СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/52 G01N33/68 

Изобретение относится к области биохимии и медицины и может быть использовано при диагностических исследованиях различных заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом.

Известен способ определения количества супероксиддисмутазы, основанный на ее способности тормозить аутоокисление адреналина в щелочной среде [Me Cord J. M., Fridovich I. / J. Biol. Chem. - 1969. - Vol. 244, N 22. - P. 6049-6055; Misra H. P., Fridovich 1. / J. Biol. Chem. - 1972. - Vol. 247, N 10. - P. 3170-3175], в котором аутоокисление адреналина, попадающего в щелочную среду, инициируется супероксидными радикалами, возникающими в результате внутримолекулярных перестроек адреналина в ходе его превращения через адреналинхинон в адренохром. Фермент супероксиддисмутазы, перехватывая супероксидные радикалы, ингибирует образование адренохрома. Измерение количества образующегося адренохрома проводят на спектрофотометре при длине волны 480 нм в 0,05 М карбонатном буфере, pH 10,1 или 10,2, при температуре 25 – 30 °C и концентрации адреналина от 200 до 600 мкМ.

Недостатки этого способа: невысокая скорость реакции; необходимость термостатирования образцов при 25-30°C и высокая стоимость необходимых реагентов ксантина и ксантиноксидазы.

Известен способ определения количества супероксиддисмутазы [Симонян М.А., Набалдян P.M. (Биохимия. - 1975. - Т. 40, вып. 4, с. 726-734], который основан на реакции аутоокислении адреналина в щелочной среде. Определение адренохрома проводят не применяя дополнительных источников генерации супероксида, однако, чтобы измерить достаточное количество образовавшегося адренохрома в реакционную среду вносят высокую концентрацию адреналина не менее 1 мМ. Измерение проводят на спектрофотометре при температуре 25°C, в 0,2 М карбонатном буфере, pH 10,2, используя длину волны 490 нм.

Недостатки способа: высокая концентрация адреналина в пробе, требуется сухой аттестованный коммерческий препарат адреналина.

Известен способ определения количества супероксиддисмутазы [Beauchamp C., Fridovich I. / Analytic. Biochem. - 1971. - Vol. 44. - P. 276-287; Nishikimi N., Rao N.A., Yagi K. / Bioch. Bioph. Res. Commun.- 1972.- Vol. 46, N 2.- Р. 849-854], основанный на определении скорости реакции связывания супероксиддисмутазы с реагентами из перечисленных: нитросиний тетрозолий, цитохром C, ксантин, ксантиноксидаза или феназинметасульфат. Определение проводят кинетическим способом по измеренной скорости реакции при термостатировании с температурой 25-30°C.

Недостатки способа: трудоемкость, невысокие скорости реакции, необходимость тщательного термостатирования образцов и высокая стоимость необходимых реагентов ксантина и ксантиноксидазы.

За прототип принят способ определения количества супероксиддисмутазы и сопутствующих химических соединений [RU 2144674 C1, МПК G01N 33/52 (2000.01), G01N 33/68 (2000.01), опубл.20.01.2000], по ее способности ингибировать реакцию аутоокисления адреналина в щелочной среде. Скорость реакции оценивают спектрофотометрически по величине оптической плотности продукта аутоокисления адреналина, образующегося в присутствии и отсутствии исследуемого препарата, имеющего поглощение при длине волны 347 нм (волновое число 28,8).

Для проведения определения 100 мкл 0,1% раствора адреналин гидрохлорида (готовая аптечная форма) добавляют в 2 мл 0.2 М карбонатного буфера для создания рН 10,65 затем вносят 10-100 мкл образца, содержащего супероксиддисмутазу. Смесь перемешивают при температуре 15-25 °С без термостатирования, помещают в спектрофотометр и измеряют величину оптической плотности в течение 3 мин при длине волны 347 нм относительно такой же смеси без адреналина.

Количество супероксиддисмутазы оценивают по степени замедления скорости ее реакции с адреналина гидрохлоридом относительно контрольной пробы.

Недостатком данного способа является суммарное определение супероксиддисмутазы и сопутствующих химических соединений (эритроциты, аминокислоты, антиоксиданты), что завышает результаты определения.

Техническим результатом предложенного изобретения является создание способа, позволяющего повысить достоверность количественного определения супероксиддисмутазы.

Предложенный способ определения супероксиддисмутазы, так же как в прототипе, включает оценку способности ингибировать скорость реакции аутоокисления адреналина гидрохлорида в щелочной среде с рH 10,65, которую оценивают спектрофотометрически при длине волны 347 нм в течение 3 минут по величине оптической плотности продукта аутоокисления адреналина, образующегося в присутствии и отсутствии супероксиддисмутазы.

Согласно изобретению для регистрации оптической плотности продукта аутоокисления адреналина используют полиметакрилатную матрицу с иммобилизованным в неё 0,1% адреналина гидрохлоридом.

Полиметакрилатную матрицу, состоящую из 95 % полиметилметакрилата и 5 % полиэтиленгликоля с молекулярной массой 400 (ПЭГ 400), в форме пластинки 4х6х1 мм опускают на 1 мин в раствор 0,1% адреналина гидрохлорида (готовая аптечная форма). После этого матрица готова к работе или может храниться без потери свойств не менее 6 месяцев.

Полиметакрилатная матрица экстрагирует в собственный объем супероксиддисмутазу из анализируемой пробы и препятствует проникновению других антиоксидантов и фоновых веществ в зону реакции. Таким образом, исключается влияние посторонних веществ образца на результат определения супероксиддисмутазы, следовательно, возрастает точность и достоверность определения.

Спектры поглощения полиметакрилатной матрицы с адреналина гидрохлоридом показывают, что супероксиддисмутаза проникает в объем матрицы, где реагирует с адреналина гидрохлоридом. Продукт этой реакции накапливается в матрице, что показывает (фиг. 1) появление поглощения при 347 нм, которое увеличивается во времени. Замедление и прекращение увеличения поглощения при 347 нм наблюдают после 3 мин реакции.

На фиг. 1 показано изменение спектра поглощения смеси раствора супероксиддисмутазы и адреналина гидрохлорида от времени. Накопление продукта реакции с поглощением при 347 нм.

На фиг. 2 представлена градуировочная зависимость концентрации супероксиддисмутазы от величины поглощения при 347 нм через 3 мин после начала анализа.

На фиг. 3 представлены градуировочные зависимости концентрации супероксиддисмутазы от величины поглощения при 347 нм через 3 мин после начала анализа в отсутствие и присутствие мешающих веществ, где кривая 1 – получена при использовании способа-прототипа в отсутствии мешающих веществ; 2 – получена при использовании предложенного способа в отсутствии мешающих веществ; 3 – получена при использовании предложенного способа в присутствии цистеина и аскорбиновой кислоты; 4 – получена при использовании предложенного способа в присутствии гемолизата эритроцитов крови; 5 – получена при использовании способа-прототипа в присутствии цистеина; 6 – построена при использовании способа-прототипа в присутствии аскорбиновой кислоты; 7 – построена при использовании способа-прототипа в пробе гемолизата эритроцитов крови.

В таблице 1 показана проверка правильности предложенного способа определения супероксиддисмутазы.

Пример 1.

Пробу 100 мкл водного раствора супероксиддисмутазы 1 мг/л внесли в пробирку объемом 10 мл, содержащую 5 мл 0,2 М карбонатного буфера с pH 10,65, затем в пробирку поместили пластинку полиметакрилатной матрицы с распределенным в ее объеме 0,1% адреналина гидрохлоридом при комнатной температуре без термостатирования. Пробирку встряхивали в течение 3 мин, затем извлекли пластинку полиметакрилатной матрицы и регистрировали ее спектр поглощения. Регистрацию проводили на спектрофотометре путем измерения величины оптической плотности при длине волны 347 нм относительно пробы без адреналина.

На фиг. 2 представлена градуировочная зависимость определения количества супероксиддисмутазы по величине поглощения при 347 нм продукта реакции аутоокисления адреналина в карбонатном буфере, pH 10,65.

Данные, представленные на фиг. 2, показывают, что количество супероксиддисмутазы в пробе пропорционально величине поглощения продукта реакции при длине волны 347 нм.

Пример 2.

Готовили четыре пробы, отличающиеся дополнительным присутствием биологических веществ.

Первую пробу 100 мкл водного раствора супероксиддисмутазы 1 мг/л внесли в пробирку объемом 10 мл, содержащую 5 мл 0,2 М карбонатного буфера с pH 10,65.

Вторую пробу 100 мкл водного раствора супероксиддисмутазы 1 мг/л и 100 мкл аскорбиновой кислоты с концентрацией 1 мг/л внесли в пробирку объемом 10 мл, содержащую 5 мл 0,2 М карбонатного буфера с pH 10,65.

Третью пробу 100 мкл водного раствора супероксиддисмутазы 1 мг/л и 100 мкл цистеина с концентрацией 1 мг/л внесли в пробирку объемом 10 мл, содержащую 5 мл 0,2 М карбонатного буфера с pH 10,65.

Четвертую пробу 100 мкл водного раствора супероксиддисмутазы 1 мг/л, 100 мкл цистеина с концентрацией 1 мг/л и 100 мкл аскорбиновой кислоты с концентрацией 1 мг/л внесли в пробирку объемом 10 мл, содержащую 5 мл 0,2 М карбонатного буфера с pH 10,65.

Затем в каждую пробирку помещали пластинку полиметакрилатной матрицы с распределенным в ее объеме 0,1 % адреналина гидрохлоридом при комнатной температуре без термостатирования. Пробирку встряхивали в течение 3 мин, затем извлекали пластинку полиметакрилатной матрицы и регистрировали ее спектр поглощения. Регистрацию проводили на спектрофотометре путем измерения величины оптической плотности при длине волны 347 нм относительно пробы без адреналина.

При использовании способа-прототипа в каждую пробирку добавляли 100 мкл 0,1% аптечного раствора препарата адреналина, тщательно и быстро перемешивали, помещали в спектрофотометр и измеряли величину оптической плотности при длине волны 347 нм в течение 3 мин.

На фиг. 3 представлены зависимости определения количества супероксиддисмутазы по величине поглощения при 347 нм продукта реакции аутоокисления адреналина в карбонатном буфере, pH 10,65 в присутствии мешающих веществ цистеина и аскорбиновой кислоты.

Предложенный способ с использованием полиметакрилатной матрицей с иммобилизованным в неё 0,1% адреналина гидрохлоридом, в отличие от прототипа, игнорирует присутствие мешающих веществ и позволяет определить количество супероксиддисмутазы, без завышенных результатов.

Пример 3.

Гемолизат эритроцитов, как источник супероксиддисмутазы получали общепринятым способом: брали 100 мкл крови из пальца пациента и помещали ее в 900 мкл 10% цитрата натрия; центрифугированием отделяли осадок эритроцитов, дважды промывали его 1 мл физиологического раствора, избегая грубых механических воздействий, и обрабатывали 0,3% раствором NaCl, содержащим 0,02% сапонина, в соотношении 1 объем взвеси эритроцитов и 2 объема раствора, в течение 15 мин при 4 °C.

Пробу 100 мкл водного раствора супероксиддисмутазы 1 мг/л и 100 мкл гемолизата эритроцитов внесли в пробирку объемом 10 мл, содержащую 5 мл 0,2 М карбонатного буфера с pH 10,65.

Затем в пробирку поместили пластинку полиметакрилатной матрицы с распределенным в ее объеме 0,1% адреналина гидрохлоридом при комнатной температуре без термостатирования. Пробирку встряхивали в течение 3 мин, затем извлекали пластинку полиметакрилатной матрицы и регистрировали ее спектр поглощения. Регистрацию проводили на спектрофотометре путем измерения величины оптической плотности при длине волны 347 нм относительно пробы без адреналина.

При использовании способа-прототипа в пробирку добавляли 100 мкл 0,1% аптечного раствора препарата адреналина, тщательно и быстро перемешивали, помещали в спектрофотометр и измеряли величину оптической плотности при длине волны 347 нм в течение 3 мин.

Результаты проверки правильности способа определения супероксиддисмутазы [Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Государственная система обеспечения единства измерений. Рекомендации по межгосударственной стандартизации. РМГ 61-2010. Введ. 2012-09-01. - М.: Стандартинформ, 2013. 59 с.] показали (таблица 1), что расчетные значения t-критерия не превышают критических значений критерия Стьюдента, что свидетельствует об отсутствии систематической погрешности при проведении анализа. Правильность предложенного способа является более высокой по сравнению с прототипом, за счет отсутствия погрешности, вносимой фоновыми веществами гемолизата эритроцитов, способными к ингибированию реакции аутоокисления адреналина.

Предлагаемый способ дает возможность определить количество супероксиддисмутазы в биологическом материале (гемолизат эритроцитов) по появляющемуся продукту его окисления. Для проведения реакции не требуется избавляться от влияния фоновых мешающих веществ, что позволяет повысить достоверность определения супероксиддисмутазы.

Изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к способу определения супероксиддисмутазы. Способ определения супероксиддисмутазы включает оценку способности ингибировать скорость реакции аутоокисления адреналина гидрохлорида в щелочной среде с рH 10,65, которую оценивают спектрофотометрически при длине волны 347 нм в течение 3 мин по величине оптической плотности продукта аутоокисления адреналина, образующегося в присутствии и отсутствие супероксиддисмутазы. Для регистрации оптической плотности продукта аутоокисления адреналина используют полиметакрилатную матрицу с иммобилизованным в неё 0,1% адреналина гидрохлоридом. Технический результат вышеописанного решения заключается в повышении достоверности определения супероксиддисмутазы. 3 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ определения супероксиддисмутазы, включающий оценку способности ингибировать скорость реакции аутоокисления адреналина гидрохлорида в щелочной среде с рH 10,65, которую оценивают спектрофотометрически при длине волны 347 нм в течение 3 мин по величине оптической плотности продукта аутоокисления адреналина, образующегося в присутствии и отсутствие супероксиддисмутазы, отличающийся тем, что для регистрации оптической плотности продукта аутоокисления адреналина используют полиметакрилатную матрицу с иммобилизованным в неё 0,1% адреналина гидрохлоридом.