Способ определения малонового диальдегида в биологическом материале Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

I

Изобретение относится к биохимии и медицине и может быть использовано .для количественного определения вторичного продукта перекисного окисления . полиненасыщенных жирнокислотных остатков липидов биологических образцов: тканевых препаратов, изолированных клеточных мембран, - как в иитактном состоянии,так и при изучении окисляв- мости липидов в процессе индукции модельного перекисного окисления (ПОЛ).

Цель изобретения - повышение точности способа за счет предотвращения образования дополнительных окрашенных соединений.

Способ осуществляется следующим образом.

Биологический материал фиксируется этанолом в конечной концентрации 70-90% по объему. К 1 мл зафиксированного образца (образцы ткани предварительно должны быть прогомогенизированы в этаноле и отцентрифугирова« ны) прибавляют 2 мл насыщенного раствора тиобарбитуровой кислоты (ТЕК) (около 0,5%) и нагревают 30 мин при . При этом конечная концентрация этанола составляет 25-32%. Полученные образцы охлаждают, центрифугируют или фильтруют для удаления денатурированного белка и определяют оптическую плотность при 532 нм относительно слепого образца или дистиллированной воды. Концентра1Д1ю малоно вого диальдегида (НДА) рассчитывают по коэффициенту молярной эк- стинкции окрашенного триметинового комплекса, равному 156000 . Пример 1.В суспензию мембран .саркоплазматического ретнкулума

а (;D

4

О)

скелетных мышц кролика или лягушки (1 мг/мл по белку) вносят FeSO и аскорбат в конечных концентрациях 10 и 200 мкМ соответственно. Через 1, 3, 6, 10, 20 и 30 мин по 0,1 мл образца вносят в пробирки с 90%-ным этанолом или 30%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ) 1 мл. Затем добавляк т по 2 мл 0,5%-ного водного раствора ТБК и нагревают 30 мин при . Охлажденные пробы центрифугируют м 5 мин при 3-5 тыс.§ и колориметриру- ют относительно пробы, взятой в нулевой момент времени. Осуществление определения МДА и тем и другим спосо- бом дает практически одинаковые величины прироста этого продукта ПОТ, од нако проведение цветной реакции в присутствии ТХУ приводит к образова- нию интенсивно окрашенного ТБК - производного сахарозы ( А45 нм присутствующей в стандартной среде хранения мембранных препаратов. В то же время указанный пик отсутствует, если в качестве фиксирующего

агента использовали этанол (определение проводили в присутствии 32%- ного этанола).

Пример 2. Аскорбат-зависи- мое ПОЛ мембран ретикулума проводили как в примере 1, за исключением того, что концентрация этанола при фиксации составляла 70%, в среде - 25%, а вместо раствора ТХУ использовали дистиллированную воду. Корректное определение МДА в водной среде возможно лишь в отсутствии ионов железа несмотря на то, что в обоих случаях не наблюдается взаи- модействия ТБК с сахарозой, вносимо в инкубационную среду вместе с фрагментами мембран.

to

20 , 9460

Пример 3. Аскорбат - зависимое ПОЛ осуществляли, как в примере 1. На 30 мин после индукции ПОЛ аликвоты суспензии мембран добавляли к водно-этанольной смеси с разным количеством спирта. После этого осуществляли анализ МДА. Оптимальная конечная концентрация этанола, необходимая для осуществления исследу- , емой цветной реакции, составляет 25- 30% по объему, при фиксации 70-90%.

Таким образом, предложенный способ определения малонового диальде- гида в биологическом материале обеспечивает по сравнению с известным существенное повышение селективности и точности определения МДА при полном сохранении чувствительности метода-прототипа. В качестве фиксирующего агента и компонента реакционной смеси используется нетоксичный и доступный реактив - этанол, полностью исключается применение агрессивных кислот - соляной и трихлоруксусной о

15

25

ормула изобретения

Способ определения малонового диальдегида в биологическом материале путем фиксации биопробы, обработки ее тиобарбитуровой кислотой при нагревании, центрифугирования и после- дцующего колориметрирования супернатан- та, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет предотвращения образования дополнительных окрашенных соединений, фиксацию пробы проводят 70-90%-ньм этиловым спиртом, а обработку тиобарбитуровой кислотой осуществляют в присутствии 25-32%- ного этилового спирта.

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано при исследовании процесса перекисного окисления липидов. Цель изобретения - повышение точности способа - достигается за счет предотвращения образования дополнительных окрашенных соединений в реакции с тиобарбитуровой кислотой. Исследуемую пробу фиксируют 70-90%-ным этиловым спиртом, затем обрабатывают тиобарбитуровой кислотой при концентрации этилового спирта 70- 90%, нагревают и спектрофотометри- чески определяют содержание малонового диальдегида по оптической плотности при 560 нм. Способ существенно повышает селективность и точность определения малонового диальдегида и исключает применение агрессивных кислот - соляной и трихлоруксусной. (Л с