ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA ENTERICA SUBSP. ENTERICA SEROVAR NEWPORT B-9044 МЕЖДУНАРОДНОГО ПОЛИРЕЗИСТЕНТНОГО КЛОНА SALMONELLA NEWPORT MDR-AMPC/CMY-2, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЬНОГО ШТАММА ДЛЯ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ САЛЬМОНЕЛЛЕЗОВ Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/42 

Изобретение относится к микробиологии (бактериологии), а именно к разделу определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и молекулярной детекции механизмов резистентности, и может быть использовано в качестве контрольного штамма для контроля качества при диагностике сальмонеллезов: на этапах фенотипических исследований (определение чувствительности к антибиотикам, выявление устойчивости к цефалоспоринам, дифференциация бета-лактамаз расширенного спектра и AmpC-цефалоспориназ) и молекулярных исследований (определение механизма устойчивости к цефалоспоринам путем детекции гена bla_CMY-2; детекция плазмиды резистентности и изучение ее рестрикционного профиля).

В научной литературе описаны случаи выделения штаммов международного полирезистентного клона Salmonella Newport MDR-AmpC/CMY-2 в США и странах Европы, вызвавших спорадические случаи или «пищевые» вспышки сальмонеллеза, связанные с употреблением мясных продуктов. Такие штаммы характеризуются резистентностью ко многим классам антибиотиков (полирезистентность), устойчивостью к цефалоспоринам вследствие продукции AmpC-цефалоспориназы молекулярного семейства CMY-2 (кодируется геном bla_CMY-2), наличием плазмиды резистентности. Штаммы Salmonella Newport MDR-AmpC/CMY-2, выделенные в других странах, не могут быть ввезены и использованы в качестве контрольных штаммов при диагностике сальмонеллезов в РФ.

На территории РФ штаммы Salmonella enterica sbsp.enterica serovar Newport, относящиеся к международному полирезистентному клону Salmonella Newport MDR-AmpC/CMY-2 ранее не обнаружены, не изучены и не депонированы.

Диагностика сальмонеллезов должна сопровождаться контролем качества проводимых фенотипических и молекулярных исследований с использованием контрольных штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica с известной резистентностью к антибиотикам (в том числе к цефалоспоринам) и молекулярными механизмами устойчивости (в том числе продукция AmpC-цефалоспориназы молекулярного семейства CMY-2, ген bla_CMY-2).

Наиболее близкими по сущности к заявляемому изобретению являются полирезистентные штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Newport, выделенные и изученные во Франции, которые также устойчивы к цефалоспоринам вследствие продукции AmpC-цефалоспориназы молекулярного семейства CMY-2 и имеют плазмиды резистентности, как и штамм, предлагаемый в качестве изобретения (Egorova S, Timinouni М, Demartin М. et al (2008). Ceftriaxone-Resistant Salmonella enterica Serotype Newport, France. Emerging infectious diseases. 2008. Vol. 14: 954-7. doi: 10.3201/eid1406.071168). Однако эти штаммы не охарактеризованы по чувствительности к клоксациллину, что не позволяет использовать их для контроля качества фенотипической дифференциации бета-лактамаз расширенного спектра и AmpC-цефалоспориназ. Предлагаемый в качестве изобретения штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Newport B-9044 помогает преодолеть это ограничение, поскольку у него выявлена чувствительность к клоксациллину, что позволяет использовать его как контрольный штамм на этапе дифференциации бета-лактамаз расширенного спектра и AmpC-цефалоспориназ в рамках диагностики сальмонеллезов.

Изобретение направлено на разработку контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Newport международного полирезистентного клона Salmonella Newport MDR-AmpC/CMY-2, необходимого для обеспечения достоверной диагностики и эпидемиологического надзора за сальмонеллезами в РФ.

Авторами получен контрольный штамм для контроля качества различных этапов лабораторной диагностики сальмонеллезов: полирезистентный к антибиотикам, устойчивый к цефалоспоринам вследствие продукции AmpC-цефалоспориназы молекулярного семейства CMY-2 (кодируется геном bla_CMY-2), имеющий плазмиду резистентности группы несовместимости Inc А/С2 с рестрикционным профилем R1.

Заявляемый штамм выделен от больного острой кишечной инфекцией, идентифицирован до вида и серовара Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Newport бактериологическими и серологическими методами. Резистентность к антибиотикам установлена методами диско-диффузионным и градиентных концентраций; наличие и молекулярное семейство AmpC-цефалоспориназы CMY-2 определено при анализе данных полногеномного секвенирования штамма на приборе MiSeq (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США).

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-9044.

Характеристика штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Newport B-9044.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспорообразующие.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, 3 группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.

Культуральные свойства: хемоорганотроф, каталазоположительный, оксидозоотрицательный, растет на питательных средах (агар Эндо, висмут-сульфит-агар, гектоен-агар, XLD-arap, агар Плоскирева) при оптимальной температуре 37°С при рН 7,2, образуя характерные для бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica колонии.

Антигенная характеристика: по результатам серологического исследования штамм относится к группе O8 (С), серовару S. Newport и имеет антигенную формулу 6,8: e,h: 1,2

Основные свойства штамма:

1. Множественная устойчивость к антибиотикам (полирезистентность): ампициллину (минимальная подавляющая концентрация, МПК>128 мг/л), цефтазидиму (МПК>256 мг/л), цефотаксиму (МПК>32 мг/л), цефокситину (МПК>256 мг/л), тетрациклину (МПК>32 мг/л), хлорамфениколу (МПК>32 мг/л).

2. Чувствительность продуцируемой AmpC-цефалоспориназы молекулярного семейства CMY-2 к ингибитору клоксациллину.

3. Молекулярный механизм устойчивости к цефалоспоринам - продукция AmpC-цефалоспориназы молекулярного семейства CMY-2, наличие гена bla_CMY-2.

4. Наличие плазмиды группы несовместимости Inc А/С2 с рестрикционным профилем R1.

Стабильность свойств штамма Salmonella enterica sbsp.enterica serovar Newport B-9044 подтверждена путем повторного еженедельного тестирования штамма (хранящегося при -70°С в криосреде) в течение 6 мес. Стабильность значений МПК антибиотиков и чувствительность к клоксациллину проверяли методом градиентных концентраций с агаром Мюллера-Хинтон, дисков и полосок с антибиотиками различных производителей: Oxoid (Великобритания), BioRad (США), HiMedia (Индия) и НИЦФ (Россия). Штамм давал стабильные результаты на агарах, дисках и полосках всех производителей в течение всего срока тестирования. Стабильность молекулярных свойств подтверждена методом ПЦР с электрофоретической детекцией со специфическими праймерами (наличие гена bla_CMY-2) и путем выделения плазмиды резистентности методом щелочного лизиса с рестрикцией рестриктазой Pst1.

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Контроль качества определения чувствительности бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica к антибиотикам методом градиентной диффузии.

Тестирование проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Для исследуемых и контрольного штаммов готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия из суточных культур, выращенных на кровяном агаре (24 ч., +37°С). Засевали ватным стерильным тампоном на чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон (высотой 4 мм). На засеянный агар накладывали полоски с антибиотиками (в градиенте концентраций), инкубировали чашки 24 часа при +35°С. Учитывали значение МПК в месте пересечения эллипсовидной зоны задержки роста штамма с полоской. Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Newport B-9044 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты (допустимые колебания значений МПК в пределах 1 разведения) для ампициллина, цефтазидима, цефотаксима, цефокситина, тетрациклина, хлорамфеникола.

Пример 2. Контроль качества фенотипической дифференциации бета-лактамаз расширенного спектра и AmpC-цефалоспориназ. Дифференциацию бета-лактамаз расширенного спектра и AmpC-цефалоспориназ подтверждали согласно руководству Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам (EUCAST) по детекции механизмов резистентности, выявляя синергизм между цефалоспоринами и ингибиторами бета-лактамаз расширенного спектра (клавулановая кислота) и AmpC-цефалоспориназ (клоксациллин). Исследование проводили методом комбинированных дисков с набором реагентов "ESBL+AmpC Screen Kit" (Rosco Diagnostica, Дания). Для исследуемых и контрольного штаммов готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия из суточных культур, выращенных на кровяном агаре (24 ч, +37°С). Засевали ватным стерильным тампоном на чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон (высотой 4 мм). На засеянный агар накладывали таблетки, представленные в наборе. Инкубировали чашки 24 часа при +35°С. Учитывали результат, оценивая разницу в диаметрах зон задержки роста между «чистыми» цефалоспоринами и их комбинациями с ингибиторами. Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp.enterica serovar Newport B-9044 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: зона задержки роста вокруг комбинированной таблетки с клоксациллином на 8-10 мм превышала зону вокруг таблетки с «чистым» цефалоспорином. Результат свидетельствовал о чувствительности продуцируемой бета-лактамазы к ингибитору клоксациллину и принадлежности к АтрС-цефалоспориназам.

Пример 3. Контроль качества определения молекулярного механизма устойчивости к цефалоспоринам путем детекции гена bla_CMY-2.

Детекцию гена bla_CMY-2 проводили методом ПЦР с электрофоретической детекцией со специфичными праймерами (5'-CGAAGAGGCAATGACCAGAC-3' и 5'-ACGGACAGGGTTAGGATAGY-3'), используя амплификатор С1000 (BioRad). Выделение ДНК из исследуемых и контрольного штаммов проводили с использованием реагента InstaGen Matrix (BioRad). Готовили ПЦР-смесь (25 μl): «Taq М мастер-микс (зеленый)» (Алкор Био, РФ) - 12,5 μl; по 0,4 μl каждого праймера (стоковая концентрация 10 μМ); H₂O - до 24 μl общего объема смеси; ДНК - 1,0 μl. Условия ПЦР: начальная инкубация 15 мин. при 95°С; 25 циклов - денатурация 40 сек. при 94°С, отжиг 30 сек. при соответствующей 60°С, элонгация 72°С 10 сек. Амплифицированные фрагменты идентифицировали путем электрофореза в 0,5 X растворе ТВЕ, 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия при 120 V в течение 45 мин. Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp.enterica serovar Newport B-9044 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: размер амплифицированного фрагмента соответствовал ожидаемому (около 540 bp).

Пример 4. Контроль качества анализа рестрикционного профиля плазмид резистентности.

Плазмидную ДНК исследуемых и контрольного штаммов выделяли методом щелочного лизиса и подвергали рестрикции рестриктазой Pst1 (BioLabs) в течение 120 мин на водяной бане при 37°С. Для этого к 17 μl плазмидной ДНК добавляли 2 μl 10-кратного буфера Н и 1 μl рестриктазы (40 U/μl). Рестрикционные профили плазмид оценивали путем электорофореза в 1% агарозном геле при 30 V в течение 16 часов, сравнивая с supercoiled DNA ladder (Invitrogen, Groningen, Netherlands) и плазмидами pIP173 (125,8 kb), RP4 (56 kb) и Tp116 (210 kb), а также профилями известных плазмид штаммов международного полирезистентного клона Salmonella Newport MDR-AmpC/CMY-2 (Институт Пастера, Париж). Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp.enterica serovar Newport B-9044 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: рестрикционный профиль плазмиды соответствовал профилю R1.

Для обеспечения достоверной диагностики сальмонеллезов необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования. Предлагаемый штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Newport B-9044 обладает стабильными свойствами, позволяющими одновременно контролировать многочисленные исследования: фенотипические (определение чувствительности к антибиотикам, устойчивости к цефалоспоринам, дифференциации вида продуцируемой бета-лактамазы) и молекулярные (определение механизма устойчивости к цефалоспоринам путем детекции гена bla_CMY-2, детекция плазмиды резистентности и изучение ее рестрикционного профиля).

Изобретение относится к микробиологии. Предложен штамм Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport, относящийся к международному полирезистентному клону Salmonella Newport MDR-AmpC/CMY-2. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-9044. Штамм может быть использован в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике сальмонеллезов. 4 пр.

Штамм бактерий Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport международного полирезистентного клона Salmonella Newport MDR-AmpC/CMY-2, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-9044, используемый в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике сальмонеллезов.