Способ оценки агрессивного потенциала рака молочной железы неспецифического типа IDC/NOS type carcinoma при помощи анализа опухолевого почкования Российский патент 2023 года по МПК G01N33/53 A61B5/00 

Способ относится к медицине, а именно к ее разделам: патологической анатомии и онкологии.

В настоящее время метастатический потенциал опухоли оценивается по классическим дифференциально-диагностическим методикам анализа рака молочной железы (РМЖ), включая РМЖ неспецифического типа (NOS type). Гистологические срезы, полученные при проводке хирургического материала от больных, оценивают, используя световую микроскопию (окраска гематоксилином и эозином), а также применяют иммуногистохимическую методику.

Недостатками существующей системы оценки является то, что патоморфолог классифицирует рак молочной железы на люминальные типы, при этом стоит отметить, что данная классификация РМЖ в настоящее время устаревает, и уже, как правило, не используется западным патологоанатомическим сообществом, как фактор прогноза опухоли. Тем не менее, в РФ вышеназванная классификация продолжает широко использоваться и даже, более того, не позволяет внедрять более адекватные способы метастатического прогноза в рутинную патологоанатомическую диагностику, такие как оценка опухолевых почек.

Почкование опухоли является онкопатологическим процессом, ассоциированным с многими видами раков. Несмотря на то, что в настоящее время нет точного определения данного феномена, многие ученые согласны, что почкование объясняется небольшими опухолевыми кластерами (до пяти клеток в большинстве исследований), которые отделились от основной опухоли и наблюдаются в виде изолированных клеток или небольших скоплений недалеко от основной опухоли. Причем стоит отметить, что обычно в опухолях, ассоциированных с почкованием число дедифференцированных элементов гораздо больше. Более того сами опухолевые почки являются дедифференцированными и, как правило, часто инвазируют края резекции. Так, в последние годы феномен опухолевого почкования активно изучался, как новый способ прогнозирования поведения опухоли в ассоциации с клиническим подходом.

Наибольшего успеха добились Alessandro Luglil et al. создав целый алгоритм прогнозирования поведения колоректального рака на основе анализа опухолевого почкования, который принимается нами за прототип. «Lugli A, Kirsch R, Ajioka Y, Bosman F, Cathomas G, Dawson H, El Zimaity H, Fléjou JF, Hansen TP, Hartmann A, Kakar S, Langner C, Nagtegaal I, Puppa G, Riddell R, Ristimäki A, Sheahan K, Smyrk T, Sugihara K, Terris B, Ueno H, Vieth M, Zlobec I, Quirke P. Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Mod Pathol. 2017 Sep;30(9):1299-1311. doi: 10.1038/modpathol.2017.46. Epub 2017 May 26. PMID: 28548122.»

Гистологические срезы изготавливают из биопсионного или операционного материала стандартным способом, окрашивают гематоксилином и эозином. Для оценки прогноза опухоли используют метод горячей точки. В зоне резекции оценивают 10 неперекрывающихся полей зрения высокого увеличения, на наличие опухолевых почек, выбирают одно поле, в котором опухолевых почек больше всего. Подсчитывают их количество и устанавливают категорию:

0-4 почек - низкая степень почкования опухоли.

5-9 почек - промежуточная степень почкования опухоли.

10 или более почек - высокая степень почкования опухоли.

Недостатком прототипа является оценка опухолевых почек методом горячей точки, что позволяет упустить из поля зрения патоморфолога некоторое количество почек и установить ложноблагоприятный прогноз.

Технический результат заключается в необходимости расширения способов прогнозирования поведения рака молочной железы неспецифического типа IDC/NOS type сarcinoma.

Технический результат достигается тем, что способ оценки состоит из двух этапов:

На первом этапе - проводят гистологическое исследование, окрашивают препараты гематоксилином и эозином. Определяют кластеры опухолевых клеток до 5 штук, растущие как в пределах основной опухоли (интраопухолевое почкование), так и инвазирующие края резекции (периопухолевое почкование). Также проводят подсчет опухолевых почек на 10 неперекрывающихся полей зрения высокого увеличения (High-power fields/HPF, x400). Затем используют двухступенчатую систему градации оценки опухолевого почкования:

0-10 почек - низкая степень почкования опухоли.

10 или более почек - высокая степень почкования опухоли.

При недостаточной визуализации опухолевых почек при использовании окраски гематоксилином и эозином, применяют иммуногистохимическую методику с PanCK-антителами (антитела к панцитокератину) AE1/AE3 CK.

На втором этапе - проводят иммуногистохимическое исследование для определения повышенной/пониженной экспрессии с антителами к: Е-кадгерину - белку адгезии (E-cadherin), Бета-катенину - цитоплазматическому подмембранному белку, ассоциированному с Е-кадгерином (Beta-catenin), Виментину - белку промежуточных филаментов мезодермальных тканей (Vimentin), Gata3 - фактору транскрипции, Her2 - 2-му рецептору эпидермального фактора роста человека, рецептору к эстрогену (ER), рецептору к прогестерону (PR). После чего определяют прогноз для адекватного лечения пациентов с таким заболеванием, и, если установлена высокая степень почкования опухоли, то она с высокой степенью вероятности ассоциирована как с лимфогенным, так и с гематогенным метастазированием, а если установлена низкая степень почкования опухоли, то она не ассоциирована метастазированием.

В результате проводимого на втором этапе иммуногистохимического исследования выявляется повышенная или пониженная экспрессия белков на поверхности клеток, что проявляется визуально изменением окрашивания.

Второй этап необходим для подтверждения природы клеток опухолевых почек, их дифференциальной диагностики от других клеток, морфологически сходных. Это обеспечивает доказательность заключения патоморфолога.

ИЗОБРЕТЕНИЕ ПОЯСНЯЕТСЯ ФИГУРАМИ (ФИГ.1-11).

На фиг. 1-11 представлены отдельные диагностические паттерны, на которые стоит обращать внимание при оценке опухолевого почкования в РМЖ NOS type.

На фиг. 1 Проявление почкования опухоли: периопухолевое почкование при раке молочной железы. Окраска гематоксилином и эозином (увеличение х100).

На фиг. 2 Проявление почкования опухоли: внутриопухолевое почкование при раке молочной железы. Окраска гематоксилином и эозином (увеличение х100).

На фиг. 3 Выраженная экспрессия AE1/AE3 в опухолевых почках при интраопухолевом почковании, как дополнительный способ визуализации мелких опухолевых кластеров. ИГХ-реакция (увеличение х50).

На фиг. 4 Экспрессия Е-кадгерина в основном опухолевом кластере, а также в опухолевых почках при раке молочной железы. ИГХ-реакция (увеличение х50).

На фиг. 5 Снижение экспрессии Е-кадгерина в опухолевых «почках» при периопухолевом почковании при раке молочной железы. ИГХ-реакция (увеличение х200).

На фиг. 6 Повышенная экспрессия бета-катенина в опухолевых «почках» при периопухолевом почковании при раке молочной железы. ИГХ-реакция (увеличение х100).

На фиг. 7 Выраженная экспрессия PR в фокусе основной опухоли при раке молочной железы. ИГХ-реакция (увеличение х100).

На фиг. 8 Слабая экспрессия PR в опухолевых почках при раке молочной железы. ИГХ-реакция (увеличение х100).

На фиг. 9 Выраженная экпрессия ER в интраопухолевом почковании при раке молочной железы. ИГХ-реакция (увеличение х100).

На фиг. 10 Выраженная экпрессия ER в клетках интранодулярного метастаза при раке молочной железы. ИГХ-реакция (увеличение х100).

На фиг. 11 Выраженная экпрессия ER в клетках перинодулярного метастаза при раке молочной железы. ИГХ-реакция (увеличение х100).

Способ осуществляется следующим образом: гистологические препараты изготавливают из операционного или биопсийного материала стандартным способом, затем проводят гистологическую диагностику при окраске препаратов гематоксилином и эозином. При оценке обращают внимание на кластеры опухолевых клеток до 5 штук, растущие как в пределах основной опухоли (интраопухолевое почкование), так и инвазирующие края резекции (периопухолевое почкование). Также проводят подсчет опухолевых почек на 10 неперекрывающихся полей зрения высокого увеличения (High-power fields/HPF, x400). При недостаточной визуализации опухолевых почек при использовании окраски гематоксилином и эозином, применяют иммуногистохимическую методику с PanCK-антителами (антитела к панцитокератинам) AE1/AE3 CK.

На втором этапе - проводят иммуногистохимическое исследование для определения повышенной/пониженной экспрессии с антителами к: Е-кадгерину - белку адгезии (E-cadherin), Бета-катенину - цитоплазматическому подмембранному белку, ассоциированному с Е-кадгерином (Beta-catenin), Виментину - белку промежуточных филаментов мезодермальных тканей (Vimentin), Gata3 - фактору транскрипции, HER2 - 2-й рецептор эпидермального фактора роста человека (human epidermal growth factor receptor 2), рецептору к эстрогену (ER), рецептору к прогестерону (PR). Морфологическая характеристика клеток, экспрессирующих на своей поверхности те или иные антигены представлена в таблице.

Таблица Форма клеток Высокая частота экспрессии Низкая частота экспрессии
Или более слабая экспрессия Клетки основного опухолевого кластера Как правило, круглые, с круглым хорошо оформленным ядром uPA, Maspin, pERK, TGF-beta, Matrilysin, p53, uPAR
Часто имеется мутация в APC gene CD8+ T-cells, pAKT, syndecan-1
Редко возможна MSI Клетки инвазивного фронта Встречаются как простые круглые, клетки, так и веретновидные и полиморфные клетки EGFR, β-catenin,
EphB2-/Bcl2. Ecadherin, CD44, CD44v6, CD166, EpCAM, APAF-1 Клетки опухолевых почек Количество веретеновидных и полиморфных клеток самое высокое.
Большое количество многоотростчатых клеток с псевдоподиями.
Количество круглых клеток меньше, по сравнению с группами выше. ZEB-1, ZEB-2,
MMP-2, MMP-9, CathB, CXCL12, β-catenin, Beta-IIITubulin , hMena, Laminin5γ2, p16, cyclinD1, ABCG5, CD133, Vimentin,
В ряде случаев fibronectin Ki67, E-cadherin, PanCK

Опухоли молочной железы имеют менее выраженную тенденцию к эпителиально-мезенхимальному переходу, поэтому предлагается использовать двухступенчатую систему градации оценки опухолевого почкования:

0-10 почек - низкая степень почкования опухоли.

10 или более почек - высокая степень почкования опухоли.

При этом стоит отметить, что высокая степень почкования опухоли, то она с высокой степенью вероятности ассоциирована как с лимфогенным, так и с гематогенным метастазированием. Так известно, что опухоли, имеющие опухолевые почки в количестве более 10 в 4 полях HPF имеют более высокий метастатический потенциал.

ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ СПОСОБА

Исследование проводилось на базе Института Морфологии Человека им. А.П. Авцына.

Пациентка А. 63 года с диагнозом инвазивный протоковый рак молочной железы неспецифического типа. Был произведен серийный забор биопсийного материала, посредством транскутанной биопсии молочных желез, с последующим исследованием с использованием способа оценки опухолевого почкования.

На первом этапе исследования гистологические срезы изготавливали по стандартной методике и окрашивали гематоксилином и эозином. При световой микроскопии было обнаружено 8 опухолевых почек на 10 полей зрения высокого увеличения х400. Установлена низкая степень почкования опухоли. На втором этапе проводили иммуногистохимическое исследование с антителами к E-cadherin, Beta-catenin, Vimentin, Gata3, Her-2, ER, PR. Отмечена повышенная экспрессия бета-катенина и сниженная экспрессия PR и Е-кадгерина клетками опухолевых почек при периопухолевом почковании по сравнению с клетками основной опухоли.

Сделан прогноз о низком метастатическом потенциале опухоли.

Пациентке проведена радикальная мастэктомия с лимфодиссекцией. При патологоанатомическом исследовании хирургического материала выявлено, что опухоль является высокодифференцированной (G1). Патологоанатомический диагноз: Инвазивный протоковый рак неспецифического типа G1. В 4 регионарных лимфоузлах были обнаружены метастазы опухоли. Назначена адьюватная химиотерапия. Пациентка выписана с улучшением.

Пациентка Н. 68 лет. с диагнозом инвазивный протоковый рак молочной железы неспецифического типа. Был произведен серийный забор биопсийного материала, посредством транскутанной биопсии молочных желез, с последующим исследованием с использованием способа оценки опухолевого почкования.

На первом этапе исследования гистологические срезы изготавливали по стандартной методике и окрашивали гематоксилином и эозином. При световой микроскопии было обнаружено 11 опухолевых почек на 10 полей зрения высокого увеличения х400. В связи с недостаточной визуализацией мелких опухолевых кластеров был использован дополнительный способ, а именно иммуногистохимическое исследование с AE1/AE3 CK. Дополнительно обнаружены еще 3 участка опухолевого почкования. Всего установлено наличие 14 опухолевых почек, что означает высокую степень почкования опухоли. На втором этапе проводили иммуногистохимическое исследование с антителами к E-cadherin, Beta-catenin, Vimentin, Gata3, Her-2, ER, PR. Отмечена повышенная экспрессия ER клетками опухолевых почек при интраопухолевом почковании по сравнению с клетками основной опухоли.

Сделан прогноз о высоком метастатическом потенциале опухоли.

Пациентке проведена радикальная мастэктомия с лимфодиссекцией. При патологоанатомическом исследовании хирургического материала выявлено, что опухоль имеет среднюю степень дифференцировки (G2). Патологоанатомический диагноз: Инвазивный протоковый рак неспецифического типа G2. В 11 регионарных лимфоузлах были обнаружены метастазы опухоли. Назначена адьюватная химиотерапия. Пациентка выписана с улучшением.

Таким образом, предложенный нами способ позволяет адекватно судить о метастатическом потенциале РМЖ NOS type и давать соответствующий прогноз врачам-клиницистам для адекватного лечения пациентов с таким заболеванием, а именно высокая степень почкования опухоли более вероятно ассоциирована как с лимфогенным, так и с гематогенным метастазированием. Низкая степень почкования опухоли не ассоциирована с метастазированием.

Изобретение относится к медицине, а именно к ее разделам: патологической анатомии и онкологии, и может быть использовано для оценки агрессивного потенциала рака молочной железы неспецифического типа IDC/NOS type carcinoma. Способ включает проведение гистологического исследования, для чего вначале окрашивают препараты гематоксилином и эозином; определяют кластеры опухолевых клеток до 5 штук, растущих как в пределах основной опухоли, так и инвазирующих края резекции, и проводят подсчет опухолевых почек на 10 неперекрывающихся полях зрения высокого увеличения High-power fields/HPF, x400. Затем используют двухступенчатую систему градации оценки опухолевого почкования. При результате от 0 до 10 почек определяют низкую степень почкования опухоли, не ассоциированную с метастазированием; при результате 10 или более почек - высокую степень почкования опухоли, ассоциированную с высоким потенциалом метастазирования лимфогенным или гематогенным путем. Для дополнительного обнаружения участка опухолевого почкования при недостаточной визуализации опухолевых почек при использовании окраски гематоксилином и эозином, применяют иммуногистохимическую методику с PanCK-антителами AE1/AE3 CK. Изобретение обеспечивает расширение способов прогнозирования поведения рака молочной железы неспецифического типа. 1 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ оценки агрессивного потенциала рака молочной железы неспецифического типа IDC/NOS type сarcinoma по вероятности метастазирования, путем анализа опухолевого почкования, включающий анализ опухолевого почкования, отличающийся тем, что проводят гистологическое исследование, для этого вначале окрашивают препараты гематоксилином и эозином, далее определяют кластеры опухолевых клеток до 5 штук, растущих как в пределах основной опухоли, так и инвазирующих края резекции, и, таким образом, проводят подсчет опухолевых почек на 10 неперекрывающихся полях зрения высокого увеличения High-power fields/HPF, x400; затем используют двухступенчатую систему градации оценки опухолевого почкования и при результате от 0 до 10 почек, определяют низкую степень почкования опухоли, не ассоциированную с метастазированием, при результате 10 или более почек - высокую степень почкования опухоли, ассоциированную с высоким потенциалом метастазирования лимфогенным или гематогенным путем.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для дополнительного обнаружения участка опухолевого почкования при недостаточной визуализации опухолевых почек при использовании окраски гематоксилином и эозином, применяют иммуногистохимическую методику с PanCK-антителами AE1/AE3 CK.