Штаммы Staphylococcus aureus (MSSA), характеризующиеся mec-независимыми механизмами устойчивости к бета-лактамам и используемые в качестве контрольных тест-культур для определения чувствительности к бета-лактамным антибиотикам Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12R1/445 

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Устойчивость к бета-лактамам у стафилококков не синтезом бета-лактамазы или наличием mec-генов. За последние десятилетия описаны mec-независимые пути устойчивости, к числу которых относят мутации в пенициллинсвязывающих белках (ПСБ), мутации в их генетическом окружении, специфический ответ на стресс, изменение метаболизма внутриклеточных вторичных мессенджеров - циклического ди-аденозинмонофосфата (c-di-AMP). В этой связи выявление таких механизмов устойчивости является актуальной научно-практической задачей. Фенотипическая оценка чувствительности должна осуществляться при наличие контрольных штаммов с верифицированными механизмами устойчивости.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Устойчивость к бета-лактамам у стафилококков не ограничивается только двумя механизмами: синтез бета-лактамазы и наличие mec-генов, за последние десятилетия описаны mec-независимые пути устойчивости у S. aureus. К их числу можно отнести: мутации в ПСБ, мутации в их генетическом окружении, ответ на стресс и изменение метаболизма, изменение метаболизма внутриклеточных вторичных мессенджеров - циклического ди-аденозинмонофосфата (c-di-AMP). Фенотипы BORSA (Borderline oxacillin-resistant S. aureus) характеризуются повышением МПК к пенициллиназа-стабильным бета-лактамам (метициллин, оксациллин, цефазолин) в пределах 2-16 мкг/мл при отсутствии mec-генов. Один из первых описанных механизмов, ассоциированных с BORSA - это гиперпродукция пенициллиназы РС1 [1]. Такой тип BORSA дифференцируется от MRSA (Methicillin-resistant S. aureus) чувствительностью к бета-лактамам при добавлении ингибитора (например, клавуланата). Modified S. aureus (MODSA) - фенотипы характеризующиеся устойчивостью к пенициллиназа-стабильным бета-лактамам вне зависимости от присутствия ингибиторов. Такая устойчивость связана с мутациями в разных пенициллинсвязывающих белках (ПСБ), и в частности, в ПСБ4 (pbp4) или его промоторе. Чаще всего описываются BORSA с гиперпродукцией пенициллиназы, но встречаются также и BORSA с различными аллельными вариантами blaZ, проявляющих повышенную гидролитическую активность в отношении бета-лактамных антибиотиков [2, 3].

Проведенный патентный поиск показал, что отсутствуют аналоги штаммов с mec-независимыми механизмами устойчивости к бета-лактамным антибиотикам для целей определения чувствительности или как модельных микроорганизмов для поиска мишеней для разработки новых антибиотиков. Однако, необходимо отметить, что в работах по селекции in vitro, проведенных раннее, были получены мутанты MSSA, проявляющие устойчивость к бета-лактамам. В большой экспериментальной работе Giulieri et al. [4] были получены в ходе моделирования лабораторной эволюции, различные мутанты MSSA, проявляющие устойчивость к бета-лактамным антибиотикам. В работе проведены полногеномное секвенирование, а также подходы экспериментальной микробиологии. Основными маркерами устойчивости оказались мутации в gdpP и pbp4, а также в некоторых ПСБ. Основным отличием предлагаемого изобретения от рассматриваемой работы является сочетание уникальных генетических событий, затрагивающих не только мутации в гене gdpP, но и ПСБ, тейхоевых кислот.Во-вторых, в работе Giulieri et al. [4] не рассматриваются вопросы устойчивости к цефтаролину.

В исследовании [5] у 38 штаммов с МПК оксациллина от 1 до 8 мг/л и относящихся к разным генетическим линиям, были обнаружены мутации в транспептидазном домене гена pbp2. Трансформация ДНК полностью чувствительного штамма с помощью pbp2 из донора устойчивого штамма, приводила к увеличению МПК оксациллина с 0,25 до 4 мг/л. Важным недостатком данной работы является отсутствие данных полногеномного секвенирования, возможно влияние и других факторов на увеличение устойчивости к бета-лактамам. Геномы штаммов ОХА 45 и ОХА68 секвенированы, охарактеризованы все генетические события.

Используя полногеномное секвенирование, в своем исследовании Ва et al. [6] изучили 4 mecA-отрицательньгх изолята S. aureus с МПК оксациллина от 2 до 4 мкг/мл у которых выявлены точечные мутации в pbp1, pbp2 и pbp3; однако влияние этих мутации не оценивались методом мутагенеза, а также не было проведено экспериментов по лабораторной эволюции устойчивости к бета-лактамам.

Уникальность штамма ОХА 68 заключается в том, что он получен при селекции на карбапенемном антибиотике - меропенеме и характеризуется уникальным сочетанием мутаций, в частности в ПСБ1, ПСБ2 и gdpP. В работе Speck et al. [7] было показано, что после воздействия гипохлорита натрия на полностью чувствительный к бета-лактамам референс штамм АТСС29213, был получен BORSA фенотип с мутациями в gdpP. Данная работа свидетельствует о том, что разные химические субстраты могут провоцировать устойчивость к антибиотикам бета-лактамового ряда посредством мутаций в gdpP.

Задачей изобретения является получение метициллинчувствительных штаммов S. aureus (MSSA) с различными мутациями в геноме, опосредующих mec-независимую устойчивость к бета-лактамам для использования в качестве контрольных тест-культур в методах определения чувствительности к антибиотикам.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении штаммов S. aureus с mec-независимыми механизмами устойчивости к бета-лактамным антибиотикам.

Указанный результат достигается путем in vitro селекции штаммов на возрастающих концентрациях разных бета-лактамных антибиотиков в среде до достижения высокого уровня стабильной устойчивости. Оценка устойчивости осуществляется методом серийных разведений в бульоне с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК). Верификация геномных изменений осуществляется посредством полногеномного секвенирования устойчивых штаммов, полученных после селекции.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Происхождение штаммов и селекция устойчивости in vitro

Изолят SA0707 (генотип ST8 - t024) был выбран для селекции, относился к MSSA и выделен от носителя в 1964 году, то есть задолго до внедрения в клиническую практику антибиотиков, к которым к которым проводилась селекция (цефтаролин и меропенем). Изолят проявлял устойчивость к пенициллину и нес ген blaZ. Была использована следующая схема селекции: пассирование штаммов при ступенчатом увеличении концентрации антибиотиков на сердечно-мозговом агаре (Био-Рад, США). Всего было проведено 30 пассажей на двух антибиотиках, соответственно штамм ОХА 45 получен при селекции на цефтаролине, штамм ОХА 68 при селекции на меропенеме. В процессе селекции проводились фенотипические исследования и геномное секвенирование. Для обоих штаммов удалось получить повышение МПК в десятки раз, так МПК оксациллина с 0,25 поднялась до 128-256 мкг/мл. МПК цефтаролина с 0,125 мкг/мл поднялась до 16-32 мкг/мл. В первых нескольких посевах культуры были морфологически очень гетерогенны, видимый рост удавалось получить через 72-96 часов. Также отмечалась неодинаковая скорость роста изолятов на среде с различной концентрацией антибиотиков. К 30 пересеву оба штамма пересевались на концентрации 256 мкг/мл. На первом этапе суспензии изолятов (10⁹ КОЕ/мл) наносили сплошным газоном на чашки с двукратными разведениями каждого антибиотика от 1 до 4-кратной МПК и инкубировали при 37°С в течение 72 часов. Для следующего пассажа использовали колонии с чашек с наибольшей концентрацией каждого антибиотика. Если колонии появлялись более чем через 18 часов после инокуляции, суспензию клеток переносили на новые чашки, содержащие тот же диапазон концентраций антибиотика, что и в предыдущем пассаже. Однако если время появления колоний составляло менее 18 часов, диапазон концентраций антибиотика удваивался. Измерения МПК, популяционный анализ и полногеномное секвенирование проводили перед селекцией, после 5, 15 и 30 пассажей с антибиотиками и после 10 пассажей на среде без антибиотиков (проверка стабильности приобретенной устойчивости).

Верификация механизмов резистентности

Механизмы устойчивости верифицированы методами полногеномного секвенирования. Проведен анализ всех мутационных событий, за мутационное событие принимали изменение нуклеотидной последовательности, приводящее к появлению миссенс- или нонсенс-мутаций, делеций, инсерций. Синонимичные мутации не анализировались. Предварительно для всех полученных ридов было проведено удаление адаптерных последовательностей, и фильтрация низкокачественных прочтений с использованием программ FastQC, trimmomatic. Геномы исходных штаммов (до селекции) были собраны de novo, с использованием SPAdes. Выравнивание на референс-геном осуществлялось с помощью программ: bowtie2 2.2.6, Пакет R 3.4.4 и breseq 0.33.1. Алгоритм анализа включал следующие этапы. На полученные сборки исходных геномов выравнивали риды этих же геномов, при этом все выявленные мутации и нуклеотидные гетеро - позиции отмечались как «ложные» и исключались из дальнейшего анализа при сравнении с мутантами, для предотвращения интерпретации ложноположительных мутаций. Помимо этого, из анализа были исключены все мобильные генетические элементы, профаговые области, адгезины, поверхностные белки вирулентности и протяженные нуклеотидные гомополимерные области, вследствие высокой скорости накопления неспецифических мутаций в этих локусах. Для выявления генетических изменений, риды штаммов после 5, 20 и 40 пассажей, выравнивали на контиги контрольных геномов. Проводили аннотацию генетических изменений с помощью программы breseq в режиме mixed allele model. Коррекцию аннотаций, а также оценку гипотетических белков проводили с помощью NCBI protein BLAST и UniProt при этом использовали референс - геном S. aureus COL (GenBank: СР000046.1). Для детальной подтверждающей оценки гетеро-мутаций использовали визуальную оценку данных bam -файлов в программе Unipro Ugene.

Фенотипические характеристики

Штамм S. aureus ОХА 45 - МПК цефтаролина 128 мкг/мл, при 10 пересевах на средах без антибиотиков МПК не изменяется. Устойчивость к бета-лактамам: оксациллину, аминопенициллинам (и в комбинации с ингибиторами), меропенему. Может проявлять ложную чувствительность к цефокситину при использовании диско-диффузионного метода. Сохраняет высокий уровень чувствительности к гликопептидам, липопептидам, липогликопептидам, оксазолидинонам, рифампицину, тетрациклину, тигециклину, триметоприму/сульфаметоксазолу, фузидиевой кислоте и мупироцину. Индуцибельная устойчивость к клиндамицину (наличие гена ermA). Скорость роста незначительно снижена по сравнению с оригинальным штаммом (время деления клеток на среде с сердечно-мозговой вытяжкой составляет 38±4 минуты, lag - период составляет 168-178 минуты, относительная скорость роста составляет 0,017 μ^-мин).

Штамм S. aureus ОХА 68 - МПК меропенема составляет 4 мкг/мл, при 10 пересевах на средах без антибиотиков МПК не изменяется. Устойчивость к бета-лактамам: оксациллину, аминопенициллинам (и в комбинации с ингибиторами), меропенему, цефокситину, цефтаролину. Чувствительность к другим антибиотикам аналогична штамму ОХА 45. Скорость роста незначительно снижена по сравнению с оригинальным штаммом.

Генотипические характеристики: Штамм S. aureus ОХА 45. Генотип ST8-t024. Размер хромосомы 2,7Mb, плазмидные элементы общей протяженностью не более 30 Kb, GC состав - 32,7%. Мутации в промоторной области пенициллинсвязывающего белка pbp4 (90 пн делеция, и мутации в самом гене - T552I, А416Т), генах биосинтеза клеточной стенки (Таблица 1) являются основными маркерами устойчивости к бета-лактамам. Дополнительно выявлены мутации в системах биосинтеза тейхоевых кислот (гены tagA, tagO, DltA, SgtB).

Штамм S. aureus ОХА 68. Генотип ST8-t024. Размер хромосомы 2,7Mb, GC состав - 32,7%. Делетирована плазмида, несущая бета-лактамазу blaZ. Мутации в пенициллинсвязывающих белках (pbp1, pbp2), гене метаболизма c-di-AMP gdpP (Таблица), являются основными маркерами устойчивости к меропенему, бета-лактамам. В Таблице 2 представлены основные выявленные мутации.

Условия хранения штаммов

Условия хранения: лиофильно высушенная культура при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 60% в течение 2 лет.После хранения культура образует однотипные колонии.

После селекции и верификации механизмов резистентности штаммы были депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) с присвоением следующих регистрационных номеров. Штамм Staphylococcus aureus ОХА 45 депонирован под регистрационным номером В-9986, штамм Staphylococcus aureus ОХА 68 депонирован под номером В-9987.

Примеры использования в качестве контрольных штаммов при постановке чувствительности к антибиотикам.

Пример 1

Антибиотикочувствительность оценивали методом серийных микроразведений с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) в бульоне Cation- Adjusted Mueller Hinton (САМИ) II Broth («Becton Dickinson», США) в соответствие с протоколами CLSI от 2021 и EUCAST (версия 2021). Была использована субстанция оксациллина («Molekula», Англия). Постановку опыта проводил в 96 луночных планшетах (НПО «Медполимер», Санкт-Петербург). В качестве контрольной культуры были использованы S. aureus АТСС 29213 (чувствительный штамм) и S. aureus ОХА 45, S. aureus ОХА 68. Контроли использовались в каждой серии постановок, и в общей сложности было проведено не менее 10 измерений на каждый контрольный штамм. Постановка серийных разведений осуществлялась в соответствие с ISO 20776-1-2010. При обработке данных на платформе WHONET ver 5.6. рассчитывали следующие параметры: распределение и диапазон МПК, МПК50, МПК90, средняя геометрическая МПК (МПК_СГ), количество и процент чувствительных изолятов (S), устойчивых (R), с промежуточной чувствительностью (I). В качестве тестовых изолятов были выбраны клинические изоляты MRSA (n=15), клинические изоляты MSSA (15) из коллекции бактериальных культур ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России. В Таблице 3 Представлены результаты исследования.

Таким образом, штаммы ОХА 45 и ОХА 68 характеризуются стабильной устойчивостью к оксациллину и могут быть использованы в качестве контрольных при оценке чувствительности к бета-лактамным антибиотикам методом серийных разведений.

Пример 2

Постановка градиентных диффузионных тестов. В работу были включены 10 клинических изолятов MSSA. Штаммы ОХА 45 и ОХА 68 использовались как контрольные (контроль резистентности) в 10 повторениях. Использование градиентных диффузионных тестов с цефокситином, оксациллином (bioMérieux, Франция), цефтаролином (92049 Ceftaroline СРТ 0.016-256.0, Liofilchem®, USA) было осуществлено в соответствие с инструкцией производителей. Полоски градиентных диффузионных тестов состоит из стандартного градиента концентрации антибиотика, который используется для определения МПК (мкг/мл). Использовали агар Мюллера-Хинтона (БиоРад, США). Постановка диффузионного теста осуществлялась в соответствии ISO 20776-1-2010. Результаты измерений представлены в таблице 3.

Таким образом, штаммы ОХА 45 и ОХА 68 характеризуются стабильной устойчивостью к бета-лактамам и могут быть использованы в качестве контрольных при оценке чувствительности к антибиотикам с использованием градиентных диффузионных тестов.

Пример 3

Постановка диско-диффузионного теста. В работу были включены 10 клинических изолятов MSSA. Штаммы ОХА 45 и ОХА 68 использовались как контрольные (контроль резистентности) в 10 повторениях. Использовали диски с цефокситином со стандартной нагрузкой 30 мкг (bioMérieux, Франция). Использовали агар Мюллера-Хинтона (БиоРад, США). Постановка диско-диффузионного теста осуществлялась в соответствии ISO 20776-1-2010. Диапазон зон ингибиции роста вокруг диска с цефокситином для тестовых изолятов составляла 23-30 мм (среднее значение 24,5 мм). Диапазон зон ингибиции роста для штамма ОХА 68 составил 0-5 мм (среднее 0,5 мм), для штамма ОХА 45 диапазон значений был 22-24 мм (среднее 23,5 мм). Таким образом, штамм ОХА 68 характеризуется устойчивостью, поскольку среднее значение значительно меньше пограничного (22 мм).

Таким образом, штамм ОХА 68 характеризуются стабильной устойчивостью к цефокситину и может быть использован в качестве контрольной тест-культуры при оценке чувствительности диско-диффузионным методом. Штамм ОХА 45 характеризуется пограничным значением зон ингибиции роста.

Получение штаммов, их фенотипическая и генотипическая характеристика выполнялись в рамках выполнения проектов Российского Научного Фонда (проекты 18-75-10114 и 18-75-10114-П).

Литература

1. McDougal L.K., Thornsberry С.The role of beta-lactamase in staphylococcal resistance to penicillinase-resistant penicillins and cephalosporins // J Clin Microbiol. 1986. T. 23. №5. C. 832-9. doi 10.1128/jcm.23.5.832-839.1986.

2. Hryniewicz M.M., Garbacz K. Borderline oxacillin-resistant Staphylococcus aureus (BORSA) - a more common problem than expected? // J Med Microbiol. 2017. T. 66. №10. C. 1367-1373. doi 10.1099/jmm.0.000585.

3. Carvajal L.P., Rincon S., Echeverri A.M. et al. Novel Insights into the Classification of Staphylococcal beta-Lactamases in Relation to the Cefazolin Inoculum Effect // Antimicrob Agents Chemother. 2020. T. 64. №5. doi 10.1128/AAC.02511-19.

4. Giulieri S.G., Guerillot R., Kwong J.C. et al. Comprehensive Genomic Investigation of Adaptive Mutations Driving the Low-Level Oxacillin Resistance Phenotype in Staphylococcus aureus // mBio. 2020. Т. 11. №6. doi 10.1128/mBio.02882-20.

5. Nadarajah J., Lee M. J. S., Louie L. et al. Identification of different clonal complexes and diverse amino acid substitutions in penicillin-binding protein 2 (PBP2) associated with borderline oxacillin resistance in Canadian Staphylococcus aureus isolates // J Med Microbiol. 2006. T. 55. №Pt 12. C. 1675-1683. doi 10.1099/jmm.0.46700-0.

6. Ba X., Harrison E.M., Edwards G.F. et al. Novel mutations in penicillin-binding protein genes in clinical Staphylococcus aureus isolates that are methicillin resistant on susceptibility testing, but lack the mec gene // J Antimicrob Chemother. 2014. T. 69. №3. C. 594-7. doi 10.1093/jac/dkt418.

7. Speck S., Wenke C., Fessler A.T. et al. Borderline resistance to oxacillin in Staphylococcus aureus after treatment with sub-lethal sodium hypochlorite concentrations // Heliyon. 2020. T. 6. №6. C. e04070. doi 10.1016/j.heliyon.2020.e04070.

Изобретение относится к микробиологии. Предложен штамм Staphylococcus aureus OXA 45, характеризующийся mec-независимым механизмом резистентности к бета-лактамным антибиотикам и содержащий мутации в промоторной области pbp4. Указанный штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером В-9986. Также предложен штамм Staphylococcus aureus OXA 68, характеризующийся mec-независимым механизмом резистентности к бета-лактамным антибиотикам и содержащий мутации в pbp1, pbp2, gdpP. Указанный штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номерам В-9987. Штаммы могут быть использованы в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к бета-лактамным антибиотикам. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

1. Штамм Staphylococcus aureus OXA 45 характеризуется mec-независимым механизмом резистентности, содержащий мутации в промоторной области pbp4, к бета-лактамным антибиотикам и может быть использован в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к бета-лактамным антибиотикам, депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером В-9986.

2. Штамм Staphylococcus aureus OXA 68 характеризуется mec-независимым механизмом резистентности, содержащий мутации в pbp1, pbp2, gdpP, к бета-лактамным антибиотикам и может быть использован в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к бета-лактамным антибиотикам, депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номерам В-9987.