В частности, клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, обладают высокими уровнями экспрессии одного или всех из числа IL-6, IL-11, HGF, IGFBP-4, TIMP-3 и TIMP-1 по сравнению с промежуточными клетками. В частности, клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, обладают высокими уровнями экспрессии одного или всех из числа IL-6 и HGF по сравнению с промежуточными клетками.
Промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, сохраняют свойства стволовых клеток, которые обладают высокой способностью к делению, и могут дифференцироваться на два или более типа клеток. Эти клетки также можно назвать клетками, имеющими высокую колониеобразующую способность.
Когда промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются, например, положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD34 и CD45 в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Например, промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, являются, например, положительными по CD73 и CD90 и отрицательными по CD34 в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Эти профили экспрессии являются общими для мезенхимальных стволовых клеток. Однако эти профили экспрессии также обладают характерными свойствами.
В одном воплощении настоящего изобретения, когда промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному или всем из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному или по всем из числа CD19, CD34 и CD206 в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Кроме того, в одном воплощении настоящего изобретения, когда клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному или по всем из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному или по всем из числа CD19, CD31, CD33, CD34, CD38, CD45, CD206, CD235a и SSEA-1 в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в промежуточных клетках, и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются отрицательными, по меньшей мере, по одному из, например, по всем из числа CD19, CD26, CD34, CD106, CD117 и CD271 в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Кроме того, клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, являются отрицательными, по меньшей мере, по одному из, например, по всем из числа CD19, CD26, CD34, CD56, CD106, CD117, CD146 и CD271. Среди них, хотя функция CD106 недостаточно выяснена, считается, что CD106 участвует в активации воспалительных сигналов, поскольку он экспрессируется в эндотелиальных клетках сосудов в участке воспаления. Профили экспрессии этих поверхностных антигенов отличаются от тех, которые обычно известны как стволовые клетки, обладающие высокой колониеобразующей способностью, но, тем не менее, удивительно, что промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, имеют высокую колониеобразующую способность.
В одном воплощении, когда промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, например, по всем из числа CD140b и HLA-A, - B и -C в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному, например, по всем из числа CD49e, и CD95 в профилях экспрессии маркеров поверхностных антигенов.
В одном воплощении, когда промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными по CD10 в профиле экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Хотя функция CD10 недостаточно изучена, существует вероятность того, что CD10 может участвовать в конвергенции воспалительных реакций путем разложения связанных с воспалением пептидов и связанных с воспалением веществ, таких как энкефалин или вещество P.
Кроме того, в одном воплощении, когда клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом, клетки имеют высокий коэффициент положительности по CD39 в профиле экспрессии маркеров поверхностных антигенов по сравнению с промежуточными клетками. Кроме того, все эти клетки положительны по CD73. CD39 взаимодействует с CD73 для преобразования АТФ в аденозин, тем самым увеличивая внеклеточную концентрацию аденозина. Аденозин подавляет воспаление, отрицательно контролируя иммунный ответ. Считается, что эта функция в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, имеющем процент положительных по CD39, выше, чем у промежуточных клеток.
Кроме того, в одном воплощении, когда промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, наблюдаются в целом (популяция), эти клетки являются положительными по CD46 в профиле экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Считается, что CD46 участвует в уходе от комплемент-зависимой цитотоксичности путем подавления активности комплемента (C3).
Кроме того, в одном воплощении, когда эти клетки наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными по CD47 в профиле экспрессии маркеров поверхностных антигенов. CD47 придает клеткам устойчивость к фагоцитозу макрофагов.
Кроме того, в одном воплощении, когда эти клетки наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными по CD55 в профиле экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Считается, что CD55 выполняет функцию регуляции классического или второго пути комплемента и участвует в предотвращении цитотоксичности за счет комплемента.
Кроме того, в одном воплощении, когда эти клетки наблюдаются в целом, эти клетки являются положительными по CD58 в профиле экспрессии маркеров поверхностных антигенов. Хотя функция CD58 недостаточно изучена, предполагается, что CD58 способствует конвергенции воспалительных реакций, индуцируя регуляторные Т-клетки (Treg-клетки).
Кроме того, в одном воплощении эти клетки положительны по CD59. Считается, что CD59 участвует в предотвращении цитотоксичности из-за комплемента, ингибируя образование комплексов, повреждающих мембраны, путем воздействия на комплемент (C9).
Промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, секретируют различные гуморальные факторы. В одном воплощении промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, секретируют, по меньшей мере, один, например, все из числа MMP-2, IGFBP-4, цистатина C, IL-6, IL-11, MCP- 1, IL-8, HGF, фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF), TIMP-1, TIMP-2 и TIMP-3. Кроме того, промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, секретируют, по меньшей мере, один, например, все из числа GROα, VCAM-I и IP-10.
В одном воплощении промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, секретируют IL-6. Количество секретируемого IL-6 увеличивается из-за стимуляции TNF-α и IFN-γ. Хотя IL-6 также известен как воспалительный цитокин, известно, что воспалительная реакция в печени усиливается у мышей с дефицитом IL-6. Поэтому считается, что IL-6 обладает противовоспалительным действием.
Промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, секретируют различные гуморальные факторы. В одном воплощении промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, секретируют IL-11. Количество секретируемого IL-11 увеличивается из-за стимуляции TNF-α и стимуляции IFN-γ. Считается, что IL-11 проявляет противовоспалительный эффект, подавляя секрецию воспалительного цитокина.
Промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, секретируют различные гуморальные факторы. В одном воплощении промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточных препаратах, полученных из пульпы зуба, секретируют IP-10. Количество секретируемого IP-10 увеличивается из-за стимуляции TNF-α и стимуляции IFN-γ. Считается, что IP-10 проявляет противовоспалительный эффект, подавляя секрецию воспалительного цитокина.
Клетки, полученные из пульпы зуба, обладают такими функциями, как противовоспалительный эффект. Некоторые или все описанные выше поверхностные антигены и гуморальные факторы, а также другие элементы взаимодействуют друг с другом для выполнения своих функций.
Фармацевтическая композиция, содержащая клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, по настоящему изобретению в качестве активного компонента, может использоваться в качестве терапевтических агентов при различных заболеваниях. Например, клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, можно использовать для лечения и предотвращения заболеваний или расстройств, выбранных из группы, состоящей из аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний, ревматоидного артрита, болезни Крона, хронического воспалительного заболевания кишечника, инфаркта миокарда, инфаркта головного мозга (включая хронический инфаркт головного мозга и острый инфаркт мозга), хронического воспалительного демиелинизирующего полиневрита, рассеянного склероза, системной красной волчанки, цирроза печени (включая декомпенсированный цирроз печени), сепсиса, остеоартрита, псориаза и отторжения трансплантата органа. Клеточный препарат, содержащий стволовые клетки, такие как мезенхимальные стволовые клетки, известен как клеточный препарат, который можно использовать в качестве терапевтического агента при аутоиммунных заболеваниях и т.п. Однако известные клеточные препараты не проявляют значительных терапевтических эффектов у всех пациентов, и их использование также ограничено. Клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, по настоящему изобретению добавляет разнообразия клеточным препаратам, которые можно использовать в качестве терапевтических агентов при аутоиммунных заболеваниях и т.п. Например, можно предоставить новые возможности лечения для пациентов, которые не получили никаких терапевтических эффектов от хорошо известных клеточных препаратов, или для пациентов, страдающих заболеваниями, для которых терапевтический эффект не был доказан с помощью хорошо известных клеточных препаратов, с использованием клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, по настоящему изобретению в качестве терапевтических агентов для пациентов.
Клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, вводят пациентам, страдающим описанными выше заболеваниями, с помощью таких средств, как внутривенная капельная инфузия или местная инъекция.
Клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, размораживают при применении. Во время применения клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, вынимают из контейнера для хранения в жидком азоте и размораживают. Размораживание выполняется путем нагревания на водяной бане, например, от 36,5°C до 37,5°C. Размороженный клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, можно вводить людям в виде фармацевтических продуктов с помощью таких средств, как внутривенная капельная инфузия или местная инъекция. В случае внутривенной капельной инфузии клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, переносится в диализный мешок из флакона и затем вводится пациенту посредством внутривенной капельной инфузии. В случае местной инъекции клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, переносится в шприц из флакона, а затем вводится местно пациенту.
Ожидается, что размораживание клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, перед применением будет проводиться в медицинских учреждениях. Поставка клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, в медицинские учреждения осуществляется, например, следующим образом, но настоящее изобретение конкретно этим не ограничивается. Клеточные препараты, полученные из пульпы зубов, которые были криоконсервированы в хранилищах их производителей, дистрибьюторов и т.п., отправляются в замороженном состоянии в ответ на запросы медицинских учреждений и транспортируются в медицинские учреждения. Препараты, которые хранились в медицинских учреждениях в замороженном состоянии, размораживают непосредственно перед введением пациентам, а затем вводят пациентам посредством внутривенной инъекции или тому подобного. Мобильный низкотемпературный рабочий стол (WO2017/099105) может быть подходящим образом использован в качестве устройства для работы с клеточными препаратами, полученными из пульпы зуба, в замороженном состоянии.
Примеры
В дальнейшем настоящее изобретение будет описано подробно со ссылкой на примеры, но настоящее изобретение не преследует цели ограничения примерами.
Пример 1: Приготовление среды и реагента
Среда DMEM (10% FBS): получали добавлением FBS (GE Healthcare) к DMEM с низким содержанием глюкозы (при концентрации глюкозы 5,56 мМ, GE Healthcare), так что конечная концентрация FBS составила 10%.
Среда DMEM (20% FBS): получали добавлением FBS (GE Healthcare) к DMEM с низким содержанием глюкозы (при концентрации глюкозы 5,56 мМ, GE Healthcare), так что конечная концентрация FBS стала 20%.
Водный раствор стрептомицина: получали растворением сульфата стрептомицина в чистой воде так, чтобы конечная концентрация сульфата стрептомицина составляла 0,01 г/мл.
Раствор протеазы: готовили добавлением DMEM с низким содержанием глюкозы к 5 мг либеразы (Roche) так, чтобы конечная концентрация DMEM с низким содержанием глюкозы составляла 2,5 мг/мл. Это раствор, содержащий коллагеназу I, коллагеназу II и термолизин в качестве протеаз.
Среда со стрептомицином DMEM (20% FBS): получена путем смешивания среды DMEM (20% FBS) с раствором стрептомицина в объемном соотношении 100:1.
Раствор трипсин-EDTA: 0,25% раствор трипсин-EDTA (Thermo Fisher Scientific Inc.)
1% раствор хлоргексидина глюконата: получают разбавлением 5% (масс./об.) раствора Fermajin (SIOE PHARMACEUTICAL CO., LTD.) в 5 раз водой для инъекций.
Бикарбонатный раствор Рингера: инфузионный раствор BICARBON (AY Pharmaceuticals Co., Ltd.), имеющий состав, показанный в Таблицах 7 и 8 ниже.
Таблица 7. Компонентная композиция бикарбонатного раствора Рингера
Отношение осмотического давления жидкости для криоконсервации для промежуточных клеток к физиологическому раствору при pH от 6,8 до 7,8 от 0,9 до 1,0
Таблица 8. Концентрация электролита в бикарбонатном растворе Рингера
Раствор человеческого сывороточного альбумина: KENKETSU Albumin 25-NICHIYAKU (NIHON PHARMACEUTICAL CO., LTD.), имеющий композицию, показанную в Таблице 9 ниже.
Таблица 9. Компонентная композиция раствора человеческого сывороточного альбумина
(Примечание) Концентрация ионов натрия в растворе: 40,7 мэкв/л.
Промывочный раствор: получают добавлением 50 мл 25% (масс./об.) раствора человеческого сывороточного альбумина (NIHON PHARMACEUTICAL CO., LTD.) к 1000 мл бикарбонатного раствора Рингера (инфузионный раствор BICARBON, AY Pharmaceuticals Co., Ltd.) так, чтобы конечная концентрация человеческого сывороточного альбумина составила 1,19% (масс./об.). Композиция промывочного раствора представлена в Таблицах 10 и 11.
Таблица 10. Компонентная композиция промывочного раствора
Таблица 11. Концентрация электролита, содержащегося в промывочном растворе (без альбумина)
Цитопротекторный раствор: получают с помощью раствора Рингера (инфузионный раствор BICARBON, AY Pharmaceuticals Co., Ltd.), 25% раствора человеческого сывороточного альбумина и диметилсульфоксида.
Таблица 12. Концентрация цитопротекторного раствора
(Примечание) Единица концентрации человеческого сывороточного альбумина - г/л, единица концентрации DMSO - % (об./об.).
Пример 2: Получение пульпы зуба из удаленного зуба человека
Один удаленный зуб человека (третий коренной зуб), полученный при получении информированного согласия, был слегка промыт бикарбонатным раствором Рингера (BICARBON Injection), а затем поверхность удаленного зуба была стерилизована 1% раствором глюконата хлоргексидина. Затем удаленный зуб был разрушен, чтобы отделить пульпу зуба от других тканей.
Пример 3: Ферментативная обработка пульпы зуба
После добавления раствора протеазы, разбавленного DMEM с низким содержанием глюкозы примерно в 10 раз ниже, к пульпе зуба, полученной в Примере 2, пульпу зуба оставляли в водяной бане, установленной на 37°C, до тех пор, пока визуально не наблюдали, что ткани достаточно разложились.
Затем итоговое количество клеток после ферментативной обработки переносили в центрифужную пробирку, к ней добавляли среду DMEM со стрептомицином (20% FBS), чтобы остановить ферментативную реакцию, и полученный продукт центрифугировали для осаждения кусочков ткани, клеток и т.п. Надосадочную жидкость удаляли, к полученному осадку добавляли среду DMEM со стрептомицином (20% FBS) для суспендирования кусочков ткани, клеток и т.п., и суспензию снова центрифугировали для осаждения клеток и т.п. К осадку добавляли среду DMEM со стрептомицином (20% FBS), клетки осторожно суспендировали с помощью пипетирования с получением суспензии пульпы зуба, содержащей кусочки ткани, клетки, полученные из пульпы зуба, и т.п.
Пример 4: Культура суспензии пульпы зуба
Суспензию пульпы зуба, приготовленную в Примере 3, добавляли в планшет для культивирования клеток для начала культивирования при 37°C в присутствии 5% CO2. Культивирование продолжали до тех пор, пока колония, образовавшаяся в планшете, не наблюдалась визуально при замене среды DMEM со стрептомицином (20% FBS) каждые 2-4 дня.
Пример 5: Культура клеток, полученных из пульпы зуба
Среду удаляли из чашки для культивирования клеток, в которой колония наблюдалась визуально, в чашку добавляли раствор трипсин-EDTA так, чтобы поверхности клеток были покрыты раствором, и чашке давали постоять от 5 до 10 минут при 37°C, и клетки отслаивались. Затем в планшет для культивирования клеток добавляли среду DMEM (10% FBS), чтобы остановить реакцию и суспендировали клетки. Эту клеточную суспензию собирали в центрифужную пробирку. Собранные клетки центрифугировали (300×g, 5 минут) и осаждали, и удаляли надосадочную жидкость. Среду DMEM (10% FBS) добавляли в центрифужную пробирку, и клетки суспендировали для получения клеточной суспензии.
После измерения количества живых клеток, содержащихся в клеточной суспензии, клетки высевали в планшет для культивирования клеток так, чтобы их плотность составляла от 3000 до 20000 клеток/см2, и культивирование начинали при 37°C в присутствии 5% СО2. Культивирование продолжали до тех пор, пока клетки не становились конфлуентными в планшете, заменяя среду DMEM (10% FBS) каждые 2-4 дня.
После удаления среды из планшета для культивирования клеток, на котором клетки стали конфлуентными, в планшет добавляли раствор трипсин-EDTA так, чтобы поверхность клеток была покрыта раствором. Планшету давали постоять от 5 до 10 минут при 37°C для отслоения клеток. Затем в планшет добавляли такое же количество среды DMEM (10% FBS), что и раствор трипсин-EDTA, чтобы остановить реакцию, и суспендировали клетки. Эту клеточную суспензию собирали в центрифужную пробирку. Собранные клетки центрифугировали (300×g, 5 минут) и осаждали для удаления надосадочной жидкости, и к ним добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток.
Вышеописанный сбор и культивирование клеток повторяли, и клетки пролиферировали до тех пор, пока количество живых клеток не становилось равным 1 × 108 или более. Число делений клеток (то есть число делений в среде in vitro) в течение этого периода культивирования составляло 16 и 17, а среднее время удвоения клеток было в пределах 2 дней (48 часов) на протяжении всего периода культивирования.
Пример 6: Сбор клеток, полученных из пульпы зуба (промежуточные клетки)
Среду удаляли из планшета для культивирования клеток, на котором клетки становились конфлуентными в последней культуре в Примере 5, и добавляли раствор трипсин-EDTA в планшет так, чтобы поверхности клеток были покрыты раствором. Планшету давали постоять от 5 до 10 минут при 37°C для отслоения клеток. Затем добавляли такое же количество среды DMEM (10% FBS), что и раствора трипсин-EDTA, в планшет для культивирования клеток, чтобы остановить реакцию и суспендировать клетки. Эту клеточную суспензию собирали в контейнер и центрифугировали для осаждения клеток, а надосадочную жидкость удаляли. В контейнер добавляли от 500 мл до 1000 мл промывочного раствора для промывания клеток, и клетки суспендировали. После этого суспензию снова центрифугировали для осаждения клеток и удаляли надосадочную жидкость. Эту операцию промывания клеток проводили повторно, и, наконец, клетки собирали в виде осадка после центрифугирования. Полученные таким образом клетки рассматривали как промежуточные клетки.
Пример 7: Замораживание клеток, полученных из пульпы зуба (промежуточные клетки)
К осажденным клеткам, полученным в Примере 6, добавляли промывочный раствор и цитопротекторный раствор, и клетки суспендировали так, чтобы концентрация клеток составляла 11 × 106 клеток/мл (+ 5%). Флакон для криоконсервации (материал: сополимер циклического олефина, стерильный закрытый флакон, Aseptic Technologies) заполняли суспензией клеток, полученной таким образом, и герметично закрывали. Эту клеточную суспензию рассматривали как промежуточную клеточную суспензию. Компоненты, содержащиеся в части раствора (жидкость для криоконсервации промежуточных клеток) промежуточной клеточной суспензии, показаны в Таблице 13. Промежуточную суспензию клеток замораживали с помощью програмируемого морозильника, а затем переносили в контейнер для хранения жидкого азота и хранили в нем. Эту замороженную промежуточную клеточную суспензию рассматривали как изделие из замороженных промежуточных клеток.
Таблица 13 Компонентная композиция жидкости для криоконсервации для промежуточных клеток
(Примечание) Единица концентрации человеческого сывороточного альбумина - г/л, единица концентрации DMSO - % (об./об.).
Пример 8: Размораживание клеток, полученных из пульпы зуба (промежуточные клетки)
Флакон, заполненный клетками, полученными из пульпы зуба (промежуточные клетки), полученными в Примере 7, вынимали из контейнера для хранения в жидком азоте и размораживали путем нагревания на водяной бане при температуре от 36,5°C до 37,5°C. Размороженную суспензию клеток переносили в центрифужную пробирку и добавляли к ней 30 мл среды DMEM (10% FBS) для суспендирования суспензии клеток. Клетки центрифугировали (300×g, 5 минут) и осаждали, и удаляли надосадочную жидкость. Затем к ним добавляли 20 мл среды DMEM (10% FBS) для суспендирования промежуточных клеток.
Пример 9: Продуцирующая культура (предкультура) клеток, полученных из пульпы зуба
После измерения количества промежуточных живых клеток, содержащихся в суспензии клеток, приготовленной в Примере 8, клетки высевали в планшет для культивирования клеток так, чтобы они имели плотность 20000 клеток/см2, и культивирование начинали при 37°C в присутствии 5% СО2. Культивирование продолжали до тех пор, пока клетки не становились конфлуентными в планшете для культивирования клеток, заменяя среду DMEM (10% FBS) каждые 2-4 дня. Жизнеспособность (количество живых клеток/количество всех клеток x 100%) клеток, содержащихся в оттаявших промежуточных клетках, которую рассчитывали по количеству живых клеток, и она составляла приблизительно от 85% до 95%.
Среду в планшете для культивирования клеток, в котором клетки стали конфлуентными, удаляли, раствор трипсин-EDTA добавляли в планшет так, чтобы поверхности клеток были покрыты раствором, и планшету давали постоять от 5 до 60 минут при 37°C для отслаивания клеток. Затем добавляли такое же количество среды DMEM (10% FBS), что и раствора трипсин-EDTA, в планшет для культивирования клеток, чтобы остановить реакцию и суспендировать клетки. Суспензию клеток собирали в контейнер и центрифугировали для осаждения клеток, и удаляли надосадочную жидкость. К ним добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток, затем суспензию снова центрифугировали для осаждения клеток и удаляли надосадочную жидкость. К ним добавляли среду DMEM (10% FBS), чтобы снова суспендировать клетки.
После измерения количества живых клеток, содержащихся в клеточной суспензии, клетки высевали в планшет для культивирования клеток так, чтобы их плотность была меньше или равной 20000 клеток/см2, и начинали культивирование при 37°C в присутствии 5% СО2. Культивирование продолжали до тех пор, пока клетки не становились конфлуентными в планшете, заменяя среду DMEM (10% FBS) каждые 2-4 дня.
Описанный выше сбор и культивирование клеток повторяли, и клетки пролиферировали до тех пор, пока количество живых клеток не становилось равным 1 × 109 или более. Число делений клеток в течение этого периода культивирования этих промежуточных клеток в планшете для культивирования клеток составляло 5 и 6, а среднее время удвоения клеток было в пределах 2 дней (48 часов) на протяжении всего периода культивирования.
Среду в планшете для культивирования клеток, в котором клетки стали конфлуентными, удаляли и к ней добавляли раствор трипсин-EDTA. Планшету давали постоять от 5 до 60 минут при 37°C для отслоения клеток. Затем в планшет для культивирования клеток добавляли среду DMEM (10% FBS), чтобы остановить реакцию и суспендировали клетки. Эту клеточную суспензию собирали в контейнер. Собранные клетки центрифугировали и осаждали, и удаляли надосадочную жидкость. К ним добавляли от 500 мл до 600 мл среды DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток, затем суспензию снова центрифугировали для осаждения клеток и удаляли надосадочную жидкость. К ним добавляли от 500 мл до 600 мл среды DMEM (10% FBS), чтобы снова суспендировать клетки.
Пример 10: Продуцирующая культура клеток, полученных из пульпы зуба (приготовление биореактора)
50 г (± 1,0 г) микроносителей взвешивали с помощью электронных весов и помещали во флакон с реагентом, к ним добавляли 2000 мл PBS, а затем проводили стерилизацию в автоклаве. Используемые микроносители представляли собой желатиновые микроносители для культуры клеток, которые имеют диаметр частиц от 130 до 180 мкм (во время гидратации) и обладают термостойкостью, так что микроносители могут быть подвергнуты стерилизационной обработке в автоклаве.
В биореакторе устанавливали пакет на 50 л для реактора, вентиляционный фильтр и петлю датчика, и дополнительно устанавливали датчик температуры, pH-метр и измеритель растворенного кислорода. 10 л среды DMEM (10% FBS) и 50 г (масса сухого вещества) микроносителей добавляли в (мешок) биореактор, и биореактор нагревали до 37°C при перемешивании микроносителей. Перемешивание осуществляли с помощью мешалки, предусмотренной в устройстве.
Пример 11: Продуцирующая культура клеток, полученных из пульпы зуба (стадия адгезии клеток на микроносителях)
После измерения количества живых клеток, содержащихся в клеточной суспензии, приготовленной в Примере 9, клетки добавляли в биореактор так, чтобы их плотность составляла от 1000 до 5000 клеток/см3. После перемешивания внутри реактора в течение нескольких минут перемешивание прекращали, и реактор оставляли на 1 час или дольше. Это перемешивание и выдерживание выполняли повторно, чтобы клетки прикрепились к микроносителям.
Пример 12: Продуцирующая культура (стадия культивирования клеток) клеток, полученных из пульпы зуба
После завершения стадии адгезии культивирование начинали при перемешивании внутри биореактора. Происходящее внутри биореактора периодически наблюдали во время культивирования. В случае, когда микроносители оседали в нижней части реактора, частоту вращения перемешивания в реакторе увеличивали, заставляя микроносители плавать в среде.
Продуцирующую культуру вели до тех пор, пока клетки пролиферировали до тех пор, пока количество живых клеток не становилось 5 × 109 или более согласно измерениям, описанным в Примере 13. Число делений клеток во время периода культивирования на микроносителях составляло 2 и 3, а среднее время удвоения клеток составляло приблизительно от 3 до 6 дней. Клетки, подвергшиеся продуцирующему культивированию, претерпели, по меньшей мере, 23 деления клеток в среде in vitro и от 23 до 27 делений клеток.
Пример 13: Продуцирующая культура клеток, полученных из пульпы зуба (измерение количества клеток)
От 30 до 40 мл культурального раствора, содержащего микроносители, собирали из реактора, переносили в центрифужную пробирку и оставляли на 5 минут или дольше, чтобы микроносители могли осесть, а затем удаляли надосадочную жидкость. К ним добавляли 25 мл PBS, чтобы суспендировать клетки, и суспензии давали постоять в течение 5 минут или дольше для удаления надосадочной жидкости. Эту операцию проводили еще раз. После удаления надосадочной жидкости к микроносителям добавляли раствор трипсин-EDTA. После встряхивания смеси на водяной бане при 37°C в течение 5-10 минут к ней добавляли такое же количество среды DMEM (10% FBS), что и раствор трипсин-EDTA, чтобы остановить реакцию и суспендировать клетки. Эту клеточную суспензию центрифугировали (300×g, 5 минут) для осаждения клеток и удаления надосадочной жидкости. К ним добавляли от 1 до 5 мл среды DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток, а затем измеряли количество живых клеток, содержащихся в суспензии клеток.
Пример 14: Продуцирующая культура клеток, полученных из пульпы зуба (измерение концентрации глюкозы и концентрации молочной кислоты)
5-40 мл клеточной суспензии в культуре собирали из реактора, переносили в центрифужную пробирку и давали постоять 5 минут или дольше, чтобы микроносители осели. Затем часть надосадочной жидкости переносили в новую пробирку объемом 1,5 мл. 50 мкл надосадочной жидкости собирали с помощью микрошприца, и концентрации глюкозы и молочных кислот в надосадочной жидкости измеряли с помощью биосенсора (BF-7D, Oji Scientific Instruments). В случае, когда концентрация глюкозы была низкой, в среду добавляли глюкозу, или всю или часть среды заменяли так, чтобы концентрация глюкозы не опускалась ниже 0,1 мМ. Кроме того, в случае, когда концентрация молочных кислот увеличивалась, всю или часть среды заменяли так, чтобы концентрация молочных кислот не превышала 20 мМ.
Пример 15: Сбор клеток, полученных из пульпы зуба, полученных в продуцирующей культуре
После подтверждения того, что клетки пролиферируют до тех пор, пока количество клеток не достигнет заданного уровня, перемешивание реактора и сенсорной петли прекращают и суспензии клеток дают постоять в течение 10 минут или дольше, чтобы позволить микроносителям осесть. После удаления максимально возможного количества надосадочной жидкости клетки суспендировали в оставшейся среде. Суспензию клеток собирали в пакет на 10 л (Thermo Fisher Scientific Inc.) и оставляли на 5 минут или дольше, чтобы микроносители осели, а затем удаляли надосадочную жидкость.
К ним добавляли DMEM с низким содержанием глюкозы для суспендирования микроносителей, суспензии давали постоять в течение 5 минут или дольше, чтобы позволить микроносителям осесть, а затем удаляли надосадочную жидкость. Эту операцию повторяли несколько раз. Впоследствии после удаления надосадочной жидкости к микроносителям добавляли раствор трипсин-EDTA. После добавления к ним раствора трипсин-EDTA смесь встряхивали на водяной бане при 37°C в течение 30-60 минут, чтобы отделить клетки от микроносителей и разрушить микроносители.
Для удаления фрагментов, клеточных агрегатов и т.п. от микроносителей, оставшихся в суспензии клеток, собранный фильтрат пропускали через фильтр с диаметром пор от 20 до 35 мкм для сбора клеток из фильтрата фильтра. Собранный фильтрат центрифугировали для осаждения клеток и удаляли надосадочную жидкость. Промывочный раствор, приготовленный в Примере 1, добавляли к нему для промывки клеток, и клетки суспендировали. Суспензию снова центрифугировали для осаждения клеток и удаляли надосадочную жидкость. Эту операцию промывания выполняли повторно, и, наконец, клетки собирали в виде осадков после центрифугирования.
Пример 16: Приготовление и криоконсервация клеток, полученных из пульпы зуба
К осажденным клеткам, собранным в Примере 15, добавляли промывочный раствор и цитопротекторный раствор, и клетки суспендировали так, чтобы концентрация клеток составляла от 25 до 31 × 106 клеток/мл.
Флакон для криоконсервации (материал: сополимер циклического олефина, стерильный закрытый флакон, Aseptic Technologies) заполняли суспензией клеток, полученной таким образом, и герметично закрывали. Эту клеточную суспензию рассматривали как предварительно замороженный клеточный препарат, полученный из пульпы зуба. Компоненты, содержащиеся в части раствора (жидкость для криоконсервации клеток для приготовления клеток) предварительно замороженного клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, показаны в Таблице 14.
Таблица 14. Компонентная композиция жидкости для криоконсервации при приготовлении клеток
(Примечание) Единица концентрации человеческого сывороточного альбумина - г/л, единица концентрации DMSO -% (об./об.).
Предварительно замороженный клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, которым был заполнен флакон, замораживали с использованием программируемого морозильника обычным способом, а затем переносили в контейнер для хранения в жидком азоте. Эту замороженную клеточную суспензию рассматривали как препарат (препарат из клеток пульпы зуба), содержащий клетки, полученные из пульпы зуба, в качестве активных компонентов.
Пример 17: Свойства (такие как морфология клеток) клеток, полученных из пульпы зуба)
Изделие из замороженных промежуточных клеток, полученное в Примере 7, и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный в Примере 16, размораживали, к ним добавляли 10 мл среды DMEM (10% FBS) и каждую суспензию осторожно встряхивали. После этого каждую суспензию центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) для осаждения клеток. Надосадочную жидкость удаляли, к нему добавляли 10 мл среды DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток, затем суспензию снова центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) для осаждения клеток. Затем клетки суспендировали в среде DMEM (10% FBS), высевали в планшет для культивирования клеток так, чтобы они имели плотность от 5000 до 10000 клеток/см2, и культивировали так, чтобы они становились конфлуентными от 90% до 100%. Морфологию клеток в планшете для культивирования клеток наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа. Все культивированные клетки, содержащиеся в изделии из замороженных промежуточных клеток и клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, были по существу веретенообразными прикрепленными клетками и не включали клетки с другими формами. Жизнеспособность (количество живых клеток/количество всех клеток x 100%) клеток, содержащихся в размороженном изделии из замороженных промежуточных клеток и клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, рассчитанная по количеству живых клеток, составляла приблизительно от 85% до 95 %.
Пример 18: Свойства (диаметр частиц) клеточного препарата, полученного из пульпы зуба
Изделие из замороженных промежуточных клеток, полученное в Примере 7, и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный в Примере 16, размораживали и, соответственно, разбавляли растворами D-PBS (-) для получения растворов, разбавленных клетками, с концентрацией примерно 5 × 106 клеток/мл. Диаметр клеточной частицы измеряли с помощью метода анализа изображений, в котором использовали автоматический анализатор жизнеспособности клеток (Vi-Cell XR, Beckman Coulter Inc.). Метод анализа изображений, в котором используется автоматический анализатор жизнеспособности клеток, будет описан ниже. Трипановый синий добавляют к разбавленному раствору клеток для окрашивания клеток, этот разбавленный клеточный раствор направляют через удлиненный путь потока, и фотографируют множество увеличенных изображений пути потока под микроскопом. Поскольку трипановый синий проникает через клеточные мембраны мертвых клеток и окрашивает мертвые клетки, клетки, наблюдаемые как цветные частицы на изображениях, измеряются как мертвые клетки, а клетки, наблюдаемые как прозрачные частицы, измеряются как живые клетки. Диаметр частицы клетки рассчитывается с использованием диаметра частицы, измеренного на изображении, и увеличения микроскопа. Среднее значение получается из значений диаметров частиц на всех сфотографированных изображениях.
(Результаты)
Среднее значение диаметров клеточных частиц (диаметров клеток) размороженного изделия из замороженных промежуточных клеток составляло 17,36 мкм ± 1,40 мкм (среднее значение ± SD, n = 3), а среднее значение диаметров клеточных частиц размороженного клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, составляло 16,98 ± 1,23 мкм (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3) (Фиг. 1).
Пример 19: Свойства (способность дифференцироваться в остеоциты) клеток, полученных из пульпы зуба
Способность к дифференцировке в остеоциты исследовали с помощью следующего способа со ссылкой на раскрытие и т.п. Pittenger MF., Et al., Science. 284, 143-7 (1999) и Colter DC., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 98, 7841-5 (2001).
Изделие из замороженных промежуточных клеток, полученное в Примере 7, и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный в Примере 16, размораживали и центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) для осаждения клеток. Затем клетки суспендировали в среде DMEM (10% FBS), высевали в планшет для культивирования клеток так, чтобы они имели плотность от 5000 до 15000 клеток/см2, и культивировали так, чтобы они достигали конфлуентности от 90% до 100%. Клетки промывали PBS, к ним добавляли трипсин-EDTA и каждой смеси давали постоять в течение 5-10 минут при 37°C для отслоения клеток. Туда добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток и измеряли количество живых клеток. Клетки высевали в 24-луночный планшет для культивирования клеток, покрытый коллагеном I при плотности клеток (от 15000 до 25000 клеток/см2) в среде DMEM (10% FBS), и каждый культивировали в течение 3 дней. Клетки были разделены на 2 группы. Среду одной группы заменяли средой, индуцирующей дифференцировку остеоцитов, которую получали путем добавления добавок и факторов роста для дифференцировки в остеоциты (LONZA KK.), содержащих дексаметазон, L-глутамин, аскорбат, пенициллин/стрептомицин, добавку для роста мезенхимальных клеток (MCGS) и P-глицерофосфат, в базальную среду для дифференцировки в остеоциты (LONZA KK.) для проведения культивирования для дифференцировки в течение 2–3 недель, заменяя среду каждые 3–4 дня. Эта группа считалась группой, индуцирующей дифференцировку остеоцитов. Среду другой группы заменяли свежей средой DMEM (10% FBS) для культивирования в течение 2–3 недель, заменяя среду каждые 3–4 дня. Эта группа считалась контрольной. Клетки как из группы, индуцирующей дифференцировку остеоцитов, так и из контрольной группы культивировали, один раз промывали PBS, добавляли 0,4 мл 10% муравьиной кислоты в каждую лунку и лункам давали постоять в течение 1 часа при комнатной температуре для высвобождения кальция, накопленного в клетках, из клеток. Концентрацию высвободившегося кальция количественно определяли с помощью Calcium E-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Результаты измерения показаны на Фиг. 2. Как в клетках, содержащихся в изделии из замороженных промежуточных клеток, так и в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, в группах, индуцирующих дифференцировку остеоцитов, обнаруживалось большее увеличение концентрации кальция в клетках, чем в контрольных группах. Эти результаты показывают, что клетки, содержащиеся как в изделии из замороженных промежуточных клеток, так и в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, были дифференцированы в остеоциты, и показывают, что клетки, полученные из пульпы зуба, по настоящему изобретению обладают способностью дифференцироваться в остеоциты.
Пример 20: Свойства (способность дифференцироваться в хондроциты) клеток, полученных из пульпы зуба
Способность дифференцироваться в хондроциты исследовали с помощью представленного ниже способа со ссылкой на раскрытие и т.п. Kiani C., et al., Cell Res. 12 19-32 (2002) и Aung A., et al., Arthritis Rheum. 63 148-58 (2011).
Изделие из замороженных промежуточных клеток, полученное в Примере 7, и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный в Примере 16, размораживали и центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) для осаждения клеток. Затем клетки суспендировали в среде DMEM (10% FBS), высевали в планшет для культивирования клеток так, чтобы они имели плотность от 5000 до 10000 клеток/см2, и культивировали так, чтобы они достигали конфлуентности от 90% до 100%. Клетки промывали PBS, к ним добавляли трипсин-EDTA и каждой смеси давали постоять в течение 5-10 минут при 37°C для отслоения клеток. Туда добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток и измеряли количество живых клеток. Клетки были разделены на 2 группы. Клетки одной группы суспендировали в среде, индуцирующей дифференцировку хондроцитов Stem MACS (зарегистрированная торговая марка) ChondroDiff Medium (Miltenyi Biotec) в концентрации 1 x 106 клеток/мл, и по 1 мл каждой суспензии высевали в контейнер с низкой адсорбцией (STEMFULL (зарегистрированная торговая марка), Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) для формирования сфероидов. Культивирование для дифференцировки проводили в течение 2–3 недель, заменяя среду каждые 3–4 дня. Эта группа считалась группой, индуцирующей дифференцировку хондроцитов. Клетки другой группы субкультивировали со средой DMEM (10% FBS), которую использовали в качестве контрольной группы.
После культивирования клетки собирали и обрабатывали протеиназой К в течение 30 минут на теплой бане при 55°C для лизирования клеток. Суммарную РНК экстрагировали из лизированных клеток с помощью RNeasy (зарегистрированная торговая марка) Plus Mini Kit (QIAGEN NV) для получения экстракта тотальной РНК, а затем концентрацию РНК, содержащуюся в экстракте тотальной РНК, измеряли с помощью измерителя поглощающей способности (DeNovix Inc.) После измерения концентрации РНК кДНК была синтезирована с использованием набора для обратной транскрипции QuantiTect (зарегистрированная торговая марка) (QIAGEN NV). Кроме того, был приготовлен раствор для реакции ПЦР, 25 нг кДНК каждой группы использовали в качестве матрицы, РВ-ПЦР выполняли в условиях ПЦР [(50°C/2 минуты) x 1 цикл, (95°C/10 минут) x 1 цикл и (95°C/15 секунд, 60°C/1 минута) x 40 циклов] для амплификации гена аггрекана и гена Р-актина. Зонд аггрекана (Applied Biosystems/Assay ID: Hs00153936_m1) и зонд P-актина (Applied Biosystems/4310881E), соответственно использовали в качестве праймеров для ПЦР.
Результаты измерения показаны на Фиг. 3. Как в клетках, содержащихся в изделии из замороженных промежуточных клеток, так и в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, было обнаружено, что значения порогового цикла (Ct) аггрекана были выше в группах, индуцирующих дифференцировку хондроцитов, чем в контрольных группах. Эти результаты показывают, что уровень экспрессии аггрекана, который является основной молекулой, составляющей внеклеточный матрикс хондроцитов, увеличился в группах, индуцирующих дифференцировку хондроцитов, и показывают, что как клетки, содержащиеся в изделии из замороженных промежуточных клеток, так и клетки препарата, полученные из пульпы зуба, обладают способностью дифференцироваться в хондроциты.
Пример 21: Свойства клеток, полученных из пульпы зуба (измерение 1 поверхностных антигенов)
Клетки, полученные из пульпы зуба, имели форму веретена, аналогичную мезенхимальным стволовым клеткам человека. Таким образом, с помощью проточного цитометра было исследовано наличие или отсутствие экспрессии маркеров поверхностных антигенов CD73, CD90, CD105 и CD166, по которым, как известно, мезенхимальные стволовые клетки человека являются положительными, и маркеров поверхностных антигенов CD34 и CD45, по которым, как известно, мезенхимальные стволовые клетки являются отрицательными.
Физиологический раствор с фосфатным буфером при pH 7,4, который содержит BSA и представляет собой порошок (SIGMA-Aldrich), растворяли в чистой воде и пропускали через фильтр 0,45 мкм для приготовления PBS-B [0,01 M фосфатно-буферный физиологический раствор (pH 7,4), содержащий 0,138 M хлорида натрия, 0,0027 M хлорида калия и 1% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина]. IgG человека (SIGMA-Aldrich) растворяли в PBS (Life Technologies) и пропускали через фильтр 0,45 мкм для приготовления раствора IgG с концентрацией 20 мг/мл. 2 мл раствора IgG с концентрацией 20 мг/мл добавляли к 18 мл PBS-B, чтобы приготовить блокирующий раствор.
Кроме того, меченное FITC антитело против CD34 человека (анти-CD34-FITC, Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.) использовали в качестве антитела против CD34, меченное FITC антитело против CD45 человека (анти-CD45 -FITC, Beckman Coulter Inc.) использовали в качестве антитела против CD45, меченное FITC антитело против CD73 человека (анти-CD73-FITC, Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.) использовали в качестве антитела против CD73, меченое FITC антитело против CD90 человека (анти-CD73-FITC, Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.) использовали в качестве антитела против CD90, меченное PE антитело против CD105 человека (анти-CD105-R-PE, Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.) использовали в качестве антитела против CD105, меченное PE антитело против CD166 человека (анти-CD166-PE, Ancell Corporation) использовали в качестве антитела против CD166, меченый FITC контроль изотипа IgG1 мыши (анти-IgG1-FITC, Beckman Coulter Inc.) и меченый PE контроль изотипа IgG1 мыши (IgG1-PE, Beckman Coulter Inc.) использовали в качестве контрольных антител.
(Способ окрашивания клеток)
Изделие из замороженных промежуточных клеток, полученное в Примере 7, и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный в Примере 16, размораживали и центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) для осаждения клеток. Надосадочную жидкость удаляли, к ним добавляли 10 мл среды DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток и измеряли количество живых клеток. Клетки (1 × 107) собирали в центрифужную пробирку на 50 мл, центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) и осаждали, и удаляли надосадочную жидкость. К ним добавляли PBS-B до общего объема 10 мл и суспендировали клетки. Затем клетки снова центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) для осаждения клеток и удаляли надосадочную жидкость. Затем клетки суспендировали в 1 мл блокирующего раствора и оставляли стоять на льду в течение 1 часа. Каждый раствор антитела добавляли в девять реакционных пробирок объемом 5 мл (номера от (1) до (9)), как показано в Таблице 15. Затем в каждую пробирку добавляли 100 мкл суспензии клеток, которые были суспендированы в блокирующем растворе, и смесь осторожно встряхивали и оставляли на льду в течение 20 минут для связывания антител, содержащихся в каждом растворе антител, с маркером поверхностного антигена, экспрессиированного на поверхности клеток. Затем в каждую пробирку добавляли 3 мл PBS-B и перемешивали, затем клетки центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) и осаждали, а надосадочную жидкость удаляли для удаления антител, которые не связались с клетками. Эту операцию удаления антител повторяли 3 раза. В каждую пробирку добавляли 400 мкл PBS-B для суспендирования клеток.
Таблица 15. Тип и количество раствора антител, добавленного в каждую реакционную пробирку
(Измерение и анализ)
Что касается клеток пробирок с номерами (1) - (9), количество каждого флуоресцентного красителя из FITC и PE измеряли с помощью BD FACSVerse (зарегистрированная торговая марка) (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.), чтобы получить количество флуоресцентного красителя, связанного с поверхностями клеток посредством антител, специфически связанных с поверхностными антигенами по сравнению с отрицательными контролями. Пробирка (2) является отрицательным контролем для пробирок (3) - (6), а пробирка (7) является отрицательным контролем для пробирок (8) и (9). Пробирка (1) - это неокрашенные клетки.
Результаты измерения показаны на Фиг. 4. Что касается клеток с номерами пробирок (5), (6), (8) и (9) (которые были соответственно окрашены CD73-, CD90-, CD105- и CD166), 85% или более клеток были положительными по этим поверхностным антигенам как в клетках, содержащихся в изделии из замороженных промежуточных клеток, так и в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба. Что касается клеток с номерами пробирок (3) и (4) (которые представляли собой клетки, окрашенные, соответственно, CD34 и CD45), большинство клеток были отрицательными по этим поверхностным антигенам как в клетках, содержащихся в изделии из замороженных промежуточных клеток, так и в препарате клеток, полученном из пульпы зуба. Эти результаты показывают, что клетки, полученные из пульпы зуба, являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45.
Пример 22: Свойства клеток, полученных из пульпы зуба (измерение 2 поверхностных антигенов)
Изделие из замороженных промежуточных клеток, полученное в Примере 7, и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный в Примере 16, размораживали, и итоговое количество каждой клеточной суспензии добавляли в среду DMEM. Суспензию клеток центрифугировали (300 x g, 5 минут, комнатная температура) и удаляли надосадочную жидкость. После этого к ним добавляли среду DMEM для суспендирования клеток. Впоследствии клетки окрашивали антителами против поверхностных антигенов с использованием BD Lyoplate (панель скрининга маркеров человеческих клеток, Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.). Окрашивание антителами проводили в соответствии с протоколом панели Human Cell Screening Panel (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.). Схема способа измерения поверхностных антигенов с использованием панели скрининга клеток человека будет описана ниже. Суспензию клеток распределяют в каждую лунку 96-луночного планшета. Антитела против различных поверхностных антигенов соответственно добавляли в лунки в качестве первичных антител и оставляли на 30 минут для связывания поверхностных антигенов с антителами. Суспензию клеток центрифугировали для осаждения клеток и удаляли надосадочную жидкость. После промывки клеток антитела против первичных антител соответственно добавляли в лунки в качестве вторичных антител и оставляли на 30 минут для связывания поверхностных антигенов с антителами. Вторичные антитела флуоресцентно метили Alexa Fluor 647. Суспензию клеток центрифугировали для осаждения клеток и удаляли надосадочную жидкость. Клетки ресуспендировали. Что касается этой клеточной суспензии, клетки, с которыми связаны вторичные антитела, флуоресцентно детектируются как положительные клетки с помощью проточной цитометрии, чтобы получить относительное содержание положительных клеток по поверхностным антигенам. Измерения выполняли на 9 партиях промежуточных клеток и 7 партиях клеток, содержащихся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, для получения положительного отношения для каждого антигена.
(Результаты)
Поверхностные антигены, по которым промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, были положительными, показаны соответственно на Фиг. 5 и 6.
В промежуточных клетках коэффициенты положительности 95% или выше были показаны для CD47, CD81, CD90, CD147 и HLA-A, -B и -C во всех партиях. Кроме того, коэффициенты положительности 90% или выше были показаны для CD29, CD46, CD55, CD59, CD73 и CD140b во всех партиях. Кроме того, коэффициенты положительности 80% или выше, приблизительно 90% или выше были показаны для CD9, CD44, CD49b, CD49c, CD98 и EGF-R во всех партиях. Кроме того, коэффициенты положительности 70% или выше, приблизительно 90% или выше были показаны для CD49f и CD166 во всех клетках.
Кроме того, коэффициенты положительности 60% или выше, примерно 90% или выше были показаны для CD10, CD13, CD58, CD63, CD151 и CD164 во всех клетках (Фиг. 5). В дополнение к этому промежуточные клетки также положительны по CD105 (Фиг. 4).
С другой стороны, в клетках, содержащихся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, коэффициенты положительности 95% или выше, приблизительно 98% или выше были показаны для CD29, CD59, CD44 и CD164 во всех партиях. Кроме того, коэффициенты положительности 90% или выше, приблизительно 95% или выше были показаны для CD9, CD13, CD46, CD47, CD58, CD63, CD73, CD81, CD90, CD98, CD147, EGF-R и HLA-A, -B и -C во всех партиях. Кроме того, коэффициенты положительности 80% или выше были показаны для CD49b, CD49c, CD49e, CD55, CD95,
CD151 и CD166 во всех партиях, и для них были показаны коэффициенты положительности приблизительно 90% или выше, за исключением CD95, CD151 и CD166. Кроме того, коэффициенты положительности 70% или выше, приблизительно 80% или выше были показаны для CD10, CD49f и CD140b во всех партиях (Фиг. 6). В дополнение к этому, клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, также положительны по CD105 (Фиг. 4).
Затем Поверхностные антигены, по которым промежуточные клетки и клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, были отрицательными, соответственно показаны в Таблицах 16 и 17.
В промежуточных клетках коэффициенты положительности 1% или ниже были показаны для CD120b, CD132, CD158a, CD161, CD184, CD195, CD206, CD210, CD212, CD226, CD244, CD267, CD278, CD279, CD282, CD294, NKB1, SSEA-1, TRA-1-60, TRA-1-81, Vp23, SSEA-3, CLA и интегрина β7 во всех партиях. Кроме того, коэффициенты положительности 2% или ниже были показаны для CD8b, CD11b, CD15s, CD16, CD19, CD24, CD31, CD32, CD62E, CD62P, CD66f, CD86, CD88, CD94, CD100, CD103, CD104, CD114, CD117, CD118, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD126, CD127, CD128b, CD135, CD137, лиганда CD137, CD150, CD163, CD172b, CD177, CD178, CD180, CD197, CD220, CD229, CD231, CD1430, CD2 CD321, CDw327, CDw328, CD329, CD335, CD336, BLTR-1, CLIP, CMRF-44, CMRF-56, fMLP-R, Vβ8, инвариантного NKT и γδ TCR во всех партиях, и приблизительные коэффициенты положительности составили 1% или ниже. Кроме того, коэффициенты положительности 5% или ниже были показаны для CD1a, CD1b, CD1d, CD2, CD3, CD5, CD6, CD7, CD8a, CD11c, CD15, CD18, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33. CD35, CD37, CD38, CD41a, CD41b, CD42b, CD45, CD45RB, CD45RO, CD48, CD50, CD53, CD62L, CD64, CD66 (a, c, d, e), CD69, CD70, CD72, CD74, CD84, CD85, CD87, CD89, CDw93, CD97, CD134, CD138, CD141, CD144, CD154, CD158b, CD162, CD183, CD205, CD235a, CD309, CD326, CD337 и αβ TCR во всех клетках. Кроме того, хотя коэффициенты положительности более чем 5% были показаны для CD26, CD106 и CD271 в некоторых партиях, среднее значение коэффициентов положительности составляло 5% или ниже (Таблица 16A - Таблица 16D). В дополнение к этому, промежуточные клетки также отрицательны по антигену CD34, CD40, CD45, CD80, CD86 и MHC-класса II (Фиг. 4 и 11А).
В клетках, содержащихся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, коэффициенты положительности 1% или ниже были показаны для CD1a, CD1d, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8a, CD8b, CD11b, CD11c, CD15, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD28, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD37, CD38, CD41a, CD86, CD87, CD88, CD89, CDw93, CD94, CD100, CD102, CD103, CD114, CD117, CD118, CD120b, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD126, CD127, CD128b, CD132, CD134, CD135, CD137, лиганда CD137, CD138, CD144, CD150, CD138, CD144, CD150, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD172b, CD177, CD178, CD180, CD184, CD195, CD196, CD197, CD205, CD206, CD210, CD212, CD220, CD226, CD229, CD231, CD235a, CD244, CD267 CD268, CD278, CD279, CD282, CD294, CD305, CD309, CD314, CD321, CDw327, CDw328, CD329, CD335, CD336, CD337, BLTR-1, CLIP, CMRF-44, CMRF-56, fMLP-R, SSEA- 1, TRA-1-60, CLA, интегрина β7 и инвариантного NKT во всех партиях. Кроме того, коэффициенты положительности 2% или ниже были показаны для CD1b, CD6, CD27, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD45, CD45RB, CD48, CD50, CD53, CD57, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD66b, CD66f, CD69, CD70, CD72, CD75, CD84, CD85, CD97, CD99R, CD183, CD193, SSEA-3 и γδ TCR во всех партиях, и приблизительные коэффициенты положительности были 1% или ниже. Кроме того, коэффициенты положительности 5% или ниже были показаны для CD4v4, CD14, CD36, CD45RA, CD45RO, CD66 (a, c, d, e), CD79b, CD83, CD152, CD209, CD275, CD326, MIC A/B, и αβ TCR во всех партиях, а приблизительные коэффициенты положительности были 2% или ниже. Кроме того, хотя коэффициенты положительности более чем 5% были показаны для CD106 и CD271 в некоторых партиях, среднее значение коэффициентов положительности составляло 5% или ниже (Таблица 17A - Таблица 17E). В дополнение к этому, клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, также отрицательны по антигенам CD34, CD40, CD45, CD80, CD86 и MHC-класса II (Фиг. 4 и 11B).
Таблица 16A. Поверхностные антигены, по которым промежуточные клетки были отрицательными
Таблица 16B. Поверхностные антигены, по которым промежуточные клетки были отрицательными
Таблица 16C. Поверхностные антигены, по которым промежуточные клетки были отрицательными
Таблица 16D. Поверхностные антигены, по которым промежуточные клетки были отрицательными
Таблица 17A. Поверхностные антигены, по которым клетки, содержащиеся в препарате, были отрицательными
Таблица 17B. Поверхностные антигены, по которым клетки, содержащиеся в препарате, были отрицательными
Таблица 17C. Поверхностные антигены, в отноршении которых клетки, содержащиеся в препарате, были отрицательными
Таблица 17D. Поверхностные антигены, по которым клетки, содержащиеся в препарате, были отрицательными
Таблица 17E. Поверхностные антигены, по которым клетки, содержащиеся в препарате, были отрицательными
Поверхностные антигены, которые имели разницу коэффициентов положительности, по меньшей мере, 10% между промежуточными клетками и клетками, содержащимися в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, показаны на Фиг. 7. В клетках, содержащихся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, полученном путем дальнейшего культивирования промежуточных клеток с помощью способов, описанных в Примерах 9-15, коэффициенты положительности CD39, CD49a, CD61, CD107a, CD107b и CD143 увеличились на 20% или больше, но коэффициент положительности CD146 снизился на 60% по сравнению с промежуточными клетками. Эти результаты показывают, что клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, обладают свойствами, отличными от промежуточных клеток. Таким образом, эти результаты показывают, что клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, могут быть получены как новые клетки, отличные от промежуточных клеток, путем культивирования с помощью способов, описанных в Примерах 9-15.
Пример 23: Свойства клеток, полученных из пульпы зуба (тест на секреторную способность фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF))
Изделие из замороженных промежуточных клеток, полученное в Примере 7, и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный в Примере 16, размораживали и центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) для осаждения клеток. Затем клетки суспендировали в среде DMEM (10% FBS), высевали в планшет для культивирования клеток так, чтобы они имели плотность от 5000 до 15000 клеток/см2, и культивировали так, чтобы они становились конфлуентными от 90% до 100%. Клетки промывали PBS, к ним добавляли трипсин-EDTA и каждой смеси давали постоять в течение 5-10 минут при 37°C для отслоения клеток. Туда добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток и измеряли количество живых клеток. После суспендирования клеток в среде DMEM (10% FBS) при концентрации 0,7 × 105 клеток/мл 10 мл каждой суспензии высевали в планшет для культивирования клеток T25 и культивировали в течение 5 дней. После культивирования собирали итоговое количество надосадочной жидкости культуры, массу собранной надосадочной жидкости культуры измеряли с помощью электронных весов (Shimadzu Corporation), и надосадочную жидкость культуры криоконсервировали при -80°C до измерения. После сбора и удаления надосадочной жидкости клетки промывали PBS, к ним добавляли трипсин-EDTA и каждой смеси давали постоять в течение 5-10 минут при 37°C для отслоения клеток. Туда добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток и измеряли количество живых клеток.
Вышеописанную криоконсервированню культуральную надосадочную жидкость размораживали, VEGF, содержащийся в культуральной надосадочной жидкости, метили с помощью набора Quantikine ELISA Human VEGF Kit (R&D Systems), а затем детектировали с помощью ридера для микропланшетов (Molecular Devices, LLC). Полученное детектированное значение интерполировали на калибровочную кривую, созданную с VEGF в хорошо известной концентрации, и получали концентрацию VEGF, содержащегося в надосадочной жидкости культуры. Количество секретируемого VEGF рассчитывали как секретируемое количество на количество клеток в соответствии со следующим уравнением.
[Количество секреции VEGF = измеренное значение концентрации VEGF x объем надосадочной жидкости культуры/количество живых клеток (1 x 105 клеток)]
Фиг.8 представляет собой пример результатов измерения. Эти результаты показывают, что как промежуточные клетки, так и клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, обладают способностью секретировать VEGF, но эта способность усиливается в процессе дальнейшего культивирования промежуточных клеток с получением клеточного препарата, полученного из пульпы зуба. Поскольку VEGF представляет собой вещество, обладающее ангиогенным действием, клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, может способствовать образованию кровеносных сосудов в организме с использованием VEGF путем введения людям этого клеточного препарата, полученного из пульпы зуба. Кроме того, поскольку секреторная способность VEGF усиливается в клетках, содержащихся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, полученных через промежуточные клетки, считается, что клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, изготовленный с помощью данного способа получения, эффективен в качестве терапевтического агента для заболеваний, при которых необходимо оказывать ангиогенный эффект.
Пример 24: Свойства клеток, полученных из пульпы зуба (тест секреторной способности простагландина E2 (PGE2))
Изделие из замороженных промежуточных клеток, полученное в Примере 7, и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный в Примере 16, размораживали и центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) для осаждения клеток. Затем клетки суспендировали в среде DMEM (10% FBS), высевали в планшет для культивирования клеток так, чтобы они имели плотность от 5000 до 15000 клеток/см2, и культивировали так, чтобы они становились конфлуентными от 90% до 100%. Клетки промывали PBS, к ним добавляли трипсин-EDTA и каждой смеси давали постоять в течение 5-10 минут при 37°C для отслоения клеток. Туда добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток и измеряли количество живых клеток. После суспендирования клеток в среде DMEM (10% FBS) в концентрации 1 × 105 клеток/мл, по 1 мл каждой из разбавленных клеток высевали в 6 лунок в 12-луночном планшете для культивирования клеток. Кроме того, в каждую из 3 лунок добавляли 1 мл среды DMEM (10% FBS), содержащей 40 нг/мл TNF-α (R&D Systems), и в каждую из оставшихся 3 лунок добавляли 1 мл среды DMEM (10% FBS). Первые культивировали как группу, стимулированную TNF-α, а последние культивировали как группу, не стимулированную (контрольная группа), в течение около 24 часов. После культивирования итоговое количество культуральных надосадочных жидкостей собирали, массу собранных надосадочных жидкостей измеряли с помощью электронных весов (Shimadzu Corporation), и надосадочные жидкости криоконсервировали при -80°C до измерения. После сбора и удаления надосадочных жидкостей клетки промывали PBS, к ним добавляли трипсин-EDTA и каждой смеси давали постоять в течение 5-10 минут при 37°C для отслоения клеток. Туда добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток и измеряли количество живых клеток.
Вышеописанную криоконсервированную культуральную надосадочную жидкость размораживали, простагландин E2 (PGE2), содержащийся в культуральной надосадочной жидкости, метили с помощью набора Prostaglandin E2 Express EIA (Cayman Chemical), а затем определяли с помощью ридера для микропланшетов (Molecular Devices, LLC). Полученное обнаруженное значение интерполировали на калибровочную кривую, созданную с PGE2 при хорошо известной концентрации, и получали концентрацию PGE2, содержащегося в культуральной надосадочной жидкости. Количество секретируемого PGE2 рассчитывали как секретируемое количество на количество клеток 1 × 105 в соответствии со следующим уравнением.
[Количество секретируемого PGE2 = измеренное значение концентрации PGE2 x объем культуральной надосадочной жидкости /количество живых клеток (1 x 105 клеток)]
Результаты измерения показаны на Фиг.9. Эти результаты показывают, что как промежуточные клетки, так и клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, обладают TNFα-реактивной секреторной способностью PGE2, но эта способность усиливается в процессе дальнейшего культивирования промежуточных клеток с получением клеточного препарата, полученного из пульпы зуба. Поскольку PGE2 оказывает сильное противовоспалительное действие, клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, воздействует на воспалительный участок в организме через PGE2 и может подавлять разрушение ткани, сопровождающееся воспалением, путем введения клеток человеку. Кроме того, поскольку секреторная способность PGE2 усиливается в клетках, содержащихся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, полученном через промежуточные клетки, считается, что клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный с помощью способа получения, является эффективным в качестве терапевтического агента при заболеваниях, при которых необходимо оказывать противовоспалительное действие.
Пример 25: Тест на секрецию кинуренина
(Способ теста)
Изделие из замороженных промежуточных клеток, полученное в Примере 7, и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный в Примере 16, размораживали, а затем высевали в колбу для культивирования клеток до плотности от 5000 до 15000 клеток/см2 и культивировали в течение 4 дней так, чтобы клетки достигли конфлуэнтности 90% - 100%. Клетки промывали PBS, к ним добавляли трипсин-EDTA (Thermo Fisher Scientific Inc.) и каждой смеси давали постоять в течение 5-10 минут при 37°C для отслоения клеток. Туда добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток и измеряли количество живых клеток. Клетки высевали в две колбы для клеточных культур так, чтобы они имели плотность от 15000 до 25000 клеток/см2. Среду DMEM (10% FBS), содержащую 100 Ед/мл IFN-γ (SHIONOGI Co., Ltd.), добавляли в одну из колб для культивирования клеток, а среду DMEM (10% FBS) добавляли в другую колбу для культивирования клеток. Первые культивировали как группу, стимулированную IFN-γ, а последние культивировали как группу, не стимулированную (контрольная группа), в течение 3 дней. После культивирования собирали итоговое количество надосадочных жидкостей клеточных культур. Массу собранных надосадочных жидкостей клеточных культур измеряли с помощью электронных весов (Shimadzu Corporation), и надосадочные жидкости подвергали криоконсервации при -80°C до измерения. После сбора и удаления надосадочных жидкостей клетки промывали PBS, к ним добавляли трипсин-EDTA и каждой смеси давали постоять в течение 5-10 минут при 37°C для отслоения клеток. К ним добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток и измеряли количество живых клеток в каждой из групп: IFN-γ-стимулированной группы и нестимулированной группы. Вышеописанную криоконсервированную культуральную надосадочную жидкость размораживали, добавляли туда 30% трихлоруксусную кислоту (NACALAI TESQUE, INC.) для выполнения центрифугирования (10 000 g, 10 минут). После этого кинуренин, содержащийся в культуральной надосадочной жидкости, определяли с помощью ВЭЖХ (Shimadzu Corporation). Полученное детектированное значение интерполировали на калибровочную кривую, созданную с кинуренином в хорошо известной концентрации, и получали концентрацию кинуренина (молярную концентрацию), содержащегося в культуральной надосадочной жидкости. Количество секретируемого кинуренина рассчитывали как количество секрета на количество клеток в соответствии со следующим уравнением.
[Количество секретируемого кинуренина = измеренное значение концентрации кинуренина x 208,21 x объем культуральной надосадочной жидкости/количество живых клеток (1 х 105 клеток)]
(Результаты)
Результаты представлены в Таблице 10. При культивировании как промежуточных клеток, так и клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, в присутствии IFN-γ количество секретируемого кинуренина значительно увеличивается. Кинуренин может подавлять пролиферацию Т-клеток и дифференцировать моноциты в противовоспалительные макрофаги M2. Соответственно, считается, что клетки, полученные из пульпы зуба, обогащенные плюрипотентными стволовыми клетками, могут оказывать противовоспалительное действие с использованием кинуренина при введении людям.
Пример 26: Свойства клеток, полученных из пульпы зуба (тест на низкую иммуногенность)
Изделие из замороженных промежуточных клеток, полученное в Примере 7, и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный в Примере 16, размораживали и центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) для осаждения клеток. Затем клетки суспендировали в среде DMEM (10% FBS), высевали в планшет для культивирования клеток так, чтобы они имели плотность от 5000 до 15000 клеток/см2, и культивировали так, чтобы они становились конфлуентными от 90% до 100%. Клетки промывали PBS, к ним добавляли трипсин-EDTA и каждой смеси давали постоять в течение 5-10 минут при 37°C для отслоения клеток. Туда добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток и измеряли количество живых клеток. Клетки высевали в два планшета для культивирования клеток так, чтобы их плотность составляла от 15000 до 25000 клеток/см2. Среду DMEM (10% FBS), содержащую 100 Ед/мл IFN-γ (SHIONOGI Co., Ltd.), добавляли в один из планшетов для культивирования клеток, а среду DMEM (10% FBS) добавляли в другой планшет для культивирования клеток. Первые культивировали как группу, стимулированную IFN-γ, а последние культивировали как группу, не стимулированную (контрольная группа), в течение 3 дней. После культивирования клетки промывали PBS, добавляли к нему трипсин-EDTA и каждой смеси давали постоять в течение 5-10 минут при 37°C для отслоения клеток. К ним добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток и измеряли количество живых клеток в каждой из групп: IFN-γ-стимулированной группы и нестимулированной группы. Затем суспензию клеток каждой группы центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) и удаляли надосадочную жидкость. Затем к ним добавляли блокирующий раствор (описанный в Примере 21), чтобы довести концентрацию клеток до 1 × 107 клеток/мл, и оставляли на льду в течение 1 часа.
Меченное FITC антитело против антигена MHC-класса I человека (Ancell Corporation), меченное FITC антитело против антигена MHC-класса II человека (Ancell Corporation), меченное FITC антитело против CD40 человека (BD Biosciences), меченное FITC антитело против CD80 человека (BD Biosciences) и меченное FITC антитело против CD86 человека (BD Biosciences), соответственно, использовали в качестве антител против антигена MHC-класса I, антигена MHC-класса II, CD40, CD80 и CD86. Кроме того, в качестве контрольных антител использовали меченный FITC контроль изотипа IgG1 мыши (Beckman Coulter Inc.) и меченный FITC контроль изотипа IgG2a мыши (BD Biosciences).
Каждый раствор антитела добавляли в реакционные пробирки объемом 5 мл (номера от (1) до (16)), как показано в Таблице 16. Затем 100 мкл суспензии клеток группы, стимулированной IFN-γ, добавляли в каждую из 5 мл реакционных пробирок (1) - (8) и добавляли 100 мкл суспензии клеток группы, стимулированной IFN-γ, в каждую из 5 мл реакционных пробирок (9) - (16), и смесь осторожно встряхивали и оставляли на льду в течение 20 минут для связывания антител, содержащихся в каждом растворе антител, с поверхностными маркерами антигенов, экспрессируемыми на поверхности клеток. Затем в каждую пробирку добавляли 3 мл PBS-B и перемешивали, затем клетки центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) и осаждали, а надосадочную жидкость удаляли для удаления антител, которые не связались с клетками. Эту операцию удаления антител повторяли 3 раза. Затем в каждую пробирку добавляли 400 мкл PBS-B для суспендирования клеток.
Таблица 18. Тип и количество раствора антител, добавленных в каждую реакционную пробирку
Что касается клеток пробирок с номерами (1) - (16), количество флуоресцентного красителя FITC измеряли с помощью BD FACSVerse (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.), чтобы получить количество флуоресцентного красителя, связанного с поверхностями клеток через антитела, специфически связанные с поверхностными антигенами, по сравнению с отрицательными контролями. Пробирка (2) является отрицательным контролем для пробирок (4) и (6) - (8), пробирка (3) является отрицательным контролем пробирки (5), пробирка (10) является отрицательным контролем пробирки (12) и (14) - (16), а пробирка (11) является отрицательным контролем пробирки (13). Пробирки (1) и (9) представляют собой неокрашенные клетки.
(Результаты)
Результаты измерений представлены на Фиг. 11A и 11B. Что касается результатов измерения антигена MHC-класса I, приблизительно все клетки в промежуточных клетках и клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, были положительными независимо от наличия или отсутствия стимуляции IFN-γ. Что касается результатов измерения антигена MHC-класса II, все клетки были по существу отрицательными из-за отсутствия стимуляции IFN-γ, но большинство клеток были положительными из-за стимуляции IFN-γ в промежуточных клетках и клеточном препарате, полученном из пульпы зуба. Что касается результатов измерения CD40, CD80 и CD86, приблизительно все клетки в промежуточных клетках и клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, были отрицательными независимо от наличия или отсутствия стимуляции IFN-γ.
Антиген MHC-класса I и антиген MHC-класса II представляют собой антигены клеточной поверхности, выполняющие функцию презентирования антигенов иммунным клеткам. Кроме того, известно, что антиген MHC-класса I экспрессируется почти во всех клетках и что экспрессия антигена MHC-класса II индуцируется во многих клетках посредством стимуляции IFN-γ. С другой стороны, CD40, CD80 и CD86 представляют собой поверхностные антигены, участвующие в активации клеток иммунной системы. То есть считается, что, поскольку изделие из замороженных промежуточных клеток и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, не экспрессируют CD40, CD80 и CD86, они не активируют активно иммунные клетки. Таким образом, эти результаты демонстрируют, что клетки, содержащиеся как в изделии из замороженных промежуточных клеток, так и в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, не обладают иммуногенностью и, следовательно, обладают свойствами не вызывать иммуногенность даже при стимуляции IFN-γ.
Пример 27: Измерение секреторной способности различных факторов, включая цитокины, промежуточных клеток и клеток, содержащихся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба (предкультура)
Изделие из замороженных промежуточных клеток, полученное в Примере 7, и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный в Примере 16, размораживали, и итоговое количество каждой размороженной клеточной суспензии добавляли в среду DMEM. Выполняли центрифугирование (300 x g, 5 минут, комнатная температура) и удаляли надосадочную жидкость. После этого к ним добавляли среду DMEM для суспендирования клеток, и количество живых клеток и количество всех клеток в клеточной суспензии измеряли с помощью Muse Cell Analyzer (Millipore Sigma) для расчета жизнеспособности. Клетки высевали в колбу Т225 так, чтобы плотность живых клеток составляла 7000 клеток/см2 для клеток изделия из замороженных промежуточных клеток и 12000 клеток/см2 для клеток клеточного препарата, полученного из пульпы зуба, и культивировали в CO2-инкубаторе (37°C, 5% CO2) в течение 4 дней. После культивирования среду удаляли из колбы Т225. Затем клетки промывали DPBS, к ним добавляли 0,25% трипсин-EDTA, и каждой смеси давали постоять в инкубаторе с CO2 в течение 5 минут. После подтверждения отслаивания клеток к ним добавляли среду DMEM для суспендирования клеток и собирали итоговое количество каждой клеточной суспензии. Центрифугирование (300 x g, 5 минут, комнатная температура) выполняли для осаждения клеток. После удаления каждой надосадочной жидкости к ним добавляли среду DMEM для суспендирования клеток, и количество живых клеток и количество всех клеток в каждой клеточной суспензии измеряли с помощью Muse Cell Analyzer (Millipore Sigma) для расчета жизнеспособности.
(Сбор культуральной надосадочной жидкости)
Клетки, собранные в предкультуре, высевали в колбы T25, так что количество живых клеток составляло 28000 клеток на колбу, и их распределяли на нестимулированную группу, группу, стимулированную TNF-α, и группу, стимулированную IFN-γ, для начала культивирования. Количество среды для каждой группы составляло 10 мл на колбу, и конечную концентрацию TNF-α доводили до 10 нг/мл (с использованием 2 мкг/мл концентрированного раствора), а конечную концентрацию IFN-γ доводили до 100 Ед/мл (1 х 106 Ед/мл). На 3 день после начала культивирования 0,5 мл надосадочной жидкости каждой культуры собирали в криопробирку и криоконсервировали. После сбора культуральных надосадочных жидкостей клетки промывали DPBS, к ним добавляли 0,25% трипсин-EDTA и каждой смеси давали постоять в инкубаторе с CO2 в течение 5 минут. После подтверждения отслаивания клеток к ним добавляли среду DMEM и собирали итоговое количество каждой клеточной суспензии. Выполняли центрифугирование (300 x g, 5 минут, комнатная температура) и каждый супернатант удаляли. После этого к ним добавляли среду DMEM для суспендирования клеток, и количество живых клеток и количество всех клеток в каждой клеточной суспензии измеряли с помощью Muse Cell Analyzer (Millipore Sigma) для расчета жизнеспособности.
(Измерение цитокинов)
Концентрации различных факторов, включая цитокин, содержащихся в собранных культуральных надосадочных жидкостях, измеряли с помощью LEGENDplex (BioLegend, Inc.). Принцип измерения LEGENDplex будет изложен ниже. Первичное антитело, которое связано с гранулами и различается для каждого антигена (типа цитокина), добавляют к образцу, содержащему вещество, которое необходимо измерить на предмет связывания первичного антитела с этим веществом. Впоследствии к нему добавляли биотинилированное вторичное антитело и связывали его с веществом, связанным с первичным антителом, и стрептавидин, меченный фикоэритрином (РЕ), дополнительно связывался с ним. Поскольку авидин специфически связывается с биотином, это можно измерить с помощью проточной цитометрии для количественного определения меченного фикоэритрином (РЕ) стрептавидина, связанного с гранулами, по интенсивности его флуоресценции. Поскольку это количественное значение пропорционально количеству измеряемого вещества, содержащегося в образце, это вещество можно определить количественно.
(Результаты: уровень экспрессии различных факторов в нестимулированных группах)
Концентрации различных факторов, содержащихся в культуральных надосадочных жидкостях в нестимулированных группах, показаны на Фиг.12. И промежуточные клетки, и клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, экспрессируют ММР-2, IGFBP-4 и цистатин С на высоком уровне (Фиг. 12).
Кроме того, как промежуточные клетки, так и клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, экспрессируют IL-6, IL-11, MCP-1, IL-8, GROα, HGF, VEGF, VCAM-1, TIMP-3, TIMP-2 и TIMP-1 (Фиг.13).
Кроме того, количество промежуточных клеток и клеток, содержащихся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, невелико, но как промежуточные клетки, так и клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, экспрессируют IL-23, TNF. -α, IL-18, IL-33, IL-27, TARC, ENA-78, MIP-3α, MIP-1β, IP-10, SCF и ICAM-1 (Фиг. 14). Кроме того, как промежуточные клетки, так и клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, не экспрессируют или почти не экспрессируют IL-21, экзотаксин, MIP-1a, MIG, I-TAC и GM-CSF. Экспрессия IFN-a не детектируется в промежуточных клетках, но следовые количества IFN-a экспрессируются в клетках, содержащихся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба. Кроме того, хотя это и не показано в таблице, как промежуточные клетки, так и клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, не экспрессируют или почти не экспрессируют IL-2, IL-4, IL-5, IL-9 и IL- 13, которые являются воспалительными цитокинами.
(Результаты: Различие в уровнях экспрессии различных факторов в нестимулированных группах между промежуточными клетками и клетками, содержащимися в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба)
Соотношения концентраций факторов, уровни экспрессии которых относительно различаются между промежуточными клетками и клетками, содержащимися в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, среди различных факторов, содержащихся в культуральных надосадочных жидкостях, показаны на Фиг.15. Уровни экспрессии этих факторов в клетках, содержащихся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, высоки по сравнению с промежуточными клетками. В частности, уровни экспрессии IL-6, IL-11, HGF, IGFBP-4, TIMP-3 и TIMP-1 в клетках, содержащихся в препарате клеток, полученных из пульпы зуба, в 1,5 или более раз превышает уровни его экспрессии в промежуточных клетках.
(Результаты: изменение уровня экспрессии IL-6 в результате стимуляции TNF-α и IFN-γ)
Концентрации IL-6, содержащиеся в культуральных надосадочных жидкостях при стимуляции TNF-α и IFN-γ, будут показаны на Фиг.16. В промежуточных клетках уровень экспрессии IL-6 увеличивается из-за стимуляции как TNF-α, так и IFN-γ по сравнению с отсутствием стимуляции. То же самое относится к клеткам, содержащимся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба.
(Результаты: изменение уровня экспрессии IL-11 в результате стимуляции TNF-α и IFN-γ)
Концентрации IL-11, содержащиеся в культуральных надосадочных жидкостях при стимуляции TNF-α и IFN-γ, будут показаны на Фиг. 17. В промежуточных клетках уровень экспрессии IL-11 увеличивается из-за стимуляции как TNF-α, так и IFN-γ по сравнению со случаем отсутствия стимуляции. То же самое относится к клеткам, содержащимся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба.
(Результаты: изменение уровня экспрессии IP-10 в результате стимуляции TNF-α и IFN-γ)
Концентрации IP-10, содержащиеся в культуральных надосадочных жидкостях при стимуляции TNF-α и IFN-γ, будут показаны на Фиг. 18. В промежуточных клетках уровень экспрессии IP-10 увеличивается из-за стимуляции как TNF-α, так и IFN-γ по сравнению со случаем отсутствия стимуляции. Хотя концентрация IP-10 в случае отсутствия стимуляции не отображается на Фиг. 18, это связано с тем, что концентрация IP-10 низкая, и, как показано на Фиг. 14, IP-10 экспрессируется в промежуточных клетках даже в случае отсутствия стимуляции. То же самое относится к клеткам, содержащимся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба.
(Результаты: изменение уровня экспрессии MCP-1 вследствие стимуляции TNF-α и IFN-γ)
Концентрации МСР-1, содержащиеся в культуральных надосадочных жидкостях при стимуляции TNF-α и IFN-γ, будут показаны на Фиг. 19. В промежуточных клетках уровень экспрессии MCP-1 увеличивается из-за стимуляции как TNF-α, так и IFN-γ по сравнению со случаем отсутствия стимуляции. То же самое относится к клеткам, содержащимся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба.
(Результаты: изменение уровня экспрессии GM-CSF из-за стимуляции TNF-α и IFN-γ)
Концентрации GM-CSF, содержащиеся в культуральных надосадочных жидкостях при стимуляции TNF-α и IFN-γ, будут показаны на Фиг. 20. В случае отсутствия стимуляции экспрессия GM-CSF с трудом распознается как в промежуточных клетках, так и в клетках, содержащихся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба. В промежуточных клетках экспрессия GM-CSF индуцируется стимуляцией TNF-α, но не индуцируется стимуляцией IFN-γ. То же самое относится к клеткам, содержащимся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба.
(Результаты: изменение уровня экспрессии HGF вследствие стимуляции TNF-α и IFN-γ)
Концентрации HGF, содержащиеся в культуральных надосадочных жидкостях при стимуляции TNF-α и IFN-γ, будут показаны на Фиг. 21. В промежуточных клетках уровень экспрессии HGF снижается из-за стимуляции TNF-α, но увеличивается из-за стимуляции IFN-γ по сравнению со случаем отсутствия стимуляции. То же самое относится к клеткам, содержащимся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба.
(Результаты: изменение уровня экспрессии IL-8 вследствие стимуляции TNF-α и IFN-γ)
Концентрации IL-8, содержащиеся в культуральных надосадочных жидкостях при стимуляции TNF-α и IFN-γ, будут показаны на Фиг. 22. В промежуточных клетках уровень экспрессии IL-8 увеличивается из-за стимуляции TNF-α, но не изменяется при стимуляции IFN-γ по сравнению со случаем отсутствия стимуляции. То же самое относится к клеткам, содержащимся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба.
Пример 28: Свойства (способность к делению клеток) клеток, полученных из пульпы зуба
Изделие из замороженных промежуточных клеток, полученное в Примере 7, и клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, полученный в Примере 16, размораживали и центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) для осаждения клеток. Затем клетки суспендировали в среде DMEM (10% FBS), высевали в планшет для культивирования клеток так, чтобы они имели плотность от 5000 до 15000 клеток/см2, и культивировали так, чтобы они становились конфлуентными от 90% до 100%. Клетки промывали PBS, к ним добавляли трипсин-EDTA и каждой смеси давали постоять в течение 5-10 минут при 37°C для отслоения клеток. Туда добавляли среду DMEM (10% FBS) для суспендирования клеток и измеряли количество живых клеток. Затем клетки высевали в планшет для культивирования клеток так, чтобы они имели плотность от 5000 до 15000 клеток/см2, и культивировали так, чтобы они становились конфлуентными на 90-100%. Субкультивирование клеток повторяли, и количество живых клеток измеряли каждый раз, когда субкультивирование было завершено, для расчета количества делений клеток. Количество клеточных делений рассчитывали из количества живых клеток в начале каждого субкультивириования и количества живых клеток в конце культивирования в соответствии со следующим уравнением.
Количество делений клеток = log2 (количество живых клеток при завершении культивирования/количество живых клеток в начале культивирования)
(Результаты)
Клетки, содержащиеся в изделии из замороженных промежуточных клеток, имели способность претерпевать, по меньшей мере, 14 делений даже после оттаивания, и время удвоения в это время составляло в диапазоне 3 дней (в диапазоне 72 часов). Кроме того, клетки, содержащиеся в клеточном препарате, полученном из пульпы зуба, обладали способностью претерпевать, по меньшей мере, 4 деления даже после оттаивания, и время удвоения в это время составляло в диапазоне 3 дней (в диапазоне 72 часов).
Пример 29: Пример использования 1 клеточного препарата, полученного из пульпы зуба
Клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, вводили пациентам с аутоиммунными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит и коллагеноз, с помощью таких средств, как внутривенная капельная инфузия и местная инъекция, в качестве лекарственных средств для облегчения различных симптомов, связанных с заболеваниями.
Пример 30: Пример использования 2 клеточного препарата, полученного из пульпы зуба
Клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, при использовании размораживают. Во время использования клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, вынимают из емкости для хранения жидкого азота и размораживают путем нагревания на водяной бане при температуре от 36,5°C до 37,5°C. Размороженный клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, можно вводить людям в виде фармацевтических продуктов с помощью таких средств, как внутривенная капельная инфузия или местная инъекция. В случае внутривенной капельной инфузии клеточный препарат, полученный из пульпы зуба, переносится в диализный мешок из контейнера для криоконсервации клеток, а затем вводится пациенту посредством внутривенной капельной инфузии. В случае местной инъекции клеточный препарат из пульпы зуба переносят в шприц из контейнера для криоконсервации клеток, а затем вводят местно пациенту.
Пример 31: Пример использования 3 клеточного препарата, полученного из пульпы зуба
Клеточные препараты, полученные из пульпы зуба, перед применением размораживают и используют в медицинских учреждениях. Соответственно, клеточные препараты, полученные из пульпы зуба, которые были криоконсервированы в хранилищах их производителей, дистрибьюторов и т.п., отправляются в замороженном состоянии в ответ на запросы медицинских учреждений и доставляются в медицинские учреждения. Клетки, которые были перенесены в замороженном состоянии, размораживают непосредственно перед введением пациентам, а затем вводят пациентам посредством внутривенной капельной инфузии или подобного в медицинских учреждениях.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение полезно, например, для обеспечения фармацевтических продуктов, которые можно вводить людям и которые содержат клетки, полученные из пульпы зуба, в качестве активных компонентов.
Изобретение относится к области клеточной биологии и медицины и представляет собой способ получения клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками. Для осуществления указанного способа сначала осуществляют стадию гидролиза пульпы зуба коллагеназой и нейтральной металлопротеазой для приготовления суспензии пульпы зуба. Затем указанную суспензию культивируют для пролиферации плюрипотентных стволовых клеток, содержащихся в суспензии при 37°C в присутствии 5% СО2 в среде DMEM с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки в концентрации 20% (об./об.) и антибиотиков, при замене среды каждые 2-4 дня. После чего пролиферированные плюрипотентные стволовые клетки замораживают в состоянии, в котором плюрипотентные стволовые клетки суспендированы в первой жидкости для криоконсервации. Далее замороженные плюрипотентные стволовые клетки размораживают. После чего их культивируют в состоянии, в котором плюрипотентные стволовые клетки прикреплены к поверхностям частиц носителя для пролиферации плюрипотентных стволовых клеток на поверхности частиц носителя при 37°C в среде DMEM с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки в концентрации 10% (об./об.) при подкормке глюкозой. Затем осуществляют стадию приведения частиц носителя в контакт с трипсином для отделения плюрипотентных стволовых клеток, прикрепленных к поверхностям частиц носителя, от частиц носителя и завершают процесс стадией приготовления суспензии отделенных плюрипотентных стволовых клеток. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность получения плюрипотентных стволовых клеток из пульпы зуба и обеспечивает создание нового препарата плюрипотентных стволовых клеток в форме, в которой можно поддерживать стабильность, подходящую для распределения или хранения. 23 з.п. ф-лы, 23 ил., 25 табл., 31 пр.
1. Способ получения клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, включающий:
стадию (а) гидролиза пульпы зуба коллагеназой и нейтральной металлопротеазой для приготовления суспензии пульпы зуба,
стадию (b) культивирования суспензии для пролиферации плюрипотентных стволовых клеток, содержащихся в суспензии при 37°C в присутствии 5% СО2 в среде DMEM с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки в концентрации 20% (об./об.) и антибиотиков, при замене среды каждые 2-4 дня,
стадию (c) замораживания пролиферированных плюрипотентных стволовых клеток в состоянии, в котором плюрипотентные стволовые клетки суспендированы в первой жидкости для криоконсервации,
стадию (d) размораживания замороженных плюрипотентных стволовых клеток,
стадию (е) культивирования размороженных плюрипотентных стволовых клеток в состоянии, в котором плюрипотентные стволовые клетки прикреплены к поверхностям частиц носителя для пролиферации плюрипотентных стволовых клеток на поверхности частиц носителя при 37°C в среде DMEM с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки в концентрации 10% (об./об.) при подкормке глюкозой,
стадию (f) приведения частиц носителя в контакт с трипсином для отделения плюрипотентных стволовых клеток, прикрепленных к поверхностям частиц носителя, от частиц носителя, и
стадию (g) приготовления суспензии отделенных плюрипотентных стволовых клеток.
2. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что качественные тесты плюрипотентных стволовых клеток выполняются на стадии (c) или (d).
3. Способ получения по п. 2, отличающийся тем, что качественные тесты выполняются на клетках, фракционированных из клеток перед суспендированием в первой жидкости для криоконсервации, на субкультивированных клетках, которые были фракционированы из клеток перед суспендированием в первой жидкости для криоконсервации, на предварительно замороженных клетках, которые были суспендированы в первой жидкости для криоконсервации и фракционированы, на клетках непосредственно после оттаивания, которые были фракционированы и заморожены, и/или на клетках, полученных фракционированием, замораживанием, оттаиванием и культивированием.
4. Способ получения по п. 3, отличающийся тем, что качественные тесты выполняются для одного или более из следующих качественных тестов a-j:
качественный тест a, который проверяет, что доля числа клеток, показывающих по существу веретеновидную форму во всех клетках при наблюдении под оптическим микроскопом, больше или равна 99%, больше или равна 99,5%, больше или равна до 99,9% или больше или равна 99,95%,
качественный тест b, который проверяет, что жизнеспособность клеток больше или равна 50%, больше или равна 60%, больше или равна 70%, больше или равна 80%, больше или равна 90% или больше или равна 95%,
качественный тест c, который проверяет, что клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45 в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, или проверяет, что клетки положительны по меньшей мере по одному из CD73 и CD90 и отрицательны по CD34 в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности,
качественный тест d, который проверяет, что клетки отрицательны по CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, или проверяет, что клетки отрицательны по меньшей мере по одному из числа CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности,
качественный тест е, который проверяет, что клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, когда клетки стимулируются интерфероном-γ, или проверяет, что по меньшей мере любая из клеток отрицательна по CD40, отрицательна по CD80, отрицательна по CD86 или положительна по антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, когда клетки стимулируются интерфероном-γ,
качественный тест f, который проверяет, что клетки экспрессируют простагландин E2 и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и уровень экспрессии простагландина E2 увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α,
качественный тест g, который проверяет, что уровень экспрессии аггрекана увеличивается при культивировании клеток в среде, содержащей вещество, которое индуцирует дифференцировку в хондроциты,
качественный тест h, который подтверждает, что количество кальция, накопленного в клетках, увеличивается, когда клетки культивируются в среде, содержащей вещество, которое вызывает дифференцировку в остеоциты,
качественный тест i, который подтверждает, что клетки обладают способностью делиться, по меньшей мере, 10, 14 или 15 раз в планшете для культивирования клеток, и
качественный тест j, который проверяет, что среднее время удвоения клеток в планшете для культивирования клеток составляет 96 часов, 84 часа, 72 часа, 48 часов или 36 часов в течение периода качественного теста i.
5. Способ получения по любому из пп. 1-4, дополнительно включающий загрузку суспензии на фильтрующую мембрану для сбора клеток, прошедших стадию (g).
6. Способ получения по п. 5, отличающийся тем, что фильтрующая мембрана имеет диаметр пор от 20 до 80 мкм.
7. Способ получения по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что пульпу зуба получают из постоянных или временных зубов человека.
8. Способ получения по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что коллагеназа включает коллагеназу I, коллагеназу II или их смесь.
9. Способ получения по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что нейтральная металлопротеиназа включает термолизин, диспазу или их смесь.
10. Способ получения по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что первая жидкость для криоконсервации, используемая на стадии (с), включает бикарбонатный раствор Рингера, человеческий сывороточный альбумин и DMSO.
11. Способ получения по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что частицы носителя, используемые на стадии (е), имеют по существу сферическую форму, имеющую диаметр от 80 до 300 мкм в набухшем состоянии.
12. Способ получения по п. 11, отличающийся тем, что частицы носителя представляют собой пористые частицы носителя, имеющие поры диаметром от 3 до 40 мкм, которые открыты на поверхности частиц носителя в набухшем состоянии.
13. Способ получения по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что частицы носителя содержат желатин.
14. Способ получения по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что протеаза, используемая на стадии (f), включает сериновую протеазу, металлопротеазу или их смесь.
15. Способ получения по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что протеаза, используемая на стадии (f), включает трипсин.
16. Способ получения по любому из пп. 1-15, дополнительно включающий стадию (h) замораживания суспензии, полученной на стадии (g), в состоянии, в котором суспензия суспендирована во второй жидкости для криоконсервации.
17. Способ получения по п. 16, отличающийся тем, что вторая жидкость для криоконсервации, используемая на стадии (h), включает бикарбонатный раствор Рингера, человеческий сывороточный альбумин и DMSO.
18. Способ получения по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что качественные тесты плюрипотентных стволовых клеток проводят на стадии (g).
19. Способ получения по п. 16 или 17, отличающийся тем, что качественные тесты плюрипотентных стволовых клеток проводят на стадии (g) или (h).
20. Способ получения по п. 18 или 19, отличающийся тем, что качественные тесты проводят на клетках, фракционированных из клеток перед суспендированием во второй жидкости для криоконсервации, на субкультивированных клетках, которые были фракционированы из клеток перед суспендированием во второй жидкости для криоконсервации, на предварительно замороженных клетках, которые были суспендированы во второй жидкости для криоконсервации и фракционированы, на клетках сразу после оттаивания, которые были фракционированы и заморожены, и/или на клетках, полученных фракционированием, замораживанием, оттаиванием и культивированием.
21. Способ получения по п. 18 или 20, отличающийся тем, что качественные тесты выполняются для одного или более из следующих качественных тестов a-j:
качественный тест a', который проверяет, что доля числа клеток, показывающих по существу веретеновидную форму во всех клетках при наблюдении под оптическим микроскопом, больше или равна 99%, больше или равна 99,5%, больше или равна 99,9% или больше или равна 99,95%,
качественный тест b', который проверяет, что жизнеспособность клетки больше или равна 50%, больше или равна 60%, больше или равна 70%, больше или равна 80%, больше или равна 90% или больше или равна 95%,
качественный тест c', который проверяет, что клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45 в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, или проверяет, что клетки положительны по меньшей мере по одному из CD73 и CD90 и отрицательны по CD34 в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности,
качественный тест d', который проверяет, что клетки отрицательны по CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, или проверяет, что клетки отрицательны по меньшей мере по одному из числа CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности,
качественный тест е', который проверяет, что клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, когда клетки стимулируются интерфероном-γ, или проверяет, что по меньшей мере любая из клеток отрицательна по CD40, отрицательна по CD80, отрицательна по CD86 или положительна по антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, когда клетки стимулируются интерфероном-γ,
качественный тест f, который проверяет, что клетки экспрессируют простагландин E2 и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и уровень экспрессии простагландина E2 увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α,
качественный тест g’, который проверяет, что уровень экспрессии аггрекана увеличивается при культивировании клеток в среде, содержащей вещество, которое индуцирует дифференцировку в хондроциты,
качественный тест h’, который проверяет, что количество кальция, накопленного в клетках, увеличивается при культивировании клеток в среде, содержащей вещество, которое индуцирует дифференцировку в остеоциты,
качественный тест i’, который проверяет способность клеток делиться, по меньшей мере, 3, 4 или 5 раз в планшете для культивирования клеток, и
качественный тест j’, который проверяет, что среднее время удвоения клеток в планшете для культивирования клеток составляет 96 часов, 84 часа, 72 часа, 48 часов или 36 часов в течение периода качественного теста i'.
22. Способ получения по любому из пп. 18-21, отличающийся тем, что показатель положительности CD107b в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качественных тестах на стадии (g) или (h), выше, чем соответствующий показатель положительности для плюрипотентных стволовых клеток, используемых в качественных тестах на стадии (c) или (d).
23. Способ получения по любому из пп. 18 - 22, отличающийся тем, что показатель положительности по меньшей мере одного из CD39, CD49a, CD61, CD107a, CD107b и CD143 в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качественных тестах на стадии (g) или (h), выше, чем соответствующий показатель положительности в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качественных тестах на стадии (c) или (d), и
где показатель положительности CD146 в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качественных тестах на стадии (g) или (h), ниже, чем соответствующий показатель положительности в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качественных тестах на стадии (c) или (d).
24. Способ получения по любому из пп. 18-23, отличающийся тем, что уровень экспрессии по меньшей мере одного из IL-6, HGF, IGFBP-4, IL-11, TIMP-3 и TIMP-2 в используемых плюрипотентных стволовых клетках в качественных тестах на стадии (g) или (h) выше, чем соответствующий уровень экспрессии в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качественных тестах на стадии (c) или (d).
| HADAEGH Y, et al., Characterization of stem cells from the pulp of unerupted third molar tooth, Indian J Dent Res, 2014, Vol | |||
| Видоизменение пишущей машины для тюркско-арабского шрифта | 1923 |
|
SU25A1 |
| Паровоз для отопления неспекающейся каменноугольной мелочью | 1916 |
|
SU14A1 |
| WO 2014185470 A1, 20.11.2014 | |||
| MERTEN OTTO-WILHELM, Advanced in cell culture: anchorage dependence, Philos Trans R Loc | |||
