Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae, используемый в качестве тест-культуры при детекции гена NDM методом полимеразной цепной реакции для точной диагностики и назначения антибактериальной терапии клебсиелёзных инфекций Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12R1/22 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается использования культуры Klebsiella pneumoniae 1970_kpn как референс-штамма при ПЦР диагностике на гены металло-р-лактамаз, NDM-подобные.

Ниши К. pneumoniae разделяют на окружающую среду, слизистые поверхности млекопитающих, медицинское оборудование и персонал. В небольших количествах присутствует в качестве сапрофита у человека, как нормальная флора ротовой полости, кожи и кишечника. Данный патоген занимает ведущую роль в этиологии широкого круга внебольничных и госпитальных инфекций человека, что представляет серьезную угрозу общественному здоровью. Вспышки классических клебсиелл, как правило, связаны с оказанием медико-санитарной помощи, длительной госпитализацией или антибиотериальной терапией. К. pneumoniae вызывает различные инфекции включая пневмонию, поражения желудочно-кишечного тракта, глаз, сепсис, инфекции мочевыводящих путей, бактериемию, менингит, абсцессы в печени, кожные инфекции, первичные абсцессы печени, поражают пациентов среднего и старшего возраста с ослабленным иммунитетом.

Самая большая проблема классических К. pneumoniae - это устойчивость к карбапенемам. В 2013 г. центр по контролю и профилактике заболеваний опубликовал перечень приоритетных патогенных микроорганизмов, представляющих непосредственную угрозу здоровью населения, включая Enterobacteriaceae устойчивые к карбапенемам, являющимся на сегодняшний день «последней линией защиты» при лечении наиболее тяжелых инфекций [1]. В 2019 году они продолжили акцентировать на этом внимание [1, 2]. Параллельно с этим в 2014 году ВОЗ заявила о том, что устойчивые к карбапенемам К. pneumoniae появились во всех ее регионах, при этом распространенность некоторых из них превышает 50% [4]. В 2017 году ВОЗ также подтвердила распространяющуюся угрозу карбапенем-устойчивых Enterobacteriaceae, а также некоторых других патогенов с критически высоким уровнем приоритетности разработки новых антибиотиков [5].

NDM относится к металло-β-лактамазам класса В по Амберу. Первый ее вариант был впервые описан в Швеции в 2009 году, у пациента, совершившего путешествие Индию, где он приобрел инфекцию мочевыводящих путей, вызванную устойчивым к карбапенемам Klebsiella pneumoniae. С этого момента продуценты NDM начали возникать в большинстве регионов мира. С тех пор было идентифицировано более 40 вариантов карбапенемазы NDM-типа. Металло-β-лактамазы нечувствительны к клинически доступным ингибиторам, что ограничивает терапевтические возможности. Механизм устойчивости к антибиотикам заключается в том, что два иона цинка, присутствующие в активном центре металло-β-лактамаз, вызывают гидролиз амидной связи в β-лактамном кольце, инактивируя антибиотик.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Однако, известна работа, в которой авторы обнаружили ген металло-β-лактамазы NDM-29 в кишечной палочке, выделенной из желчи пациента в 2019 году в Китае. Выяснилось, что область, несущая blaNDM-29, расположена на транспозоне, что указывает на риск распространения резистентности, вызванной NDM-29. Эксперименты по трансформации не показали никакой разницы в чувствительности штамма к антибиотикам по сравнению с трансформантом, содержащим плазмиду с локализованным вариантом гена NDM-1. Также подтвердили, что присутствие гена NDM-29 не увеличивает стоимость биологическую цену сопротивления бактерий [7]. Однако в данном исследовании Нью-Дели металло-Р-лактамаза была обнаружена в штамме Escherichia coli, что не позволяет охарактеризовать механизмы распространения данного типа карбапенемазы среди возбудителей клебсиелезных инфекций.

В другой работе авторы описали клоны «высокого риска», несущие гибридные плазмиды устойчивости/вирулентности, обнаруженные в Великобритании. В частности, они идентифицировали двенадцать изолятов, относящихся к различным клональным линиям, несущих гены карбапенемаз и проявляющих устойчивость практически ко всем протестированным антибиотикам. Плазмиды вирулентности трех представителей ST383 несли bla_NDM-5 и семнадцать других генов устойчивости. Отмечают общую область устойчивости к антибиотикам в плазмидах вирулентности/резистентности изолятов ST 383 и ST48, что говорит о рекомбинации опосредованной мобильными элементами [6]. Однако в данной работе не оценена копийность гена NDM, что необходимо для анализа чувствительности ПЦР.

В исследовании научной группы из Италии авторы собрали геномы 117 штаммов К. pneumoniae с широкой лекарственной устойчивостью, продуцирующих NDM, в течение 20 месяцев от 76 пациентов в нескольких медицинских учреждениях на юго-востоке Тосканы. Все изоляты принадлежали к клону ST-147 высокого риска и, как правило, были нечувствительны ко всем антибиотикам первой линии. В этом исследовании наблюдались признаки селективного прессинга, основанного на генах, связанных с лекарственной устойчивостью. Авторы отметили появление вариантов, связанных с устойчивостью либо к тигециклину, либо к колистину, которые являются почти единственными эффективными методами лечения, помимо комбинаций антибиотиков [3]. Ограничением данной работы является отсутствие данных о копийности гена Нью-Дели металло-β-лактамазы необходимой для анализа аналитической чувствительности ПЦР-диагностики.

Задачей изобретения является получение тест-культуры, используемой при детекции гена NDM методом полимеразной цепной реакции.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении штамма Klebsiella pneumoniae, продуцирующего Нью-Дели металло-β-лактамазу и характеризуемого множественной резистентностью к антибиотикам.

Указанный результат достигается путем выделения штамма Klebsiella pneumoniae 1970_kpg, несущего плазмиду резистентности с локализованным впервые обнаруженным вариантом гена NDM-29.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Штамм Klebsiella pneumoniae 1970-kpn выделен в апреле 2018 г. из образца мочи пациента в Национальном медицинском исследовательском центре онкологии им. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург. Штамм был депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером В-9981.

Родовое название Klebsiella - мелкие грамотрицательные коккобациллы, размером 1-2 μm × 0.5-0.8 μm спор не образуют, неподвижны, способны к образованию капсулы, располагаются одиночно, попарно и скоплениями, легко окрашиваются анилиновыми красителями. Хемоорганогетеротроф, факультативный анаэроб. Оксидаза отрицательные, каталаза положительные. Под действием антибиотиков могут образовывать L - формы.

Род Klebsiella на сегодняшний день насчитывает 14 видов, в число которых входит Klebsiella pneumoniae (Schroeter, 1886).

Культивируется на простых питательных средах при 37°С. На плотных питательных средах образует блестящие, выпуклые, слизистые колонии, на жидких средах вызывает диффузное помутнение, пленку, пристеночное кольцо. На средах Эндо и Плоскирева образуют красные колонии с металлическим блеском (лактоза положительные). На кровяном агаре колонии K. pneumoniae не проявляют гемолиз. Температурный диапазон 12-43°С, оптимум рН 7,2.

В природе он встречается в почве, около 30% штаммов могут фиксировать азот в анаэробных условиях. K. pneumoniae способна метаболизировать глицерин как единственный источник углерода. Они ферментируют сахара, такие как глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, с образованием кислоты и газа. К. pneumoniae уреазо-положительны, индол-отрицательны, отрицательны в тесте с метиловым красным, цитрат-положительны и дают положительную реакцию Фогеса-Проскауэра.

Существует два типа антигенных структур: капсульный (К) антиген подразделяющиеся на 80 серотипов и липополисахаридный соматический (О) антиген, подразделяющиеся на 8 различных серотипов. Штамм К. pneumoniae 1970_kpn к KL20, 02vl. Вирулентность на септической модели мышей LD₅₀=10⁴. Копийность гена NDM составила 202 копии в мкл.

Для таксономической идентификации штамма использовалась MALDI-TOF масс-спектрометрия, а также полногеномное секвенирование с применением гибридного подхода, включающего секвенирование на платформах Illumina MiSeq и Oxford Nanopore.

Генетические характеристики:

Хромосома содержит следующие гены вирулентности: entABES, fepBCDG, ecpABCDER, fimABCEH, kdsA, silA. Штамм также содержит 3 плазмиды различных типов несовместимости. Плазмида IncFIB/IncHIl В несет следующие гены резистентности: sul2, armA, msr(E), mph(E), qnrSl, aph(3')-VI, blaNDM-29, dfrA5, sull; и вирулентности iutA, iucABCD, prmpA, prmpA2, pegl344, cobW, luxR pagO, ydjA, shiF. Плазмида IncFIB несет ген резистентности к триметоприму (dfrA5). Плазмида IncR несет следующие гены резистентности blaTEM-1А, blaOXA-9, aadA, aac(6')-Ib.

Условия хранения: лиофильно высушенная культура при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 60% в течение 2 лет. После хранения культура образует однотипные колонии.

Пример 1.

Проводили эксперименты по детекции Нью-Дели металло-β-лактамазы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени у 563 клинических штаммов К. pneumoniae, выделенных в 2019-2022 годах от реанимационных больных и демонстрирующих множественную резистентность к антибиотикам.

Геномную бактериальную ДНК выделяли с использованием набора «ДНК-Сорб-Б» (AmpliSens, Россия) в соответствии с протоколом производителя. ПЦР для выявления генов карбапенемаз в режиме реального времени проводили с помощью прибора CFX96 Touch (Bio-Rad, США). Праймеры и зонды для генов, кодирующих карбапенемазу NDM типа, с длинной продуктов амплификации и их температурой плавления представлены в таблице 1. Праймеры были синтезированы в «Евроген» (Россия), зонды - в «Синтол» (Россия). Гены NDM регистрирует канал флуорофора Су5 (красный).

Реакция проводилась с использованием Dream Taq Hot Start PCR Master Mix в соответствии с рекомендациями производителя. Температурный, в соответствии с температурой отжига праймеров и зондов, и компонентный протокол представлены в таблицах 2 и 3 соответственно.

Штамм К. pneumoniae 1970_крп под регистрационным номером ГКПМ-Оболенск В-9981 использовался в качестве референс-штамма и давал характерную кривую амплификации, тем самым подтверждая правильность работы детекционной смеси и мастермикса. Экспериментально установлено, что продуценты NDM составили 5,5% (n=31) от общей выборки.

Пример 2.

Проводили эксперименты по детекции Нью-Дели металло-β-лактамазы методом мультиплекс ПЦР в режиме реального времени с помощью коммерческого набора Amply Sens у 117 клинических штаммов К. pneumoniae, выделенных из 19 медицинских учреждений стационарного типа в течение 2017 г. из разнообразного клинического материала, полученного от реанимационных больных.

Выделения бактериальной ДНК проводилось с помощью набора ДНК-сорб В (Интерлабсервис, Россия) в соответствии с инструкциями производителя. Гены клинически значимых металло-β-лактамаз детектировали методом реал-тайм ПЦР с помощью набора AmplySens®MDR MBL-FL (bla_VIM, bl_IMP, bla_NDM).

Процесс начинался с приготовления смеси ПЦР-смеси-2-FRT (300 мкл) с полимеразой TaqF (30 мкл). Содержимое повторно перемешивалось с добавлением ПЦР-смеси-1-FRT (1200 мкл). Расчет проводился в соответствии со соотношением ДНК к ПЦР-смеси на 1 реакцию: 15 мкл ПЦР-смеси к 10 мкл ДНК. Далее реактивы вносились в соответствии с таблицей 4.

Детекция флуоресцентного сигнала проводилась с помощью установки Real-Time PCR Detection System с запрограммированными температурным протоколом, указанным в таблице 5.

Детекция проводилась по четырем каналам:

- по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагментов генов МБЛ группы VIM;

- по каналу для флуорофора JOE регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагментов генов МБЛ группы IMP;

- по каналу для флуорофора ROX регистрировался сигнал, констатировавший накопление продукта амплификации ДНК внутреннего контроля;

- по каналу для флуорофора Су5 регистрировался сигнал, констатировавший накопление продукта амплификации фрагментов генов МБЛ группы NDM.

Графическое отображение результатов ПЦР проиходило с помощью CFX96 Maestro Analysis Software.

Штамм К. pneumoniae 1970_kpn под регистрационным номером ГКПМ-Оболенск В-9981 использовался в качестве референс-штамма и давал характерную кривую амплификации, тем самым подтверждая правильность работы детекционной смеси. Экспериментально установлено, что продуценты NDM составили 43,6% (n=51) от общей выборки.

Может быть использован для отбора антибактериальных средств, пригодных для эффективной борьбы с внутрибольничными штаммами K. pneumoniae. Изобретение позволяет повысить эффективность в борьбе с нозокомиальными клебсиелезными инфекциями.

Может быть использован в качестве тест-культуры для мониторинга распространения продуцентов карбапенемаз NDM типа в Российской Федерации у выделяемых в госпитальной и внегоспитальной среде клебсиелл.

Литература

1. ANTIBIOTIC RESISTANCE THREATS in the United States [Web Page]. - CDC, 2013. - Available online: https://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf.

2. CDC. ANTIBIOTIC RESISTANCE THREATS IN THE UNITED STATES / CDC // -2019. - -.

3. Martin, M.J.; Corey, B.W.; Sannio, F.; Hall, L.R.; MacDonald, U.; Jones, B.T.; Mills, E.G.; Harless, C; Stam, J.; Maybank, R.; et al. Anatomy of an extensively drug-resistant Klebsiella pneumoniae outbreak in Tuscany, Italy / Martin, M.J.; Corey, B.W.; Sannio, F.; Hall, L.R.; MacDonald, U.; Jones, B.T.; Mills, E.G.; Harless, C; Stam, J.; Maybank, R.; et al. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2021. - 118. -.

4. Organization, W.H. ANTIMICROBIAL RESISTANCE Global Report on Surveillance / Organization, W.H. // - 2014.- -.

5. Organization, W.H. Critically high priority for developing new antibiotics / Organization, W.H. // - 2017. - -.

6. Turton, J.; Davies, F.; Turton, J.; Perry, C; Payne, Z.; Pike, R. Hybrid Resistance and Virulence Plasmids in "High-Risk" Clones of Klebsiella pneumoniae, Including Those Carrying blaNDM-5 / Turton, J.; Davies, F.; Turton, J.; Perry, C; Payne, Z.; Pike, R. // Microorganisms. -2019. - 7. -.

7. Zhu, Y.; Jia, X.; Jia, P.; Li, X.; Yang, Q. Genetic and Phenotypic Characterization of the Novel Metallo-beta-Lactamase NDM-29 From Escherichia coli / Zhu, Y.; Jia, X.; Jia, P.; Li, X.; Yang, Q. // Front Microbiol. - 2021. - 12. - 743981.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии. Штамм бактерий Кlebsiella pneumoniae 1970_kpn, продуцирующий Нью-Дели металло-β-лактамазу и обладающий множественной резистентностью к антибиотикам, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером В-9981. Изобретение обеспечивает расширение арсенала референс-штаммов при мониторинге распространения продуцентов карбапенемаз NDM типа и может быть использовано при выявлении клебсиелёзных инфекций для корректировки терапии. 5 табл., 2 пр.

Штамм Klebsiella pneumoniae 1970_kpn, использующийся как референс-штамм при ПЦР диагностике на гены NDM-подобных металло-β-лактамаз для корректировки терапии при выявлении клебсиелезных инфекций, депонированный в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером В-9981.