Способ прогнозирования прогрессирующей бронхиальной обструкции у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких Российский патент 2023 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 A61B5/91 G16H50/30 

Изобретение относится к области медицины, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования риска прогрессирующей бронхиальной обструкции у больных хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ).

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) – это распространенное заболевание, которое характеризуется персистирующим ограничением скорости воздушного потока, обычно прогрессирует и сопровождается хроническим воспалительным ответом легких на действие патогенных частиц и газов [1]. Для пациентов, страдающих ХОБЛ, характерно снижение постбронходилатационных значений объема форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1) менее 80% от должного и соотношения ОФВ1 к форсированной жизненной емкости легких менее 0,70. Уменьшение постбронходилатационного ОФВ1 (ОФВ1б) в течение года на 50 мл и более считается маркером быстрого прогрессирования бронхиальной обструкции [2]. В случае, если ОФВ1б в течение года уменьшается менее, чем на 50 мл, можно судить об относительно стабильном течении ХОБЛ и, как следствие, более благоприятном прогнозе заболевания.

Известен способ прогноза прогрессирования ХОБЛ, включающий измерение ОФВ1, отличающийся тем, что определяют содержание растворимых молекул мембранного антигена CD8+ по формуле: растворимые молекулы мембранного антигена CD8+ =а + b × ОФВ1, где а – константа, равная 231,94, b – нестандартизованный коэффициент, равный 2,0012, и при значении содержания растворимых молекул мембранного антигена CD8+ менее 351 определяют неблагоприятное прогрессирующее течение ХОБЛ [3]. Основным недостатком данного способа является отсутствие четкого определения прогрессирующего течения ХОБЛ, что обусловлено использованием авторами поперечного дизайна исследования при разработке способа. Фактически, способ основан на измерении единственного показателя (ОФВ1) и не учитывает генетические особенности пациентов, данные о симптомах и анамнезе заболевания, которые могли бы индивидуализировать подход к каждому пациенту. К тому же, согласно международным рекомендациям, определяя степень бронхиальной обструкции у пациентов с ХОБЛ, ориентируются на постбронходилатационное значение ОФВ1. Какое именно значение ОФВ1 использовано в приведенном способе авторами не уточняется.

В качестве ближайшего аналога изобретения выбран способ прогнозирования прогрессирования ХОБЛ [4], заключающийся в проведении иммунологического исследования с определением способности иммунокомпетентных клеток вырабатывать трансформирующий ростовой фактор β1 (TGF-β1) и фактор роста фибробластов (bFGF). При спонтанном уровне TGF-β1≥1122,71 пг/мл и bFGF≤37,2 пг/мл прогнозируют благоприятное течение ХОБЛ со снижением ОФВ1 не более 50 мл в год, а при спонтанном уровне TGF-β1≤1025,5 пг/мл и bFGF≥40,1 пг/мл прогнозируют неблагоприятное течение ХОБЛ со снижением ОФВ1 более чем на 50 мл в год.

Несмотря на то, что способ был разработан в ходе динамического наблюдения больных и содержит конкретный критерий прогрессирующего течения ХОБЛ, его основным недостатком является неспецифичность маркеров TGF-β1 и bFGF, уровень которых может варьировать в зависимости от наличия различных заболеваний (сахарный диабет, заболевания почек, инсульт, опухоли различных тканей, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и др.) [5, 6] и, таким образом, не может служить надежным прогностическим критерием нестабильного течения ХОБЛ, поскольку данная патология характеризуется высокой частотой выявления коморбидных состояний. Также непонятно, как трактовать прогноз при значениях концентраций TGF-β1 и bFGF, лежащих в диапазонах 1025,5-1122,71 пг/мл и 37,2-40,1 пг/мл соответственно. Кроме того, приведенный способ не учитывает клинико-функциональные особенности обследуемых, а также роль наследственных факторов, имеющих большое значение в патогенезе заболевания.

Задачей настоящего изобретения являлось создание способа, пригодного для прогнозирования прогрессирования бронхиальной обструкции у больных ХОБЛ в европейской популяции, и учитывающего индивидуальные генетические особенности обследуемых, анамнез заболевания и данные спирометрии.

Поставленная задача достигается тем, что оценку риска прогрессирования бронхиальной обструкции при ХОБЛ проводят на основании данных генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs11562975 гена TRPM8, при этом дополнительно учитывают значение ОФВ1б, частоту обострений и выраженность симптомов согласно стандартизированному тесту «COPD Assessment Test» (САТ).

Способ осуществляют следующим образом:

1. Производят генотипирование полиморфизма rs11562975 гена TRPM8. Для этого выделяют геномную ДНК и с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществляют амплификацию целевого участка гена TRPM8, содержащего полиморфный сайт. Смесь для ПЦР должна включать: ДНК - 50 нг, буфер для ПЦР 1х, MgCl2 - 2,5 мМ, дезоксинуклеозидтрифосфаты - 0,25 мМ, прямой праймер - 0,5 мкМ, обратный праймер - 0,02 мкМ, флуоресцентный зонд - 0,5 мкМ, Hot-Start Taq-полимераза - 1 ЕД, вода - до 25 мкл. Последовательность олигонуклеотидов, используемых в реакции: праймер прямой 5’- CCAGTACCTTATGGATGACTT-3’, обратный 5’- GTAAAGAATCAGTAAATGTGAACCACT-3’, зонд 5’-FAM-CTCCGAATGCAGTTTCCTCTCGGAG-BHQ1-3’. Амплификацию проводят в режиме: предварительная денатурация при 95ºС/1,5 мин., первые 25 циклов – денатурация при 95ºC/1 сек., отжиг/элонгация при 62ºC/15 сек., последующие 45 циклов – денатурация при 95ºC/1 сек., отжиг/элонгация при температуре 58ºС/15 сек., финальная элонгация 72ºC/1 мин. Непосредственно после амплификации проводят анализ плавления олигонуклеотидного зонда, для этого выполняют предварительную денатурацию при 95ºC/1 мин, гибридизацию при 40ºC/1 мин, а затем увеличивают температуру от 40°C до 70°C с шагом 0,5°C/5 сек. Используя программное обеспечение амплификатора, на каждом шаге регистрируют уровень флуоресцентного сигнала на канале FAM. Получаемые при этом кривые плавления, отражающие зависимости производной уровня флуоресценции от температуры, позволяют идентифицировать конкретные генотипы. Одиночные пики плавления на 54,4°C и 44°C указывают на генотипы GG и CC, соответственно, а одновременное присутствие двух пиков свидетельствует о носительстве гетерозиготного генотипа GC.

2. Через 15 минут после ингаляции аэрозоля сальбутамола в дозе 400 мкг методом спирометрии измеряют значение ОФВ1 в процентах от должного.

3. Уточняют частоту обострений за предыдущий год.

4. По результатам заполнения пациентом опросника CAT подсчитывают суммарный балл.

5. Определяют риск прогрессирования бронхиальной обструкции. Для этого вычисляют значение функции (F) по формуле:

F = - 5,20318 + 0,89733 × rs11562975 + 0,05320 × ОФВ1б + 0,67048 × ЧО + 0,15464 × САТ, (1)

где rs11562975 – переменная, принимающая значение 1 при генотипе GC или CC по полиморфизму rs11562975 гена TRPM8, и 0 – при генотипе GG.

ОФВ1б – количественная переменная, отражающая постбронходилатационный объем форсированного выдоха за 1 секунду, выраженный в процентах от должного значения.

ЧО – переменная, принимающая значение 1 в случае наличия у пациента двух и более обострений за предыдущий год, 0 – в случае, если число обострений за предшествующий год менее двух.

САТ – количественная переменная, отражающая результат тестирования CAT, выраженный в баллах;

рассчитывают вероятность (P) прогрессирующей бронхиальной обструкции по формуле:

P = 1 / (1 + е^-F),

где e – основание натурального логарифма, равное 2,718,

F – значение, полученное вычислением по формуле (1).

Полученную вероятность сравнивают с граничным значением 0,71. При P ≥ 0,71 прогнозируют высокий риск прогрессирующей бронхиальной обструкции, а при P < 0,71 – низкий риск прогрессирования заболевания.

Валидность предложенных в способе критериев была доказана в ходе продольного исследования, выполненного на 134 больных ХОБЛ. Спустя год динамического наблюдения пациенты были разделены на две группы: в первую группу вошли больные со стабильным течением заболевания (75 человек), во вторую – пациенты с прогрессированием бронхиальной обструкции (59 человек). По данным спирометрии было выявлено, что в первой группе динамика ОФВ1б в течение года незначительная (55,0 [40,0;67,0] % и 56,1 [40,7;69,0] %), тогда как во второй группе ОФВ1б за год снизился с 45,3 [35,0;66,4] % до 36,1 [28,2;53,0] %. Средний возраст в группе с прогрессирующей бронхиальной обструкцией был выше, чем в первой (62,2±0,97 против 59,6±0,99, p=0,049). Среди данных пациентов преобладали лица с тяжёлой и крайне тяжёлой степенью заболевания (54,3% и 22,0% соответственно, χ2=11, p=0,004), у большинства (61%) обострения случались два и более раза в год (χ2=18,8, p<0,001). Кроме того, больные с прогрессирующей обструкцией характеризовались более высоким индексом курящего человека по сравнению с пациентами, имевшими стабильное течение ХОБЛ (40±2,3 против 33,6±1,5 пачка-лет, p=0,019).

Среди изученных полиморфизмов генов TRPM8 и TRPA1, только полиморфизм rs11562975 TRPM8 оказывал значимое влияние на риск прогрессирования бронхиальной обструкции при ХОБЛ. Среди больных с прогрессирующей обструкцией частота носительства генотипов GC и CC составляла 30,9%, что было выше, по сравнению с пациентами из группы с благоприятным течением заболевания (11,4%, p=0,02). Также, носители аллеля C (генотипы GC+CC) отличались более существенным снижением ОФВ1б в течение года, по сравнению с больными, имевшими генотип GG (-0,24[-0,42;-0,07] л против -0,04[-0,23;0,09] л, p=0,008). Разработанное уравнение имело достаточную классифицирующую способность (площадь под ROC-кривой 0,81 95%ДИ (0,72; 0,87), p<0,05) и прогностические характеристики (чувствительность - 76%, специфичность - 80%, точность - 75%).

Ниже приведены примеры использования предложенного способа:

Пример 1. Больной П., 63 г. Диагноз: Хроническая обструктивная болезнь легких, эмфизематозный тип, тяжелой степени тяжести, ремиссия. ДН I. ИК 55 п/л. Произведен забор крови для генетического анализа, в результате анализа выявлен генотип GC по полиморфизму rs11562975 гена TRPM8; при проведении спирографии ОФВ1б равен 42% (1,45л). За предшествующий год произошло 3 обострения ХОБЛ. Результат тестирования САТ – 28 баллов.

На основании разработанного способа прогнозирования прогрессирующей обструкции произведен расчет:

F= - 5,20318 + 0,89733 × rs11562975 + 0,05320 × ОФВ1б + 0,67048 × ЧО +

+ 0,15464 × САТ = - 5,20318 + 0,89733 × 1 + 0,05320 × 42 +

+ 0,67048 × 1 + 0,15464 × 28 = 1,391

P = 1 / (1 + е^-F) = 1 / (1 + 2,718^-1,391) = 0,801

Поскольку полученное значение P (0,801) больше 0,71, можно предположить наличие у пациента высокого риска прогрессирующей бронхиальной обструкции. При повторной спирометрии через 12 месяцев значение ОФВ1б составило 34,6% (1,18л). Таким образом, в течение года ОФВ1б уменьшился на 270мл, что значительно превышает порог в 50мл. Сделанный прогноз оказался верным.

Пример 2. Пациент Т., 64 г. Диагноз: Хроническая обструктивная болезнь легких, смешанный тип, тяжелой степени тяжести, ремиссия. ДН I. ИК 48п/л. В результате генотипирования по ОНП rs11562975 гена TRPM8 выявлено носительство СC генотипа; при проведении спирометрии ОФВ1б составил 30,3% (1,03 л). За последний год зафиксировано 4 обострения ХОБЛ. Результат тестирования САТ – 23 балла.

На основании разработанного способа прогнозирования прогрессирующей обструкции произведен расчет:

F = - 5,20318 + 0,89733 × rs11562975 + 0,05320 × ОФВ1б + 0,67048 × ЧО +

+ 0,15464 × САТ = - 5,20318 + 0,89733 × 1 + 0,05320 × 30,3 +

+ 0,67048 × 1 + 0,15464 × 23 = 1,793

P = 1 / (1 + е^-F) = 1 / (1 + 2,718^-1,793) = 0,857.

Вероятность Р (0,857) превышает 0,71, следовательно, у данного пациента высокий риск быстрого прогрессирования ХОБЛ. Спустя один год при повторном обследовании ОФВ1б 20,2% (0,68л). Объем форсированного выдоха за одну секунду в течение года уменьшился на 350мл. Таким образом, прогноз подтвердился.

Пример 3. Пациент Р., 70 л. Диагноз: Хроническая обструктивная болезнь легких, смешанный тип, тяжелой степени тяжести, ремиссия. ДН I. ИК 43 п/л. При генетическом обследовании выявлено носительство протективного GG генотипа по полиморфизму rs11562975 гена TRPM8; при проведении спирометрии ОФВ1б равен 40% (1,23 л). За предыдущий год одна госпитализация в стационар по поводу обострения ХОБЛ. Результат САТ – 24 балла.

На основании разработанного способа произведен расчет:

F = - 5,20318 + 0,89733 × rs11562975 + 0,05320 × ОФВ1б + 0,67048 × ЧО +

+ 0,15464 × САТ = - 5,20318 + 0,89733 × 0 + 0,05320 × 40 +

+ 0,67048 × 0 + 0,15464 × 24 = 0,356

P = 1 / (1 + е^-F) = 1 / (1 + 2,718^-0,356) = 0,588.

Расчетная вероятность Р (0,588) меньше 0,71, следовательно, у данного пациента прогнозируется стабильное течение ХОБЛ. Спустя 1 год при повторном обследовании ОФВ1б составил 38% (1,19 л). Таким образом, ОФВ1 в течение года уменьшился на 40 мл и быстрого прогрессирования бронхиальной обструкции не отмечается, что и было подтверждено предложенным способом.

Литература

1. Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Report 2022. www.goldcopd.com.

2. Johns D.P., Walters J.A., Walters E.H. Diagnosis and early detection of COPD using spirometry. Journal of Thoracic Disease. 2014. Vol. 6, №11. P. 1557-1569.

3. RU 2599349 C1, Макарова Е.В. и др. «Способ прогноза прогрессирования хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ)», 2015.05.28.

4. RU 2370773 C1, Калинина Е.П. и др. «Способ прогноза прогрессирования хронической обструктивной болезни легких», 2009.10.20.

5. Левкович Т.В., Пронько Т.П. Роль трансформирующего фактора роста β1 в генезе артериальной гипертензии и ее осложнений // Журнал ГРГМУ. 2021. Т. 19, №1. С. 19-22.

6. Изучение роли факторов роста фибробластов (bFGF, TGFbeta1), маркеров воспаления (IL-6, TNF-alpha, СRP) и конечных продуктов гликирования (AGE, RAGE) у пациентов с ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом 2 типа / Иванникова Е.В. и др. // Сахарный диабет. 2013. Т. 16, №3. С. 64-70.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования прогрессирующей бронхиальной обструкции у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). Генотипируют однонуклеотидный полиморфизм rs11562975 гена TRPM8. Измеряют постбронходилатационный объем форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1б). Определяют частоту обострений ХОБЛ в предшествующий год (ЧО). Выполняют тестирование по опроснику COPD Assessment Test (САТ). Вычисляют значение F по формуле (1): F = -5,20318 + 0,89733 × rs11562975 + 0,05320 × ОФВ1б + 0,67048 × ЧО + 0,15464 × САТ. Рассчитывают вероятность прогрессирующей бронхиальной обструкции по формуле: P = 1 / (1 + е^-F), где F – значение функции, вычисленное по формуле (1). При P≥0,71 прогнозируют высокий риск прогрессирующей бронхиальной обструкции. При P<0,71 прогнозируют низкий риск прогрессирования заболевания. Способ обеспечивает возможность прогнозирования прогрессирования бронхиальной обструкции у больных ХОБЛ в европейской популяции за счет использования оригинальной расчетной формулы, учитывающей данные генотипирования, значения ОФВ1б, частоту обострений и выраженность симптомов согласно тесту САТ. 3 пр.

Способ прогнозирования прогрессирующей бронхиальной обструкции у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), характеризующийся тем, что у пациента генотипируют однонуклеотидный полиморфизм rs11562975 гена TRPM8, измеряют постбронходилатационный объем форсированного выдоха за 1 секунду, определяют частоту обострений ХОБЛ в предшествующий год, выполняют тестирование по опроснику COPD Assessment Test (САТ), затем вычисляют значение F по формуле (1):

F = -5,20318 + 0,89733 × rs11562975 + 0,05320 × ОФВ1б + 0,67048 × ЧО + 0,15464 × САТ,

где rs11562975 – переменная, принимающая значение 1 при генотипе GC или CC по полиморфизму rs11562975 гена TRPM8, 0 – при генотипе GG; ОФВ1б – постбронходилатационный объем форсированного выдоха за 1 секунду, в % от должного значения; ЧО – переменная, принимающая значение 1 в случае наличия у пациента двух и более обострений за предыдущий год и 0 – в случае, если число обострений за предшествующий год менее двух; САТ – результат тестирования по опроснику CAT в баллах; затем рассчитывают вероятность (P) прогрессирующей бронхиальной обструкции по формуле:

P = 1 / (1 + е^-F),

где e – основание натурального логарифма, равное 2,718; F – значение функции, вычисленное по формуле (1); при P≥0,71 прогнозируют высокий риск прогрессирующей бронхиальной обструкции, а при P<0,71 – низкий риск прогрессирования заболевания.