СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА ФОРМИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ СРЕДИ КУРЯЩИХ ЛИЦ Российский патент 2022 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области медицины, а именно пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования риска формирования хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у курящих лиц.

Известен способ прогнозирования риска развития ХОБЛ [1], заключающийся в том, что определяют уровни активности α1-антитрипсина и α2-макроглобулина, и в случае, если значения активности данных ферментов выше граничных, прогнозируют низкий риск развития ХОБЛ. Основным недостатком данного способа является необходимость получения мокроты, что не всегда возможно. Способ не позволяет прогнозировать заболевание у лиц с небольшим стажем курения. Также в способе не описана ситуация, когда уровень одной антипротеиназы может оказаться выше, а другой - ниже граничного значения.

В качестве прототипа изобретения выбран способ прогнозирования ХОБЛ, основанный на генотипировании полиморфизмов rs9789398 или rs9789675 гена TRPM8 [2]. При этом, выявление генотипов TC и GA, соответственно, свидетельствует о повышенном риске наличия заболевания. К существенным недостаткам данного способа следует отнести то, что исследование с целью выявления генетических маркеров было проведено на китайской популяции Хань, распределение частот аллелей и генотипов в которой существенно отличается от такового у населения Европы. Так, частота минорного аллеля для обоих полиморфизмов в популяции Хань составляет около 20%, тогда как среди европейцев он практически не встречается (0,5%), что делает практическое применение указанного способа бессмысленным. Способ также страдает от недостатка точности, так как основан только на анализе генетических факторов и не учитывает возраст и индекс курения обследуемого, несмотря на то, что в контексте развития ХОБЛ TRPM8 рассматривается в качестве одного из рецепторов, чувствительных к компонентам сигаретного дыма - основного этиологического фактора заболевания. Кроме того, способ не предполагает количественной оценки риска ХОБЛ.

Задачей настоящего изобретения являлось создание способа, пригодного для прогнозирования риска формирования ХОБЛ у курящих лиц в европейской популяции и учитывающего индивидуальные генетические особенности обследуемых и анамнез курения.

Поставленная задача достигается тем, что оценку риска формирования ХОБЛ проводят на основании данных генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs2052030 гена катионных каналов TRPM8, при этом дополнительно учитывают возраст и индекс курения обследуемого.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Производят генотипирование полиморфизма rs2052030 гена TRPM8. Для этого выделяют геномную ДНК и с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществляют амплификацию целевого участка гена TRPM8, содержащего полиморфный сайт. Смесь для ПЦР должна включать: ДНК - 50 нг, буфер для ПЦР 1х, MgCl₂ - 2,5 мМ, дезоксинуклеозидтрифосфаты - 0,25 мМ, прямой праймер - 0,5 мкМ, обратный праймер - 0,02 мкМ, флуоресцентный зонд - 0,5 мкМ, Hot-Start Taq-полимераза - 1 ЕД, вода - до 25 мкл. Последовательность олигонуклеотидов, используемых в реакции: праймер прямой 5’-GGAGAGATTATCTTACTGAACAC-3’, обратный 5’-TCACTACTGCCCAGACAAAAGGAAAA-3’, зонд 5`-FAM-CGGCTCAAATACGACCACTGCCG-BHQ1-3’. Амплификацию проводят в следующем температурном режиме: первоначальная денатурация при 96°C/1,5 мин.; первые 25 циклов - денатурация при 96°C/1 сек., отжиг/элонгация при 62°C/15 сек.; последующие 45 циклов - денатурация при 96°C/1 сек., отжиг/элонгация при 58°C/15 сек.; финальная элонгация при 72°C/1 мин. Непосредственно после амплификации проводят анализ плавления олигонуклеотидного зонда, для этого выполняют предварительную денатурацию при 96°C/3 мин., гибридизацию при 30°C/3 мин., а затем увеличивают температуру от 30°C до 70°C с шагом 0,5°C/5 сек. Используя программное обеспечение амплификатора, на каждом шаге регистрируют уровень флуоресцентного сигнала на канале FAM. Получаемые при этом кривые плавления, отражающие зависимости производной уровня флуоресценции от времени, позволяют идентифицировать конкретные генотипы. Одиночные пики плавления на 60°C и 50°C соответствуют генотипам CC и GG, соответственно, а одновременное присутствие двух пиков - гетерозиготному генотипу CG.

2. Уточняют возраст обследуемого в годах.

3. Вычисляют индекс курения (ИК) по формуле: ИК = количество выкуриваемых сигарет в день × количество лет курения / 20.

4. Определяют риск формирования ХОБЛ. Для этого вычисляют значение функции F по формуле:

F = - 6,22738 + 0,3746 × ОНП + 0,10491 × ВОЗР + 0,03958 × ИК,

где ОНП - переменная, отражающая генотип по полиморфизму rs2052030 гена TRPM8 и принимающая значение 0 при генотипе CG и 1 - в случае генотипов CC или GG;

ВОЗР - переменная, отражающая возраст в годах;

ИК - переменная, отражающая индекс курения (пачка-лет);

рассчитывают вероятность (P) формирования ХОБЛ по формуле:

P = 1 / (1 + e-^F),

где e - основание натурального логарифма, равное 2,718;

F - значение, полученное вычислением по формуле, приведенной выше;

Полученную вероятность сравнивают с граничным значением 0,65. При P≥0,65 прогнозируют высокий риск формирования ХОБЛ, а при P<0,65 - низкий риск развития заболевания.

Валидность предложенных в способе критериев была доказана в ходе исследования, выполненного на 143 больных ХОБЛ и 104 курящих лицах, не имеющих признаков бронхиальной обструкции. Группа больных ХОБЛ значимо отличалась по возрасту (61,0 (56,0-66,0) лет против 43,5 (34,5-52,0) лет, p<0,001) и индексу курения (40,0 (26,0-45,0) пачка-лет против 15,0 (6,0-22,5) пачка-лет, p<0,001). Среди изученных полиморфизмов генов TRPM8 (rs7577262, rs10166942, rs11562975, rs2052030 и rs17865682) и TRPA1 (rs920829, rs7819749, rs4738202, rs959976, rs959974 и rs6996723), только полиморфизм rs2052030 гена TRPM8 оказывал значимое влияние на риск развития ХОБЛ. При анализе в сверхдоминантной модели гетерозиготный генотип чаще встречался среди лиц контрольной группы по сравнению с больными ХОБЛ (51,9% против 33,6%, ОШ 0,47 95%ДИ (0,28-0,79), p=0,004). Эффект полиморфизма сохранялся после коррекции на пол, возраст и индекс курения с помощью логистической регрессионной модели (p=0,03). Разработанное уравнение имело достаточную классифицирующую способность (площадь под ROC-кривой 0,88 (0,82-0,91), p<0,001) и прогностические характеристики (чувствительность - 78%, специфичность - 83%, точность - 80%).

Ниже приведены примеры использования предложенного способа:

Пример 1. Пациент М., 51 год. Первично обследован во время прохождения профилактического осмотра. Из анамнеза - курит с 20 лет по 10 сигарет в день. Показатели спирометрии в пределах нормы: ОФВ1 - 88,5%, ОФВ1/ФЖЕЛ - 72,1%. Произведен забор крови для генетического анализа, по результатам был выявлен генотип СС по полиморфизму rs2052030 гена TRPM8. Проведена беседа о необходимости отказа от курения.

При условии курения в том же объеме расчётная вероятность развития ХОБЛ через 5 лет составит:

Возраст через 5 лет = 51 + 5 = 56 лет.

Индекс курения через 5 лет = (56 - 20) × 10 / 20 = 18.

F = - 6,22738 + 0,3746 × ОНП + 0,10491 × ВОЗР + 0,03958 × ИК

= - 6,22738 + 0,3746 × 1 + 0,10491 × 56 + 0,03958 × 18 = 0,73462

P = 1 / (1 + e-^F) = 1 / (1 + 2,718-^0,73462) = 0,676

Поскольку полученное значение вероятности P превышает граничное значение (0,65), риск формирования ХОБЛ расценен как высокий.

Несмотря на рекомендации, в течение последующих 5 лет пациент не отказался от курения и не сократил число выкуриваемых сигарет в день. При повторном визите - жалобы на регулярный продуктивный кашель и одышку (степень I по шкале mMRC). По результатам спирометрического исследования выявлено снижение ОФВ1 до 68,8% и ОФВ1/ФЖЕЛ - до 62,3%. На фоне действия бронхолитика ОФВ1 - 87,9%, ОФВ1/ФЖЕЛ - 67,2%, что соответствует диагнозу ХОБЛ с вентиляционными нарушениями легкой степени (GOLD stage I). Таким образом, сделанный прогноз оказался верным.

Пример 2. Пациент П, 50 лет. Обратился с жалобами на длительный продуктивный кашель. Курит с 27 лет по 1,5 пачки сигарет в день (ИК=34,5). При генетическом исследовании выявлено носительство протективного гетерозиготного генотипа CG по полиморфизму rs2052030 гена TRPM8.

Расчётная вероятность наличия ХОБЛ на момент обращения:

F = - 6,22738 + 0,3746 × ОНП + 0,10491 × ВОЗР + 0,03958 × ИК

= - 6,22738 + 0,3746 × 0 + 0,10491 × 50 + 0,03958 × 34,5 = 0,38363

P = 1 / (1 + e-^F) = 1 / (1 + 2,718-^0,38363) = 0,595

Поскольку полученное значение вероятности P меньше 0,65, риск наличия ХОБЛ расценен как низкий.

При дальнейшем обследовании отклонений в показателях спирометрии не выявлено: ОФВ1 - 89%, ОФВ1/ФЖЕЛ - 87,5%. ХОБЛ не была подтверждена, выставлен диагноз «Хронический необструктивный бронхит». Таким образом, сделанный прогноз подтвердился.

Литература

1. RU 2359618 C1, Черногорюк Г.Э. и др. «Способ прогнозирования риска развития хронической обструктивной болезни легких у длительно курящих лиц», 2009.06.27.

2. TRPM8 genetic variations associated with COPD risk in the Chinese Han population / Xiong M. et al. // Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis. 2016. Vol. 11. P. 2563-2571.

Изобретение относится к области медицины, в частности к пульмонологии, и предназначено для прогнозирования риска формирования хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) среди курящих лиц. Генотипируют однонуклеотидный полиморфизм rs2052030 гена TRPM8, учитывают возраст, определяют индекс курения и вычисляют значение F по формуле: F = − 6,22738 + 0,3746 х ОНП + 0,10491 х ВОЗР + 0,03958 х ИК. Рассчитывают вероятность (P) формирования ХОБЛ по формуле: P = 1 / (1 + e^–F). При P≥0,65 прогнозируют высокий риск формирования ХОБЛ, а при P<0,65 – низкий риск развития заболевания. Изобретение обеспечивает создание способа, пригодного для прогнозирования риска формирования ХОБЛ у курящих лиц в европейской популяции и учитывающего индивидуальные генетические особенности обследуемых и анамнез курения. 2 пр.

Способ прогнозирования риска формирования хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) среди курящих лиц, отличающийся тем, что генотипируют однонуклеотидный полиморфизм rs2052030 гена TRPM8, учитывают возраст, определяют индекс курения и вычисляют значение F по формуле:

F = − 6,22738 + 0,3746 х ОНП + 0,10491 х ВОЗР + 0,03958 х ИК,

где ОНП – переменная, отражающая генотип по полиморфизму rs2052030 гена TRPM8 и принимающая значение 0 при генотипе CG и 1 в случае генотипов CC или GG; ВОЗР – переменная, отражающая возраст в годах; ИК – переменная, отражающая индекс курения (пачка-лет), рассчитываемый как количество выкуриваемых сигарет в день, умноженное на количество лет курения и деленное на 20; рассчитывают вероятность (P) формирования ХОБЛ по формуле:

P = 1 / (1 + e^–F),

где e – основание натурального логарифма, равное 2,718; F – значение, полученное вычислением по формуле, приведенной выше; при P≥0,65 прогнозируют высокий риск формирования ХОБЛ, а при P<0,65 – низкий риск развития заболевания.